Summary
Describimos una técnica para etiquetar las neuronas y sus procesos a través de anterógrada o retrógrada trazadores inyecciones en núcleos cerebrales utilizando una preparación in vitro. Hemos modificado un método existente de i n vitro electroporación trazador mediante el aprovechamiento de la etiqueta fluorescente mutantes de ratón y equipo óptico básica con el fin de aumentar la precisión de etiquetado.
Abstract
Se presenta una técnica que combina un protocolo de inyección vitro trazador en, que utiliza una serie de pulsos eléctricos y de presión para aumentar la absorción de colorante a través de la electroporación en explantes cerebrales con iluminación láser específica y que emparejan gafas de filtro durante el procedimiento. La técnica descrita de electroporación in vitro por sí mismo rendimientos relativamente buen control visual para que apuntan a ciertas áreas del cerebro. Al combinar con excitación láser de marcadores genéticos fluorescentes y su lectura a través de gafas de filtro de banda de paso, que puede recoger las emisiones de las marcadas genéticamente células / núcleos y el tinte de rastreo fluorescente, un investigador puede aumentar considerablemente la precisión de las inyecciones encontrando el área de interés y el control para el tinte de difusión / absorción en la zona de inyección de forma mucho más eficiente. Además, la técnica de iluminación láser permite estudiar la funcionalidad de un neurocircuit propuesta por provIding información sobre el tipo de neuronas que se proyectan a una cierta área en casos en que la expresión de GFP está relacionada con el tipo de transmisor expresada por una subpoblación de neuronas.
Introduction
Con el fin de definir un cierto (micro) circuito neuronal, hay que empezar por encontrar los diversos participantes de dicho circuito, y su patrón de conexión. Desde la publicación de Waller sobre neurofiber rastreo a través lesioning 1 una gran variedad de técnicas de rastreo neuroanatómicas ha sido establecida. Algunas de estas técnicas se pueden aplicar en el tejido fijado post mortem 2-4, otros se basan en el transporte activo del colorante en neuronas vivas, como descubierto en 1971 6.5. Este último puede subdividirse en dos grupos que discriminan entre los métodos que se aprovechan de retrógrado activo (a partir de la zona de inyección a la fuente de una proyección dada, es decir. La somata de las neuronas que se proyectan hacia dicha zona) y anterógrada activo (desde el inyectada área a la diana de una proyección dada, es decir. las proyecciones axonales y los terminales axonales de las neuronas marcadas) de transporte. También, en algunos casos tramaterial de cer se inyecta en animales vivos que luego sobreviven a la inyección por varios días o semanas (en inyecciones de trazadores vivo), mientras que en otros casos se inyectan cerebros explantadas e incubar durante varias horas después de la inyección en el líquido cefalorraquídeo artificial (in vitro inyecciones de trazadores) .
En este protocolo se modificó una existente en la técnica de electroporación in vitro 7.8 para etiquetar somata y procesos neuronal en anterógrada y retrógrada rastreo experimentos utilizando dextrano choleratoxin subunidad-b y tetrametilrodamina como las sustancias de rastreo. El objetivo general de este protocolo es proporcionar neurocientíficos con una herramienta eficiente para rastrear los patrones de conectividad neuronal entre los diferentes núcleos del cerebro, mientras que el aprovechamiento de líneas de ratones transgénicos disponibles y equipos ópticos básica con el fin de aumentar la precisión de la orientación durante las inyecciones de trazadores. Aunque el método de anterógrada y rastreo retrógrado utilizandocholeratoxin y la amina dextrano y sus respectivos conjugados marcados con fluorescencia no es NUEVO 9-13 (como es el método de electroporación, por ejemplo. Haas et al. 14), la combinación de las inyecciones de trazadores con la electroporación en una preparación in vitro que implica bloques de tejido cerebral es un desarrollo más reciente 7. Su principal ventaja sobre las técnicas de rastreo neuronales utilizando el mismo tipo de colorantes trazadores de animales vivos es la mayor intensidad de etiquetado, debido a la mayor eficiencia con la que el colorante a electroporación está siendo tomada por las neuronas. Una ventaja adicional es el período acortado de incubación (requerido para el transporte de colorante) y su mayor precisión de destino durante la inyección del marcador, porque el experimentador tiene el control visual sobre el área objetivo de la inyección. Este último también significa que no se requiere equipo caro estereotáctica para encontrar el área núcleo o el cerebro de interés.
Para adinalmente aumentar precisión de la focalización, nos aprovechamos de una línea de ratón transgénico, que expresa GFP en su subpoblación glicinérgica de neuronas 15 y equipos ópticos básicos que consisten en un puntero láser de mano de 405 nm gafas de filtro de longitud de onda y la congruencia de banda de paso (450 - 700 nm). De este modo, logramos un mayor aumento significativo en la precisión de la focalización mediante la identificación de la zona de inyección a través de su señal fluorescente y proporcionando una manera más fina para controlar la propagación de colorante dentro del área de inyección a través de la observación de la interacción entre la señal de GFP indígena y el trazador fluorescencia. Nuestra técnica también permite descubrir la funcionalidad de un circuito junto con su conectividad mediante la identificación de las neuronas inhibitorias GFP-positivas (o excitatorio en otras líneas de ratón) que se llena con el trazador.
En resumen, hemos mejorado aún más una poderosa herramienta neurocientífica para estudiar el conectoma del cerebro de los vertebrados y evaluar tque diferentes características neuroanatómicas de un neurocircuit dado. Mediante el uso de ratones transgénicos, junto con equipos ópticos de bajo costo y ampliamente disponible pudimos aumentar significativamente la precisión de la focalización de nuestras inyecciones. Además, los ratones transgénicos nos permitió identificar el tipo de las conexiones trazadas, lo que ayudó descubrir la funcionalidad de un microcircuito inhibitorio en el tronco cerebral auditivo.
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Protocol
1. Genotipado óptico
1. óptico Genotipado de Ratón cachorros
- Compruebe para la expresión de la respectiva marcador fluorescente usando un puntero de láser de la longitud de onda de excitación apropiada (405 nm en los experimentos descritos aquí) y los correspondientes filtros de gafas que bloquean la longitud de onda de excitación, pero que pasa a la longitud de onda de emisión (450 - 700 nm en los experimentos descritos aquí) . Apunte el puntero láser en la parte posterior de la cabeza o la médula espinal de las crías de ratón (ver Figura 1). Evite que brilla el láser en los ojos y la exposición prolongada de la piel a la luz láser.
2. óptico Genotipado de los animales más viejos
- Profundamente anestesiar el ratón (p14 edad de p138 en los experimentos descritos aquí) con una sobredosis de pentobarbital a través de una inyección intraperitoneal (120 mg / kg de peso corporal). Confirme la anestesia correcta comprobando los reflejos del animal (pellizcar brevemente la punta del XXe oído o una de las patas traseras para provocar el reflejo de retracción de la oreja o la pierna).
- Nota: A pesar de la utilización de una sobredosis de pentobarbital (120 mg / kg de peso corporal) nos referimos al proceso de inyección como "anestesia profunda" en lugar de la eutanasia, porque el animal es ideal sigue vivo (es decir, su corazón sigue latiendo), cuando el la cirugía y la perfusión comienzan. Esto asegura una perfusión más eficiente de los órganos internos, incluyendo el cerebro.
- Una vez que el animal no muestra ningún reflejos, retirar cuidadosamente la piel que recubre el cráneo (Figura 2A) al hacer una incisión en la piel que cubre la parte posterior de la cabeza y de corte a la sección media del cráneo. Exponer el cráneo al descubierto a la luz láser y observar la fluorescencia a través de las gafas de filtro como se describió anteriormente. Si se observa una señal de GFP positivo, continúe con el paso 2, si no es así, sacrificar al animal a través de la decapitación (segundos / garantizar forma de eutanasia siguiendo nuestraReglamentos IACUC).
Nota: En los ratones, incluso mayores (> 1 mes) la fluorescencia se puede observar a través de los ojos del animal.
2. transcardial perfusión y Preparación de cerebro
- Perfundir transcardially con enfriado con hielo salina tamponada con fosfato (PBS; NaCl: 137 mM, KCl: 2,7 mM, KH 2 PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4: 10 mM) usando una aguja de jeringa 30 G para eliminar en gran medida la sangre de el animal.
- En primer lugar, abrir con cuidado la caja torácica con tijeras afiladas y luego empujar la aguja en el ventrículo izquierdo del corazón. Iniciar el bombeo de la PBS en el corazón y la aorta e inmediatamente después de este paso abrir la aurícula derecha del corazón con las tijeras para permitir que la sangre salga del cuerpo. Nota: Perfusión toma 5 - 10 min, dependiendo del tamaño del animal.
- Después de desangramiento través de la perfusión, decapitar al animal, asegurar su cabeza con el pin needles (o 30 g agujas de jeringas) por la perforación a través de las cuencas de los ojos en un plato de preparación y retire el cerebro del cráneo.
- En primer lugar, utilizar tijeras afiladas para cortar la piel que recubre la calavera: hacer una pequeña incisión en la parte posterior de la cabeza, luego se corta a lo largo de la línea media en la cara dorsal de la cabeza, corte a los lados simplemente caudal de los ojos de los animales y por último corte en la dirección caudal para eliminar completamente el colgajos de piel en la parte posterior de la cabeza.
- A continuación, repita el mismo patrón de corte para el propio cráneo, asegúrese de retirar ambas cócleas en el proceso, porque esto va a simplificar significativamente la eliminación de la base del cerebro al final. Después de este procedimiento, la mitad caudal del cerebro mienta completamente expuesta.
- En el siguiente paso, utilizar una hoja de afeitar afilada o un escalpelo para cortar a través de todo el cerebro anterior con un ángulo de aproximadamente 45 ° y aproximadamente 2 mm rostral del cerebelo. Saque la mitad delantera separada del cerebro con abespátula ent.
- Utilice la espátula para elevar el caudal medio del cerebro en su extremo rostral y posteriormente cortar a través de los nervios craneales que todavía están conectados a la base del cerebro en su lado ventral. Como resultado final, el caudal medio del cerebro incluyendo el tronco cerebral debe caer libremente fuera el resto de la cabeza del animal preparado.
- Voltear la mitad caudal eliminado del cerebro para exponer su cara ventral y cortar a lo largo del plano coronal justo rostral (para las inyecciones anterógrada) o simplemente caudal (para las inyecciones retrógradas) de las ventral ubicadas "bombillas" que contienen el cuerpo trapezoide (ver paso 2.3).
- Siempre use una hoja de afeitar afilada o un escalpelo para el procedimiento de corte para minimizar la muerte celular causada por la tensión mecánica excesiva sobre el tejido. Como resultado final, debería haber sido obtenido un explante cerebral que abarca alrededor de 1 cm de longitud y que contiene el complejo olivar superior completa a lo largo de otras regiones del cerebro.
Nota: Este protocolo demuestra el procedimiento para una inyección de trazador en el cuerpo trapezoide situado en el tronco cerebral auditivo. Adaptar la ubicación y orientación de los planos de corte y sitios de inyección según sea necesario. Si las regiones del cerebro fluorescentes de interés se encuentran lo suficientemente cerca de la superficie del cerebro, de modo que puedan ser identificados y se inyectan sin cortar el cerebro (véase la Figura 2B), entonces la etapa de corte coronal puede ser omitido.
- Identificar el cuerpo trapezoide como dos "bombillas" prominentes ventrales contienen el núcleo ventral del cuerpo trapezoide (VNTB).
Nota: Para mayor referencia anatómica sobre la ubicación estereotáctica aproximada de estos planos de corte, consulte Franklin & Paxinos, 2008. Panel 78 del atlas, Bregma ~ -5,7 mm muestra el núcleo medial del cuerpo trapezoide (= MNTB) etiquetados como "Tz ". Panel 69 muestra el núcleo ventral de la bo trapezoidedy (VNTB) etiquetados como "MVPO" (núcleo periolivary medioventral) 19.
3. anterógrada / retrógrada Tracing
Nota: Realice todos los procedimientos siguientes a RT (25 ° C).
- Después de cortar, colocar el explante tronco cerebral en un plato preparado que contiene oxigenada (95% O 2, 5% 2 CO) disección solución (NaCl 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl2 1 mM, CaCl 2: 0,1 mM, glucosa : 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM), asegurándola con 30 g agujas de jeringas. Asegúrese de que el área de la inyección está hacia arriba.
- Tire pipetas de inyección de vidrio de borosilicato y llenarlos con una de las tres soluciones siguientes: a) una solución de 1,0 mg / ml de choleratoxin subunidad b conjugado a un Alexa fluoróforo 555 en PBS 12-13 (usado principalmente para el transporte retrógrado), b ) un 1% -dilution en 0,9% de solución salina de tetrametilrodamina dextrano 555 (3000 MW, que se utiliza principalmente para el transporte retrógrado) o c) una -dilution 1% en 0,9% de solución salina de 10.000 MW dextrano TRITC-555 (utilizado principalmente para el transporte anterógrado).
- Asegúrese de que las resistencias gama pipeta de inyección de 2,5 a 3,5 MOhm y que se fabrican en 3 - 4 ciclos de tracción. Para los experimentos descritos aquí, lograr esto mediante la selección de un algoritmo preprogramado tirando del tirador de pipeta.
- Iluminar el explante cerebro usando un puntero láser montado estáticamente de la longitud de onda apropiada (artículo Nº 2 en la Figura 3A; 405 nm de longitud de onda en los experimentos descritos aquí). Utilice el puntero láser como guía para las inyecciones, y apuntar el rayo láser hacia el núcleo o células de interés que se inyectan cerebro marcado con fluorescencia.
- Encuentra y observar la zona diana iluminada a través de un microscopio binocular mientras se usan las gafas de filtro compatibles (450 - 70Filtro de paso de banda 0 nm en los experimentos descritos aquí). Insertar el electrodo de inyección a través de la micromanipulador en el área de interés.
- Se inyecta la sustancia trazadora. Las inyecciones consisten en 2 - 10 pulsos de presión a 15 psi durante 50 mseg cada uno, utilizando un dispositivo de inyección a presión, dirigida perpendicular a la región de interés (ROI) dentro de la sección cerebro. Administrar cada impulso de presión a intervalos de 10 - 15 segundos para permitir que el colorante se extienda.
- En el caso de las inyecciones de tetrametilrodamina (TRITC), además, estimular eléctricamente para mejorar la absorción de colorante a través de la electroporación con el electrodo colocado en el área del cerebro de interés (MNTB y VNTB en los experimentos descritos aquí).
- Utilice 8 impulsos TTL de 8 voltios durante 50 ms con 50 mseg interpulse intervalos, impulsados por un estimulador y se amplifica a 55 V con una unidad de aislamiento de estimulación (artículos No. 7 y 9 en la Figura 3B). Utilice 10 - 20 repeticiones de este protocolo, administered lo largo de varios minutos 7,8. Asegúrese de conectar a tierra el electrodo correctamente - el cable de tierra se debe conectar a la solución del baño!
- Compruebe para el éxito de la inyección. Puesto que un trazador fluorescente con una longitud de onda de emisión más largo también está emitiendo una señal fluorescente tras la excitación láser con longitudes de onda más cortas, comprobar visualmente para la absorción de colorante / extendido en el área objetivo inyectado mientras ilumina la zona con el láser y observando a través de las gafas de filtro.
4. Incubación
- Después de la inyección, se incuban las brainstems en el fluido cerebroespinal artificial oxigenado (ACSF; NaCl: 125 mM, KCl: 2,5 mM, MgCl 2: 1 mM, CaCl 2: 2 mM, glucosa: 25 mM, NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, ácido ascórbico: 0,4 mM, myo-inositol: 3 mM, ácido pirúvico: 2 mM, burbujeado con 95% O 2 - 5% de CO 2) a temperatura ambiente (RT, 25 ° C) durante 1 - 4 horas, mientras queel colorante está siendo transportado. Burbuja la solución durante todo el período de incubación.
- Posteriormente, transferir los brainstems en 4% de paraformaldehído (PFA) disuelto en PBS (aproximadamente 100 ml;. PH 7 para la mezcla de PFA / PBS) y se incuban a 4 ° C para permitir la posterior a la fijación durante la noche (O / N).
5. Tejido rebanar y montaje
- El día siguiente, lavar el tronco cerebral tres veces en PBS (5 min para cada etapa de lavado), se cubre en 4% de agar y luego se corta en 50 - 80 micras rodajas gruesas en un vibratome. Rebanadas de montaje utilizando un medio de montaje en un portaobjetos de vidrio, y cubreobjetos.
- Opcionalmente, etiquetar las secciones con Nissl fluorescente para 25 min (por ejemplo azul Nissl en una dilución 1: 100 en AB medios de comunicación).
- Para preparar AB medios de comunicación, mezclar 250 ml de tampón fosfato 0,2 M (PB; 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml M NaCl 5, 15 ml 10% de Triton-X, 220 ml ddH 2 O y 5 g de albúmina de suero bovino.
- Precede y tener éxito la etapa de marcaje Nissl por 3 etapas de lavado en PBS (10 minutos cada uno).
Nota: En los casos en que las secciones más gruesas necesitan ser montados y analizados (en los experimentos descritos aquí esas rebanadas eran 100 - 500 micras de espesor para preservar conexiones axonales en distancias más grandes), la técnica se puede combinar con la compensación de los tejidos. Encontramos el ClearT2 12 tenga éxito 20. Cuando se incluye un paso de compensación de tejidos, realizarlo antes de montar las secciones.
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Representative Results
Las figuras 1 y 2 muestran como el puntero láser y gafas láser se puede utilizar para determinar el genotipo de forma rápida y económica animales positivos GFP de una camada. En los casos de los cachorros de ratón, la técnica se puede utilizar para identificar de forma no invasiva etiqueta GFP en los cerebros de los animales a través del cráneo y la piel suprayacente (Figura 1A - D). Fluorescencia emitida se puede ver a través de la piel y el cráneo de crías de ratón por lo menos hasta el día postnatal 3 (Figura 1C). El procedimiento se muestra en la Figura 1 para nuestra proteína verde fluorescente (GFP) marcado línea de ratón que expresa GFP en su glycinergic subpoblación de neuronas (GlyT2-GFP). En los animales de edad avanzada con cráneos más gruesos y la piel pigmentada, la etiqueta GFP muestra menos bien a través de la piel y el hueso, y por lo tanto la piel de la cabeza y / o cuello debe ser eliminado antes de la determinación del genotipo óptica (Figura 2A).
Después de la perfusiónanimales del cerebro se saca y se ilumina de nuevo para encontrar los núcleos marcados con fluorescencia de interés. Las estructuras luminosas que se encienden cerca de la superficie ventral del tronco cerebral en la Figura 2B son los dos núcleos ventral del cuerpo trapezoide, que hemos utilizado tanto como una guía y un objetivo para nuestros inyecciones de trazadores. Las figuras 4 y 5 muestran los resultados representativos de una inyección anterógrada en el núcleo ventral del cuerpo trapezoide (VNTB) utilizando dextrano tetrametilrodamina (TRITC;. Figura 4) y dos inyecciones retrógradas en el núcleo medial del cuerpo trapezoide (MNTB) usando choleratoxin subunidad B (CTB; Figuras 5A y B) y TRITC (Figuras 5C y D). Etiquetado axonal brillante que indica (en este caso inhibitoria) proyecciones de VNTB a MNTB se puede ver después de una inyección anterógrada en VNTB (Figura 4). Figuras 5A y 5C muestran una visión general sobre el sitiode inyección (MNTB) con el núcleo que contiene las células retrogradely marcados (VNTB) al lado de él. Las cifras muestran magnificado 5B y 5D imágenes de retrogradely etiquetados somata de células VNTB glicinérgicas en las mismas secciones como se muestra en la Figura 5A y 5C. Nótese cómo el rastreo retrógrado con CTB resulta en un patrón puntiforme más 12-13 (Figura 5B), mientras que las células VNTB retrogradely marcados con TRITC Mostrar A-Golgi como muy densa etiquetado 21 (Figura 5D).
Figura 1:. Optical Genotipado de GlyT2-GFP-positivo y GlyT2-GFP-negativos Ratones Los ratones GFP-positivas fueron fotografiados en (A) las condiciones de luz normales, (B) sobre la iluminación láser con un puntero láser 405 nm sin el efecto invernadero gafas de filtrado y (c)tras la iluminación láser con las gafas de protección láser y UV. Una señal de GFP fuerte es visible en la zona superior del cerebelo y el tronco cerebral. (D) Por el contrario, las crías GlyT2-GFP-negativos de la misma línea de ratón y la edad (p2) no muestran ninguna señal de fluorescencia en las mismas zonas ( posterior de la cabeza y la médula espinal). La luz láser azul se filtra con eficacia por las gafas.
Figura 2: Óptico Genotipado y un cerebro Explante Preparado. Cráneo (A) A p4 GlyT2-GFP de las crías de ratón se expone a la iluminación láser y la vista a través de gafas de filtrado de paso de banda. La GFP fluorescencia se puede observar a través del cráneo. (B) un explante de cerebro de la misma pup en un plato de preparación tras la iluminación con láser, como se ve a través de las gafas de filtrado. Axones glicinérgicas y núcleos cerebrales, tales como el núcleo ventral del cuerpo trapezoide (VNTB) pueden ser vistos como verestructuras brillantes Y cerca de la superficie del cerebro.
Figura 3: Resumen Durante un in vitro de inyección de presión y configuración electroporación. (A) 1: estereoscopio, 2: puntero láser montado (405 nm de longitud de onda), 3: cabezal de la platina con pipeta de inyección montado en un micromanipulador, 4: Plato preparado que contiene el explante cerebral, 5: un PC con software instalado MC Estímulo, 6: dispositivo de presión de inyección, conectada a la pipeta de inyección a través de tubos (B) 7:. estímulo unidad de aislamiento, 8: iluminador de alta intensidad, 9: estimulador. El estimulador está conectado al electrodo en la pipeta a través de la unidad de aislamiento estimulación y es impulsado por el PC.
Figura 4: Tracing anterógrada de conexiones inhibitorias de VNTB al medial Núcleo del Cuerpo Trapecio (MNTB). Se muestra una proyección máxima de una pila confocal tomada en un corte horizontal que abarca alrededor de 200 micras de profundidad en un cerebro despejado de un ratón p14 GlyT2-GFP. Después de un dextrano tetrametilrodamina (TRITC) inyección en la parte caudo-medial de la VNTB, brillantemente marcado conexiones axonales (y en algunos casos sus terminaciones terminales) de VNTB a MNTB se puede observar. Barra de escala: 200 m.
Figura 5:. Retrógrados Tracer inyecciones en MNTB Reveal Filled células glicinérgica en el VNTB Se muestran proyecciones de máxima de pilas confocal tomadas en cortes coronales de un p88 (A, B) y una p80 (C, D (que abarca más de aproximadamente 50 m.) ) ratón GlyT2-GFP. (A) Una visión general de un choleratoxin subunidad B (CTB) de la inyección en la parte medial de la MNTB. (B) células glicinérgica en la VNTB están llenos de CTB (puntos lagrimales rojo dentro de el somata celular) como resultado de la inyección se muestra en la Figura 5A. Algunos de los puntos lagrimales aparecen fuera de las células, lo que podría ser indicativos de otros tipos de células GFP-negativo (no glycinergic) en el VNTB ser llenado, así (a causa de fibras lesionadas de paso en la zona de la inyección, por ejemplo) . (C) Otra visión general de una inyección TRITC retrógrada dirigidas a la MNTB. Nota, cómo se llena un número de células con TRITC en el MNTB después de la electroporación (en contraposición a la CTB puramente presión inyectado en la Figura 5A). (D) marcado retrógrado de células VNTB glicinérgicas después de una inyección TRITC en el MNTB (misma inyección como se muestra en la Figura 5C). La mayoría de las células muestran una densa etiquetado amarilla o naranja, por la mezcla de dos señales fluorescentes (la expresión de GFP indígena y el llenado con el TRITC rojo). Comparar con un celular GFP-positivo que por alguna razónno aceptar el colorante (flecha azul) y una célula-GFP negativo trazador marcado aparece profundamente rojo y posiblemente lleno, debido a una lesión axonal en la zona de inyección (flecha roja). Tenga en cuenta el diferente patrón de tinción de somata celular en inyecciones trazador retrógrado utilizando CTB (Figura 5B) y TRITC (Figura 5D). Las barras de escala: Las figuras 5A y 5C: 200 m, figuras 5B y 5D: 20 micras.
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Discussion
Una fuerza general de la electroporación in vitro trazador, a diferencia de los estudios in vivo de rastreo, es que se da a los investigadores un mejor acceso a la zona del cerebro de interés y por lo tanto, no implica estereotáctica caro (y, a menudo electrofisiológico) equipo. Además, el período de supervivencia necesario para los explantes cerebrales se extiende sólo unas pocas horas (1 - 4) en lugar de días o incluso semanas en el caso de in vivo inyecciones de trazador (ver una revisión detallada sobre el uso de aminas de dextrano y otros trazadores en en inyecciones in vivo por Lanciego y Wouterlood, 2,011 22, sino también Rodríguez-Contreras, et al., 2008 23), de modo que las inyecciones sin éxito pueden ser detectados tan pronto como durante el procedimiento de inyección o, a más tardar, en el día siguiente, así que los parámetros de inyección se pueden ajustar en consecuencia. El corto período de supervivencia para los explantes cerebrales también significa que por lo general hay una diferencia más pequeña entre las etiquetas <em> efectiva (área, donde el tinte fue tomada por las neuronas en anterógrada o terminales axonales en inyecciones retrógradas) y la aparente (área donde el colorante derramado, sin ser tomado) lugar de la inyección, aunque esta diferencia nunca puede descartarse por completo y sólo se puede cuantificar / controlada para la post-hoc, que en algunos casos puede ser completamente imposible (véase Albrecht et al., 2014 para una discusión más detallada 24).
Cabe señalar, que las conexiones de prácticamente cualquier longitud se pueden estudiar con este método, siempre y cuando el experimentador es capaz de preservar tanto la zona de inyección y su objetivo o fuente de área de proyecciones axonales en una sola pieza de tejido cerebral. La visualización de este tipo de conexiones se puede lograr a través de cualquiera de reconstrucción de pilas confocal imagen adquiridos después de cortar y montar el cerebro (como se describe aquí) o todo el cerebro / técnicas de imagen losa cerebrales después de ejecutar tejido transparenteprotocolos de ING (véase la sección 5 de este protocolo para un ejemplo).
La principal ventaja de nuestra técnica de guiado por láser en la electroporación in vitro es el aumento significativo de la precisión de la focalización durante las inyecciones de trazadores. El método original de electroporación in vitro se basa en el control visual simplemente apuntando a ciertos marcadores topográficos o utilizarlos como guías aproximadas para el área de la inyección. Lo mismo es cierto para la propagación de tinte en el área objetivo: se puede observar el tinte difusión, pero no es fácil de controlar la propagación de tinte de una manera más fina. Con la modificación de láser de este método, un investigador puede encontrar fácilmente los núcleos y células de interés y observar la propagación colorante en la población núcleo / célula de interés a través de la interacción de la fluorescencia impulsado genéticamente indígena y la fluorescencia del colorante. Por lo tanto, un investigador obtiene un mayor control sobre su / su experimento trazado al minimizar los falsos positivos en antero o retrógradarellenos, porque células / terminales axonales fuera del núcleo / área de interés se llenaron durante la inyección, también. Obviamente, esto no significa un control absoluto sobre el sitio de la inyección efectiva, que, como se mencionó anteriormente, puede variar desde el sitio aparente. Una advertencia de esta técnica es, obviamente, la disponibilidad de organismos modificados genéticamente. Los ratones son un organismo modelo genético ampliamente utilizado en estudios de mamífero, que también es cierto para el campo auditivo, pero algunos modelos de mamíferos podrían considerarse mejor, ya que se asemejan el audiograma humana con mayor precisión. Por lo tanto, otras técnicas pueden emplearse para etiquetar poblaciones neuronales en los animales de tipo salvaje de otras especies más adecuados para un determinado tipo de campo de investigación (por ejemplo, jerbos o chinchillas en los estudios del sistema auditivo 25-28): esto podría incluir inyecciones virales aprovechando ciertos promotores dirigidas sólo ciertos compartimentos del cerebro y expresando FLUORESCmarcadores tes en sólo un subconjunto de las células cerebrales. Naturalmente, un cuidado especial debe ser tomado para garantizar la validez de las construcciones genéticas expresadas en la subpoblación derecho de neuronas, no importa si esas construcciones se expresan de forma viral en animales de tipo salvaje o autóctono en knock-in líneas de ratón.
Como se señaló anteriormente, la ventaja de los mutantes de ratón que expresan proteínas fluorescentes en ciertas subpoblaciones de neuronas también permite la caracterización funcional de los circuitos del cerebro (en nuestro caso, hemos sido capaces de caracterizar las proyecciones inhibidoras de un núcleo del tronco encefálico a otro 24 por visualización pura de los resultados de nuestros experimentos de rastreo). Una vez más, la validez de las construcciones genéticas expresadas deben ser confirmadas antes de que cualquier interpretación de los resultados de los experimentos de rastreo puede tener lugar.
Otra fuerza general de la electroporación in vitro es su compatibilidad con OTHmétodos anatómicos er, tales como (inmuno) histoquímica y la limpieza del cerebro. Como se ha demostrado previamente 24, no se ve afectada por la aplicación de técnicas de tinción adicionales, tales como Nissl, o un método de compensación cerebro llamada ClearT2 12 20,24. El gran inconveniente de que hay que tener en cuenta es que la profundidad de penetración de Nissl y las manchas de anticuerpos disminuye a medida que aumenta el espesor del tejido, por lo que uno tiene que sopesar las opciones de preservación proceso axonal en rebanadas gruesas en comparación con intensidad de señal de adicional (inmuno) histoquímica tinción en experimentos en los que se necesitan ambos métodos de etiquetado anatómicas. Por supuesto, otro factor a considerar es la excitación / emisión de separación de ancho de banda de los diferentes marcadores fluorescentes, ya que el número mínimo de etiquetas comienza a las tres marcadores en este punto (expresión de la proteína fluorescente indígena, trazador y etiquetado Nissl / anticuerpo).
Obviamente, nuestro método descrito puede ampliarse parainyecciones de cualquier tipo de marcadores fluorescentes (incluyendo los granos cuánticos) en explantes cerebrales o incluso cortes de cerebro de ratones transgénicos. Dado que la exactitud de la inyección depende tanto, una detección clara de destino (la observación de la etiqueta fluorescente núcleos y células) y un control más preciso sobre el derrame del colorante fluorescente, sólo uno de estos dos factores deben ser suficientes para aumentar la precisión de la inyección, incluso cuando el otro es ausente. Esto significa que diferentes marcadores no fluorescentes (como constructos virales u otros vectores de ADN / ARN) pueden ser inyectados con mayor precisión en núcleos cerebrales de interés, siempre y cuando los núcleos de destino son claramente visibles para el experimentador. Esta última aplicación es particularmente interesante, porque la electroporación no permitir la captación eficaz de material de ADN, así 29-30 de, por lo que nuestro método casi ideal para este tipo de inyecciones. El único inconveniente de que debe tenerse en cuenta es que las construcciones de ADN se toman el tiempo para expresar y el problema de ti en vivosurge la preservación DICIÓN. Esto podría superarse mediante el establecimiento de cultivos de cortes de cerebro organotípicos 31-32 basado en rodajas inyectados cerebrales (o bloques de tejido cerebral re-rodajas), que permiten la conservación del tejido vivo del orden de semanas.
Y, por supuesto otros mutantes de ratones transgénicos se pueden utilizar para investigar la conectividad de los otros tipos neuronales como las neuronas colinérgicas (por ejemplo, en ChAT-GFP ratones 33), por lo que este método una herramienta versátil para estudiar la conectividad y la funcionalidad de (micro) circuitos cerebrales.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Apoyado por el NIH / NIDCD R01 DC experimentos 011582. Imaging se realizaron en la Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus Advanced Light Microscopy Core apoyado en parte por el NIH / CNRR Colorado CTSI subvención Número de UL1 RR025780 y los Trastornos de las Montañas Rocosas Neurlogical Core Center Subvención NIH P30NS048154. El Dr. Sascha du Lac, del Instituto Salk nos proporcionó los ratones GlyT2-GFP.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
