Summary
Biz bir in vitro hazırlık kullanarak beyin çekirdekleri içine anterograd veya retrograd tracer enjeksiyonları yoluyla nöronlar ve süreçlerini etiketlemek için bir teknik açıklar. Biz i n markalama doğruluğunu artırmak amacıyla bir avantaj floresan işaretli fare mutantları ve temel optik donanım alarak izleyici elektroporasyon vitro varolan yöntemi değiştirilebilir.
Abstract
Biz işlem sırasında hedeflenen lazer aydınlatma ve uygun filtre gözlük ile beyin eksplantlarında elektroporasyon yoluyla boya alımını artırmak için elektrikli ve basınç darbeleri bir dizi kullanan bir in vitro izleyici enjeksiyon protokolü, birleştiren bir teknik sunuyoruz. Kendisi ile in vitro elektroporasyon tarif edilen teknik Beynin belirli bölgeleri, hedefleme için nispeten iyi bir görsel kontrol elde edilir. Lazer floresan genetik belirteçlerin uyarma ve onların okuma-out bant-geçen filtre gözlüğü aracılığıyla, genetik olarak etiketlenmiş hücre / çekirdekler ve floresan izleme boya emisyonlarını pick up hangi bir araştırmacı ölçüde enjeksiyon doğruluğunu artırabilir ile birleştirerek ilgi alanı bulma ve çok daha verimli enjeksiyon alanında boya yayılmış / alımı için kontrol ederek. Buna ek olarak, lazer aydınlatma tekniği ata, belirli bir neurocircuit işlevselliğini çalışma sağlarGFP tanımı, nöron bir alt tarafından ifade edilen verici tipine bağlı olduğu durumlarda, belirli bir alana uzanan nöronların türü hakkında bilgi iding.
Introduction
Belirli bir nöronal (mikro) devreyi tanımlamak için, dedi biri devre ve bunların bağlantı desen çeşitli katılımcıları bularak başlamalıdır. Hiç hasarının 1 ile nöroanatomik izleme tekniklerinin büyük bir çeşitlilik izleme neurofiber hakkında Waller'ın yayın kurulduktan bu yana. 1971 5-6 keşfedilen Bu tekniklerden bazıları, sabit bir doku otopsi 2-4 uygulanabilir, diğerleri, canlı nöronlar boyanın aktif taşıma dayanır. İkincisi daha (belirli bir projeksiyon kaynağına, yani enjekte alandan. Alan bahsedilen çıkıntılı olan nöronların somata) Aktif retrograd yararlanarak yöntemleri arasındaki ayrım iki gruba ayrılabilir ve aktif anterograde (enjekte itibaren Belirli bir projeksiyon hedefinin, yani. akson projeksiyonları ve etiketli nöronlar) ulaşım aksonal terminallerine alanı. Ayrıca, bazı durumlarda, tracer malzemesi daha sonra, diğer durumlarda eksplante beyinleri enjekte edilir ise, (in vivo tracer enjeksiyonları) birçok gün veya hafta enjeksiyon hayatta kalmak ve yapay serebrospinal akışkan içinde enjeksiyondan sonra birkaç saat süreyle inkübe canlı hayvan içine enjekte edilir (in vitro iz enjeksiyonları) .
Bu protokolde vitro elektroporasyon tekniği 7-8 mevcut bir izleme maddeler olarak choleratoxin alt birimi-b ve tetrametilrodamin dekstran kullanarak anterograd ve retrograd izleme deneylerinde nöronal somata ve süreçleri etiketlemek için güncellenmiştir. Bu protokolün genel amacı izli enjeksiyonlar sırasında hedefleme hassasiyetini artırmak amacıyla mevcut transgenik fare hatları ve temel optik cihazlar yararlanarak, farklı beyin çekirdekleri arasındaki nöronal bağlantı desenleri iz etkin bir araç ile sinirbilimcileri sağlamaktır. Anterograd ve retrograd izleme yöntemi kullanılarak rağmencholeratoxin dekstran amin ve ilgili floresan etiketli eşlenikler 9-13 yeni değildir (örneğin. Haas ve arkadaşları elektroporasyon gibi bir yöntem olduğu için. 14), beyin dokusu bloklarını ihtiva eden bir in vitro hazırlama elektroporasyon tracer enjeksiyonu kombinasyonunun Daha yeni bir gelişme 7'dir. Canlı hayvanların tracer boyalar aynı tip kullanılarak nöronal izleme teknikleri esas avantajı, çünkü elektropore boya nöronlar tarafından alınır olarak hangi daha yüksek verimlilik, artmış etiketleme yoğunluğudur. Deneyci enjeksiyon ilgili hedef alanı üzerinde bir görsel kontrol, çünkü ek bir avantajı, izleyici enjeksiyon sırasında (boya nakil için gerekli) kısaltılmış inkübasyon süresi ve artan hedef doğruluğudur. İkincisi de pahalı stereotaktik ekipman ilgi çekirdeği veya beyin alanı bulmak için gerekli olduğu anlamına gelir.
Addin içinduğunda biz 405 nm dalga boyu ve eşleştirme band geçiren filtre gözlük bir el lazer pointer (450 oluşan nöronlar 15 ve temel optik donanımın glycinergic alt popülasyonunda GFP ifade transgenik fare hattı, yararlandı, doğruluk hedefleme artış - 700 nm). Böylece, onun floresan sinyali ile enjeksiyon alanını belirleyerek doğruluğu hedef ve yerli GFP sinyal ve izleyici arasındaki etkileşimin gözlem yoluyla enjeksiyon alanı içinde boya yayılması kontrol etmek için daha ince bir yol sağlayarak önemli bir başka artış elde ışık vermiştir. Bizim teknik aynı zamanda izleyici ile doldurulmuştur (diğer fare hatları ya da eksitatör) onun GFP pozitif inhibitör nöronları belirleyerek bağlantısı ile birlikte devrenin işlevselliğini ortaya çıkarmak için izin verir.
Özetle, biz daha omurgalı beynin connectome incelemek ve değerlendirmek için t güçlü nörobilimsel araç gelişmişO belirli bir neurocircuit farklı nöroanatomik özellikleri. Ucuz ve yaygın olarak kullanılan optik cihazlar ile birlikte transgenik fareler kullanarak önemli ölçüde bizim enjeksiyonları hedef doğruluğunu artırmak için başardık. Ayrıca, transgenik fareler işitsel beyinsapı bir inhibitör mikrodevre işlevselliğini ortaya çıkarılması yardımcı takip bağlantıları, tipini belirlemek için bize izin verdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Optik Genotiplemesi
Fare Pups 1. Optik Genotiplemesi
- Uygun uyarım dalga boyunda bir lazer işaretleyici kullanılarak ilgili floresan markör ekspresyon için kontrol (burada tarif edilen deneylerde 405 nm) ve dalgaboyu bloke filtre gözlük karşılık gelen, ancak emisyon dalga boyu geçen (450 - Burada tarif edilen deneylerde 700 nm) . Baş ya da fare yavru omurilik arka lazer imlecini (bakınız Şekil 1). Gözleri ve lazer ışığına cildin uzun pozlama içine lazer parlayan kaçının.
Yaşlı Hayvanları 2. Optik Genotiplemesi
- Derin bir intraperitoneal enjeksiyon (120 mg / kg vücut ağırlığı) ile yüksek dozda pentobarbital (burada tarif edilen deneylerde p138 yaş arasındaki p14) fare anestezi. Hayvanın refleksleri kontrol ederek uygun anestezi onaylayın (kısaca th ucu çimdike kulak veya arka ayakları bir kulak veya bacak) geri çekilme refleksi ortaya çıkarmak için.
- Not: Hayvan hala ideal (yani onun kalbi hala atıyor) hayatta olduğu için pentobarbital (120 mg / kg vücut ağırlığı) aşırı dozda kullanılmasına rağmen biz, yerine ötenazi "derin anestezi" olarak enjeksiyon prosedürü bakın ne zaman cerrahi ve perfüzyon başlar. Bu beyin de dahil olmak üzere, iç organlar, daha etkili bir perfüzyon sağlamaktadır.
- Hayvan herhangi refleksleri görünmüyor kez dikkatlice başın arkasını kaplayan deride bir kesi yapmak ve kafatasının Midsection keserek kafatası (Şekil 2A) örten cilt kaldırmak. Lazer ışığına çıkarılan kafatası maruz ve yukarıda açıklandığı gibi filtre gözlüğü ile floresan gözlemleyin. Olumlu bir GFP sinyali görülürse, aşağıdaki ötenazi formu sağlanması / kesilerek yoluyla hayvan kurban değilse ikinci (2. adıma geçin bizimIACUC düzenlemeler).
Not: floresan hayvan gözüyle görülebilir (> 1 ay) hatta eski Farelerde.
2. Transcardial Perfüzyon ve Beyin Hazırlık
- Buz soğukluğunda fosfat tamponlu tuzlu su ile transkardiyal serpmek, büyük ölçüde kan ayrılması için bir 30 G iğne kullanılarak şırınga (PBS NaCl: 10 mM 137 mM, KCl: 2.7 mM, KH 2 PO 4: 1,76 mM, Na 2 HPO 4) hayvan.
- İlk olarak, dikkatli bir şekilde keskin bir makas ile göğüs kafesi açmak ve ardından kalbin sol ventrikül içine iğne itin. Kalp ve aort içine PBS pompalama ve hemen bu adımı vücudu çıkmak için kan izin makas ile kalbin sağ atrium açmak için aşağıdaki başlayın. Not: Perfüzyon 5 sürüyor - hayvanın büyüklüğüne bağlı olarak 10 dk.
- Perfüzyon yoluyla kan kaybından sonra, hayvan başını kesmek pin n başını sabitlemekeedles (veya 30 G şırınga iğneleri) hazırlık tabağına göz çukurları aracılığıyla piercing ve kafatası beyin kaldırmak tarafından.
- İlk olarak, kafatası kaplanacağı cilt kesmek için keskin bir makas kullanın: Başın arka tarafında küçük bir kesi yapmak, o zaman sadece kaudal hayvanın gözlerinin kenarlarına kesilmiş, kafa sırt tarafında orta hat boyunca kesilir ve kaudal yönde son olarak kesim tamamen başın arka kısmında derinin kapaklarını kaldırın.
- Bu anlamlı sonunda beyin sapının kaldırılmasını kolaylaştırmak çünkü Ardından, kafatası kendisi için aynı kesme desen tekrarlamak, süreç içinde hem cochleas kaldırmak için emin olun. Bu işlemden sonra beyindeki kaudal yarısı tamamen açığa yalan gerekir.
- Bir sonraki adımda, beyincik ila yaklaşık 45 ° ve yaklaşık 2 mm rostral bir açıyla bütün ön beyin kesmek için keskin bir tıraş bıçağı veya neşter kullanmak. Ab ile beynin ayrılmış ön yarısını oymakent spatula.
- Onun rostral sonunda beynin kuyruk yarısını yükseltmek ve daha sonra hala ventral tarafta beyin sapına bağlı kranial sinirlerin kesmek için spatula kullanın. Bir sonuç olarak, beyin sapı da dahil olmak üzere beynin kaudal yarısı hayvanlar için hazırlanmış kafasının geri kalanı kapalı özgürce düşmek gerekir.
- Ventral tarafı ortaya çıkarmak için beynin kaldırıldı kuyruk yarısını çevirin ve yamuk gövdesini içeren ventral bulunan "ampuller" nin (anterograd enjeksiyon için) sadece rostral koronal düzlem boyunca kesme veya (retrograd enjeksiyon için) sadece kaudal (bkz adım 2.3).
- Daima doku üzerinde aşırı mekanik strese bağlı hücre ölümü en aza indirmek için kesme işlemi için keskin bir jilet veya neşter kullanın. Bir uç Sonuç olarak, uzunluk olarak yaklaşık 1 cm kapsayan ve diğer beyin bölgeleri boyunca tam bir üstün bir bağlantı nipeli kompleksi içeren bir beyin eksplant elde edilmiş olmalıdır.
Not: Bu protokol işitsel beyin sapı bulunan yamuk vücuda bir izleyici enjeksiyon için prosedürü gösterir. Gerektiği gibi kesme düzlemleri ve enjeksiyon siteleri yerini ve yönünü uyarlayın. Onlar tespit ve beyin kesmeden enjekte edilebilir ve böylece beyin yüzeyine yakın ilgi yalan, bir floresan beyin bölgelerinin (Şekil 2B bakınız), daha sonra koronal kesim aşaması atlanabilir.
- Yamuk gövdesinin (VNTB) ventral çekirdeğini içeren iki ventral tanınmış "ampuller" olarak yamuk gövdesini tanımlayın.
Not: Bu kesim uçakların yaklaşık stereotaktik konumu ile ilgili ayrıntılı anatomik başvuru için mm Tz "olarak etiketlenmiş yamuk vücudun (= MNTB) medial çekirdeğini gösterir Bregma ~ -5,7 atlas Franklin & Paxinos, 2008. Panel 78 bkz ". Panel 69 Yamuk bo ventral çekirdeğini göstermektedir"MVPO" (medioventral periolivary çekirdek) 19 olarak adlandırılan dy (VNTB).
3. İleriye / Retrograd Takip
Not: RT (25 ° C) aşağıdaki prosedürleri uygulayın.
- 125 mM, KCI: 2.5 mM, MgCI2: 1 mM, CaCl2 0.1 mM, glukoz kesilmesinden sonra, (% 95 O2,% 5 CO2) kesme çözeltisi (NaCl oksijenli içeren bir preparat çanak beyin sapı eksplant yer : 25 mM NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, askorbik asit; 0,4 mM, miyo-inositol: 3 mM, piruvik asit: 2 mM), 30 G şırınga iğneleri ile güvence altına alınmıştır. Enjeksiyon alanı yukarı baktığından emin olun.
- Borosilikat cam enjeksiyon pipetler çekin ve aşağıdaki üç çözümlerden biri onları doldurmak: choleratoxin altbirim-b PBS 12-13 bir Alexa florofora 555 konjuge (özellikle retrograd taşınması için kullanılan), b a) 1.0 mg / ml solüsyon ) bir% 1 -d10,000 MA dekstran-TRITC 555% 0.9 tuzlu su içinde dekstran (esas olarak geriye doğru taşınması için kullanılan 3000 MW) tetrametilrodamin 555 ya da c) bir% 1 -dilution% 0.9 tuzlu su içinde ilution (esas olarak) ileriye taşıma için de kullanılır.
- 4 çekerek döngüsü - 2.5 ila 3.5 MOhm ve onlar 3 üretilmektedir o enjeksiyon pipet dirençleri aralığı olun. Burada tarif edilen deneyler için, pipet çektirmesi üzerine önceden programlanmış çekerek algoritması seçerek bunu başarmak.
- Uygun dalga boyunda bir statik monte lazer pointer kullanarak beyin eksplant Aydınlatmak (Şekil 3A öğe No 2, burada açıklanan deneylerde 405 nm dalga boyu). Enjeksiyonlar için bir rehber olarak lazer pointer kullanın ve floresan etiketli beyin çekirdeğinde veya enjekte edilecek faiz hücreleri lazer ışınını hedefliyoruz.
- 70 - uyumlu filtre gözlük (450 giyerek bulun ve binoküler mikroskop aracılığıyla aydınlatılmış hedef alan gözlemlemekBurada tarif edilen deneyler) 'de 0 nm bant-geçiş filtresi. Ilgi alanına mikromanipülatör yoluyla enjeksiyon elektrodu yerleştirin.
- Izleyici madde enjekte edilir. Beyin bölümünde faiz (ROI) bölgeye dik yönlendirilmiş bir basınçlı enjeksiyon cihazı kullanarak, 50 milisaniye her 15 psi basınç darbeleri 10 - enjeksiyonları 2 oluşur. Boya yaymak için izin vermek için 15 sn - 10 aralıklarla her basınç darbesi yönetin.
- Tetrametilrodamin (TRITC) enjeksiyonları halinde, ilave olarak (burada tarif edilen deneylerde MNTB ve VNTB) ilgi beyin bölgesine yerleştirilmiş elektrot ile elektroporasyon yoluyla boya alımı arttırmak için elektriksel olarak teşvik eder.
- Bir stimülasyon yalıtım birimi (Şekil 3B'de ürün No 7 ve 9), 55 V bir uyarıcısı tarafından tahrik edilir ve amplifiye aralıklarla strok arası 50 ms, 50 milisaniye boyunca 8 volt 8 TTL palslarının kullanın. Bu protokol, 20 olan idari tekrarlar - 10 kullanınBirkaç dakika 7,8 üzerinde Gürler. Düzgün elektrot toprağa emin olun - topraklama kablosu banyo solüsyonu bağlı olmalıdır!
- Enjeksiyon başarısı için kontrol edin. Uzun bir emisyon dalga boyu floresan izleyici de kısa dalga boylarına sahip lazer uyarma üzerine bir floresan sinyal yayan olduğundan, görsel lazerle bölgeyi aydınlatan ve filtre gözlük aracılığıyla gözlemlerken enjekte hedef alan yayılmış boya alımı / kontrol edin.
4. Kuluçka
- Enjeksiyondan sonra, oksijenli yapay beyin omurilik sıvısında (ACSF brainstems inkübe; NaCI: 125 mM KCI: 2.5 mM, MgCI2: 1 mM CaCl2: 2 mM, glikoz: 25 mM NaH 2 PO 4: 1,25 mM, NaHCO 3: 25 mM, askorbik asit; 0,4 mM, miyo-inositol: 3 mM, piruvik asit: 2 mM, 95% O 2 ile kabarmış - Oda sıcaklığında,% 5 CO2), 1 (RT, 25 ° C) - 4 saat ikenboya taşınan ediliyor. Kabarcık tüm kuluçka döneminde çözüm.
- Gece boyunca (O / N) sonrası sabitleşmesi için 4 ° C sıcaklıkta tekrar ve inkübe (PFA / PBS karışımı pH 7. Yaklaşık 100 mi) daha sonra, PBS içinde çözülmüş% 4 paraformaldehit (PFA) brainstems aktarın.
5. Doku Dilimleme ve Montaj
- Ertesi gün, PBS Beyin Sapı (her yıkama basamağı için 5 dakika) üç defa yıkamak,% 4 agar kapsayacak ve daha sonra 50 oyulmuş - bir vibratome üzerinde 80 mikron kalınlığında dilimler. Bir bardak slayt ve lamel bir montaj orta kullanarak Dağı dilimleri.
- İsteğe bağlı olarak, (: AB medyada 100 seyreltme 1 örneğin mavi Nissl) 25 dakika floresan Nissl ile bölümleri etiket.
- AB ortamı hazırlamak 0,2 M fosfat tamponu 250 ml karıştırın (PB, 51 mM KH 2 PO 4, 150 mM Na 2 HPO 4), 15 ml 5 M NaCI, 15 ml% 10'luk Triton-X 220 mi GKD 2 O ve 5 g sığır serum albümin.
- Precede PBS içinde 3 yıkama adımlarla Nissl etiketleme adım (10 dakika her) başarılı ve.
Not: kalın bölümler monte analiz edilmesi gerektiği durumlarda (örneğin dilim Burada tarif edilen deneylerde 100 idi - büyük mesafelerde aksonal bağlantıları korumak için kalınlıkta 500 mikron), doku temizleme tekniği ile kombine edilebilir. Biz ClearT2 12 20 başarılı bulundu. Bir doku temizleme aşaması dahil edildiğinde, bölümleri monte etmeden önce bunu gerçekleştirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lazer pointer ve lazer gözlüğü hızlı ve ucuz bir çöp GFP pozitif hayvanlar genotiplemesi için nasıl kullanılabileceğini 1 ve 2 gösteri rakamlar. Genç yavrular fare durumlarda, tekniğin invaziv olmayan kafatası ve üstteki derinin (- D Şekil 1A) boyunca hayvanın beyninde GFP etiketi tanımlamak için kullanılabilir. Yayılan floresan en azından yukarı doğum sonrası 3. günde (Şekil 1C) ile deri ve fare yavrular kafatası yoluyla görülebilir. Prosedürümüz yeşil floresan proteini (GFP) için Şekil 1 'de gösterilmiştir nöronların onun glycinergic alt popülasyonunda (GlyT2-GFP) GFP ifadesi fare hattı etiketli. Kalın kafatasları ve pigmentli deri ile yaşlı hayvanlarda ise, GFP etiketi deri ve kemiğin içinden daha az gösterir ve bu nedenle baş ve / veya boyun cilt optik genotipleme (Şekil 2A) önce kaldırılması gerekiyor.
Perfüzyon sonrahayvan beyni dışarı alınır ve ilgi floresan etiketli çekirdekleri bulmak için tekrar yanar. Yakın Şekil 2B beyinsapı ventral yüzeyine yanar parlak yapıları bizim izleyici enjeksiyonlar için bir rehber ve bir hedef hem de kullanılan trapezoid vücudun iki ventral çekirdekleri vardır. 4 ve 5 temsilcisi sonuçlarını göstermek Rakamlar ve choleratoxin altbirim-b kullanarak yamuk vücudun medial çekirdeğinin (MNTB) içine iki retrograd enjeksiyonu (CTB, yamuk gövdesinin (VNTB) kullanarak tetrametilrodamin dekstran (. Şekil 4 TRITC) ventral çekirdeğinde içine anterograde enjeksiyon Şekil 5A ve B) ve TRITC (Şekil 5C ve D). MNTB için VNTB gelen projeksiyonlar (bu durumda baskılayıcı olarak) belirten Parlak aksonal etiketleme VNTB (Şekil 4) içine anterograde enjeksiyonu takiben görülebilir. 5A Şekiller ve 5C sitesi üzerinden bir bakış göstermekyanındaki retrograd etiketli hücreleri (VNTB) içeren çekirdeği ile enjeksiyon (MNTB) evi. Şekil 5A ve 5C görüntülenen aynı bölümlerde glycinergic VNTB hücrelerinin somata etiketli retrograd 5B ve 5D gösterisi büyütülmüş görüntüleri Şekil. CTB retrograd izleme daha noktalı desen 12-13 (Şekil 5B) ile sonuçlanır kadar retrograd TRITC ile etiketlenmiş VNTB hücreleri çok yoğun Golgi gibi etiketleme 21 (Şekil 5D) görüntülemek, oysa edin.
Şekil 1:. GlyT2-GFP-pozitif optik genotipleme ve GlyT2-GFP-negatif Fareler GFP pozitif farenin sera olmadan 405 nm lazer işaretleyici ile lazer aydınlanmasına (A) normal aydınlatma koşulları, (B) altında fotograflanmıştır filtreleme gözlük ve (C)Lazer ve UV koruyucu gözlük lazer aydınlatma üzerine. Güçlü GFP sinyali beyincik ve beyin sapı üzerindeki alana görülebilir. (D) Buna karşılık, aynı fare hattı ve yaş (p2) den GlyT2-GFP-negatif yavrular (aynı alanlarda floresan herhangi bir belirti görünmüyor geri kafa ve omurilik) evi. Mavi lazer ışığı etkili bir gözlük ile filtre edilir.
Şekil 2: Optik Genotipleme ve hazırlanan Beyin Eksplantasyon. (A) p4 GlyT2-GFP fare yavrunun kafatası lazer aydınlatma maruz kalan ve bant geçiren filtre gözlüğü ile görülüyor. Floresanlama GFP kafatası yoluyla görülebilir. (B) beyin eksplant aynı yavru lazer aydınlatma üzerine bir hazırlık çanak, filtreleme gözlük aracılığıyla görüldüğü gibi. Böyle yamuk gövdesinin (VNTB) ventral çekirdeği olarak Glycinergic akson ve beyin çekirdekleri, ver olarak görülebilirBeyin yüzeyine yakın y parlak yapılar.
Şekil 3: Bir İn Vitro Basınç Enjeksiyon ve Elektroporasyon Kur Üzeri Bakış. (A) 1: stereoskop, 2: monteli lazer pointer (405 nm dalga boyu), 3: Enjeksiyon pipet ile headstage bir micromanipulator üzerine monte, 4: yüklü MC Stimulus yazılımı, 6 ile bir PC: beyin eksplant, 5 içeren preparat çanak: boru vasıtasıyla enjeksiyon pipetine bağlı basınçlı enjeksiyon cihazı, (B) 7. uyaran izolasyon birimi, 8: yüksek yoğunluklu aydınlatıcı, 9: stimülatör. Stimülatör stimülasyon yalıtım ünitesi ile pipet elektroduna bağlanır, ve PC ile tahrik edilir.
Şekil 4: Yamuk Bedenin medial Nucleus için VNTB gelen inhibitör Bağlantıları İleriye Takip (MNTB). Bir p14 GlyT2-GFP fare temizlenmiş beyin derinlemesine yaklaşık 200 mikron kapsayan yatay dilim alınan konfokal yığınının maksimum projeksiyon gösterilmektedir. VNTB bölgesinin caudo-medyal kısmında bir tetrametilrodamin dekstran (TRITC) enjeksiyonundan sonra, parlak bir aksonal bağlantıları etiketli (ve bazı durumlarda kendi terminali ekleri olarak) MNTB için VNTB den görülmektedir. Ölçek çubuğu: 200 mikron.
Şekil 5:. VNTB in MNTB içine Retrograd Tracer Enjeksiyonlar Dolgulu Reveal Glycinergic Hücreler gösterilen en çıkıntılardır konfokal bir P88 arasında koronal kesitler alınmış yığınlar (A, B) ve P80 (C, D (fazla yaklaşık 50 um kapsayan). MNTB medyal kısmına) GlyT2-GFP fare. (A) choleratoxin alt-birimi-b bir bakış (CTB) enjeksiyonu. (B) bölgesindeki VNTB Glycinergic hücreleri CT ile doldurulurŞekil 5A'da gösterilen enjeksiyon sonucu B (hücre somata içi kırmızı puncta). Puncta bazıları (örneğin, çünkü enjeksiyon bölgesinde geçiş yaralı liflerin) yanı sıra, doldurulan VNTB diğer GFP-negatif (non-glycinergic) hücre tiplerinin göstergesi olabilir hücreleri, dış görünür . (C) MNTB hedefleyen bir retrograd TRITC enjeksiyonu başka bakış. Not bir hücre numarası (Şekil 5A'da sadece basınç enjekte CTB karşıt olarak), elektroporasyon, aşağıdaki MNTB in TRITC ile doldurulur kadar. (D) MNTB bir TRITC enjeksiyonundan sonra glycinergic VNTB hücrelerinin retrograd markalama (aynı enjeksiyon ) Şekil 5C'de gösterildiği gibi. Birçok hücre için iki floresan sinyalleri (yerli GFP tanımı ve kırmızı TRITC ile doldurulması) karışımının yoğun bir sarı ya da turuncu etiketleme gösterir. GFP-pozitif hücre ile karşılaştır bu nedenden dolayıboya (mavi ok) ve derin kırmızı ve muhtemelen çünkü enjeksiyon (kırmızı ok) alanında bir aksonal hasar, dolu görünen bir iz etiketli GFP-negatif hücresini sürmedi. CTB (Şekil 5B) ve TRITC (Şekil 5D) ile retrograd tracer enjeksiyonları hücre somata farklı boyama modeli dikkat edin. Ölçek çubukları: Şekil 5A ve 5C: 20 mikron: 200 mm, 5B ve 5D Rakamlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo izleme çalışmaları aksine in vitro izleyici elektroporasyon genel gücü, pahalı stereotaktik (ve genellikle elektrofizyolojik) ekipmanı içermeyen, bu araştırmacılara dolayısıyla faiz ve beyin alanına daha iyi erişim sağlamasıdır. Dekstran aminler ve diğer izleyiciler kullanımı ile ilgili ayrıntılı bir inceleme (bkz in vivo izleyici enjeksiyonları halinde yerine günler veya haftalar - Buna ek olarak, beyin eksplant için gerekli yaşam süresi sadece birkaç saat (4 1) yayılan Lanciego ve Wouterlood, 2011 22, aynı zamanda Rodriguez-Contreras ve ark., 2008 23) tarafından in vivo enjeksiyonu kadar başarısız enjeksiyonlar gibi erken enjeksiyon işlemi sırasında olarak algılanabilir, böylece ya da ertesi gün, en geç Enjeksiyon parametreleri buna uygun olarak ayarlanabilir olması. Beyin eksplantlan için kısa yaşam süresi de <arasındaki küçük fark, genellikle olduğu anlamına gelirem> etkili (boya anterograd nöronlar veya retrograd aksonal enjeksiyonları terminalleri ile alındı alan) ve enjeksiyon siteyi görünür (boya alınır olmadan, dökülen alan), bu fark göz ardı asla rağmen Tamamen ve sadece post-hoc, bazı durumlarda tamamen imkansız olabilen kontrollü / ölçülebilir (bkz Albrecht ve diğ., 2014 daha ayrıntılı bir tartışma 24 için).
Bu hemen hemen herhangi bir uzunluktaki bağlantı sürece deneyi enjekte alanı ve beyin dokusu tek parça aksonal çıkıntıların hedef veya kaynak alanı, hem de korumak mümkün olduğu gibi, bu yöntem ile incelenebilir olduğu, işaret edilmelidir. Bu tür bağlantıların görselleştirme net doku yürüttükten sonra (burada anlatıldığı gibi) dilimleme ve beyin montaj sonra elde konfokal görüntü yığınlarının veya tam beynin / beyin slab görüntüleme teknikleri ya yeniden inşası yoluyla elde edilebiliring protokolleri (bir örnek için bu protokolü bölüm 5).
Lazer güdümlü in vitro elektroporasyon bizim Tekniğin en büyük avantajı iz enjeksiyonlar sırasında doğruluğunu hedefleyen önemli bir artıştır. In vitro elektroporasyon orijinal bir yöntem belirli topografik belirteçleri hedefleyen veya enjeksiyon alanı için onlara olarak yaklaşık kılavuzları kullanarak sadece görsel kontrol dayanır. Aynı hedef alan boya yayılması için de geçerlidir: Bir yayılma boya gözlemlemek, ancak daha ince bir şekilde boya yayılmasını kontrol etmek kolay değildir. Bu yöntemin lazer modifikasyonu ile, araştırmacı kolayca çekirdek ve ilgi hücreleri bulmak ve yerli genetik tahrik floresan etkileşim ve boya floresan yoluyla ilgi çekirdeği / hücre popülasyonunda boya yayılmasını gözlemlemek. Böylece, antero veya retrograd yanlış pozitif minimize ederek onun / onu izleme deney üzerinde araştırmacı kazançları daha fazla denetimdolgular, ilgi çekirdeği / alanı dışında hücre / aksonal terminalleri de enjeksiyon sırasında doldu çünkü. Açıktır ki, bu daha önce belirtildiği gibi, belirgin bir sitede farklı olabilir enjeksiyon etkin sitesi, üzerinde mutlak bir kontrol anlamına gelmez. Bu tekniğin bir uyarı Açıkçası genetiği değiştirilmiş organizmaların mevcudiyetidir. Fareler de işitsel alan için geçerlidir memeli çalışmalarda, yaygın olarak kullanılan bir genetik model organizma, ama onlar daha kesin, insan odyogramı benzer çünkü bazı memeli modelleri, daha iyi düşünülebilir. Bu nedenle, başka teknikler de araştırma alanında, belirli bir tür için daha uygun diğer türlerin vahşi tip hayvanlarda sinir hücresi popülasyonlarını (işitsel sistem 25-28 çalışmalarında örneğin gerbiller ve kürkü) etiketlemek için kullanılabilir: Bu yararlanarak viral enjeksiyonları içerebilir Beyin ve ifade fluoresc sadece belirli bölmelere hedefleyen belirli destekleyicilerBeyin hücrelerinin sadece bir alt kümesi ent işaretleri. Doğal olarak, ekstra bakım gibi yapılar vuruş-fare hatları yerli olarak wild tip hayvanlarda viral ifade ya da olup olmadığını olursa olsun nöronların, sağ alt popülasyonunda ifade genetik yapıları geçerliliğini sağlamak için alınması gereken.
Daha önce işaret edildiği gibi, nöronların belirli alt popülasyonlar floresan proteinleri ifade fare mutantlar avantajı da (bizim durumumuzda biz saf görselleştirme başka 24'e bir işitsel beyin sapı çekirdekten inhibitör projeksiyonlar karakterize başardık beyin devrelerinin fonksiyonel karakterizasyonu için izin verir Bizim izleme deneylerinin sonuçları). Izleme deneylerinin sonuçlarının herhangi yorumlama gerçekleşebilir önce tekrar ifade genetik yapıları geçerliliği teyit edilmesi gerekmektedir.
In vitro elektroporasyon diğer bir genel gücü oth uyumluluğudurBöyle (bağışıklık) histokimyası ve beyin takas olarak er anatomik yöntemleri. Daha önce 24 gösterildiği gibi, bu tür Nissl gibi ek boyama tekniklerinin uygulanması ya da ClearT2 12 20,24 denilen bir beyin temizleme yöntemi ile etkilenmez. Tek akılda tutmak zorunda büyük dezavantajı bir ek (immün) sinyal gücü histokimyasal karşı kalın dilimler halinde aksonal süreç korunması seçenekleri tartmak zorunda böylece Nissl ve antikor lekeleri penetrasyon derinliği, artan doku kalınlığı azalır olmasıdır Her iki anatomik etiketleme yöntemleri gerekli deneylerde boyama. Etiket en az sayıda bu noktada (yerli floresan protein ifadesi, izleyici ve Nissl / antikor etiketleme) üç belirteçleri başlar çünkü Tabii ki, dikkate başka bir faktör farklı floresan etiket uyarma / emisyon bant genişliği ayırma, olduğunu.
Tabiidir ki tarif edilen yöntem, genişletilebilirBeyin eksplantlar veya transgenik farelerin bile beyin dilimler halinde (kuantum boncuklar dahil) floresan belirteçlerin her türlü enjeksiyonları. Enjeksiyon doğruluğu bağlı olduğu için, açık bir hedef saptama (floresan etiketli çekirdekleri ve hücrelerin müşahede) ve floresan boya dökülme üzerinde ince kontrolü, bu iki faktörün tek, yüksek enjeksiyon doğruluğu için yeterli olacaktır bile Diğer yoktur. Bu (viral yapıları ya da DNA / RNA vektörleri gibi), farklı bir floresan olmayan belirteçler sürece, hedef çekirdekleri açık deneyci görünür olduğu gibi, ilgi konusu beyin çekirdeklerine daha hassas bir enjekte edilebilir olduğu anlamına gelir. Elektroporasyon enjeksiyonu bu tür yönelik yöntem, hemen hemen ideal, hem de 29-30 DNA malzemesinin etkili alımı için izin verir, çünkü bu ikinci uygulama özellikle ilgi çekicidir. Düşünülmesi gereken tek dezavantajı DNA yapıları ve canlı ti sorununu ifade etmek için zaman ayırın olduğunussue koruma ortaya çıkar. Bu Organotipik beyin dilim kültürleri kurarak aşılabileceğine 31-32 hafta sipariş üzerine canlı doku korunması için izin enjekte beyin dilimleri (veya yeniden dilimlenmiş beyin dokusu bloklar) dayalı.
Ve tabii ki diğer transgenik fare mutantlar kolinerjik nöronlar gibi diğer nöronal tip bağlantı araştırmak için kullanılabilir (örneğin ChAT-GFP farelerde 33), bu yöntemi bağlantısı ve beyin (mikro) devrelerin işlevselliğini incelemek için çok yönlü bir aracı yapma.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Biz ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
NIH tarafından desteklenen / NIDCD R01 DC 011582. Görüntüleme deneyleri Colorado Anschutz Tıp Kampüsü Gelişmiş Işık Mikroskopi Çekirdek Üniversitesi yapılmıştır NIH / NCRR Colorado CTSI Hibe Numarası UL1 RR025780 ve Rocky Mountain Neurlogical Bozuklukları Çekirdek Merkezi Grant NIH P30NS048154 kısmen desteklenmiştir. Salk Enstitüsü'nden Dr. Sascha du Lac GlyT2-GFP farelerde ile sağladı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | All chemicals are from Sigma-Aldrich, unless noted otherwise. |
| Potassium chloride | P9333 | ||
| Potassium phosphate monobasic | P5655 | ||
| Sodium phosphate di-basic | S907 | ||
| Magnesium chloride | M2670 | ||
| Calcium chloride | C5080 | ||
| Glucose | G7528 | ||
| Sodium bicarbonate | S6297 | ||
| Ascorbic acid | A4544 | ||
| Myo-inositol | I5125 | ||
| Sodium pyruvate | P2256 | ||
| Bovine serum albumine | A2153 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Triton-X-100 | X100 | optional, for additional (immuno)histochemistry | |
| Poly(ethylene glycol), 8000 MW | P2139 | optional, for brain clearing | |
| Formamide | Fisher Scientific | F84 | optional, for brain clearing |
| Choleratoxin subunit-b | Molecular Probes | C-34776 (Alexa 555) | |
| Dextrane tetramethyl-rhodamine | Molecular Probes | D-7162 (Alexa 555) | |
| Fluorescent Nissl | Invitrogen | N-21479 (blue) | optional |
| Paraformaldehyde | Fisher Scientific | SF93 | |
| Agarose | Invitrogen | 16520 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Pentobarbi-tal | Vortech Pharmaceuticals | Fatal-Plus | |
| Borosilicate glass filaments | Harvard Apparatus | G150F-10 | |
| Pipette puller | Zeitz Instruments, Germany | DMZ Universal Puller | |
| Perfusion setup | Custom-made | ||
| Laser pointer | laserpointerpro.com, Hong Kong | HK-88007294 (405 nm) | |
| Filter/safety goggles | Dragon Lasers, China | LSG09 (band-pass 450-700 nm) | |
| Bionocular microscope | Wild Heerbrugg, Switzerland | Wild M3 | Equipped with high-intensity illuminator (MI-150; Dolan-Jenner Inc.) |
| Picospritzer | Parker Instruments | Picospritzer III | |
| PC with installed MC Stimulus software | Multi Channel Sys-tems, Germany (software) | ||
| 2-channel stimulator | Multi Channel Sys-tems, Germany | STG-1002 | |
| Stimulation isolation unit | A.M.P.I., Israel | Iso-Flex | |
| Micromanipulator | Narishige, Japan | YOU-1 | |
| Vibratome | Leica, Germany | VT1000S |
References
- Waller, A. Experiments on the sections of glossopharyngeal and hypoglossal nerves of the frog and observations of the alterations produced thereby in the structure of their primitive fibers. Philos. Trans. R. Soc. Lond. 140, 423-429 (1850).
- Fink, R. P., Heimer, L. Two methods for selective silver impregnation of degenerating axons and their synaptic endings in the central nervous system. Brain Res. 4, 369-374 (1967).
- Nauta, W. J. Selective silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system. Stain Technol. 27, 175-179 (1952).
- Ramón y Cajal, S. Histologie du système nerveux de l'Homme et des vertébrés. , Maloine, Paris. (1911).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Uptake and retrograde transport of peroxidase in hypoglossal neurons. Electron microscopical localization in the neuronal perikaryon. Acta Neuropathol. 19, 1-9 (1971).
- Kristensson, K., Olsson, Y. Retrograde axonal transport of protein. Brain Res. 29, 363-365 (1971).
- Burger, R. M., Cramer, K. S., Pfeiffer, J. D., Rubel, E. W. Avian superior olivary nucleus provides divergent inhibitory input to parallel auditory pathways. J. Comp. Neurol. 481, 6-18 (2005).
- Ford, M. C., Grothe, B., Klug, A. Fenestration of the calyx of Held occurs sequentially along the tonotopic axis, is influenced by afferent activity, and facilitates glutamate clearance. J. Comp. Neurol. 514, 92-106 (2009).
- Glover, J. C., Petursdottir, G., Jansen, J. K. S. Fluorescent dextran amines used as axonal tracers in the nervous system of chicken embryo. J. Neurosci. Methods. 18, 243-254 (1986).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Gonatas, N. K. Conjugates of horseradish peroxidase (HRP) with cholera toxin and wheat germ agglutinin are superior to free HRP as orthograde transported markers. Brain Res. 223, 381-385 (1981).
- Trojanowski, J. Q., Gonatas, J. O., Steiber, A., Gonatas, N. K. Horseradish peroxsidase (HRP) conjugates of cholera toxin and lectins are more sensitive retrograde transported markers than free HRP. Brain Res. 231, 33-50 (1982).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Corvin, J. V., Reep, R. L. Topography in the projections of lateral posterior thalamus with cingulate and medial agranular cortex in relation to circuitry for directed attention and neglect. Brain Res. 1240, 87-95 (2008).
- Conte, W. L., Kamishina, H., Reep, R. L. Multiple neuroanatomical tract-tracing using fluorescent Alexa Fluor conjugates of cholera toxin subunit B in rats. Nat. Protoc. 4, 1157-1166 (2009).
- Haas, K., Jensen, K., Sin, W. C., Foa, L., Cline, H. T. Targeted electroporation in Xenopus tadpoles in vivo- from single cells to the entire brain. Differentiation. 70, 148-154 (2002).
- Zeilhofer, H. U., et al. Glycinergic neurons expressing enhanced green fluorescent protein in bacterial artificial chromosome transgenic mice. J. Comp. Neurol. 482, 123-141 (2005).
- Poyatos, I., Ponce, J., Aragön, C., Giménez, C., Zafra, F. The glycine transporter GLYT2 is a reliable marker for glycine-immunoreactive neurons. Brain. Res. Mol. Brain Res. 49, 63-67 (1997).
- Gong, S., et al. A gene expression atlas of the central nervous system based on bacterial artificial chromosomes. Nature. 425, 917-925 (2003).
- Heintz, N. Bac to the future: the use of BAC transgenic mice for neuroscience research. Nat. Rev. Neurosci. 2, 861-870 (2001).
- Franklin, K. B. J., Paxinos, G. The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , 3rd ed, Elsevier/Academic Press. New York. (2008).
- Kuwajima, T., Sitko, A. A., Bhansali, P., Jurgens, C., Guido, W., Mason, C. ClearT: a detergent- and solvent-free clearing method for neuronal and non-neuronal tissue. Development. 140, 1364-1368 (2013).
- Wouterlood, F. G., Jorritsma-Byham, B. The anterograde neuroanatomical tracer biotinylated dextran amine: comparison with the tracer PHA-L in preparations for electron microscopy. J. Neurosci. Methods. 48, 75-87 (1993).
- Lanciego, J. L., Wouterlood, F. G. A half century of experimental neuroanatomical tracing. J. Chem. Neuroanat. 42, 157-183 (2011).
- Rodriguez-Contreras, A., Silvio, J., van Hoeve, S., Habets, L. P., Locher, H., Borst, J. G. G. Dynamic development of the calyx of Held synapse. PNAS. 105 (14), 5603-5608 (2008).
- Albrecht, O., Dondzillo, A., Mayer, F., Thompson, J. A., Klug, A. Inhibitory projections from the ventral nucleus of the trapezoid body to the medial nucleus of the trapezoid body in the mouse. Front. Neural Circuits. 8, 83 (2014).
- Benson, D. A., Teas, D. C. Single unit of binaural interaction in the auditory cortex of the chinchilla. Brain Res. 103, 313-338 (1976).
- Koka, K., Jones, H. G., Thornton, J. L., Lupo, J. E., Tollin, D. J. Sound pressure transformations by the head and pinnae of the adult Chinchilla (Chinchilla lanigera). Hear Res. 272 (1-2), 135-147 (2011).
- Ryan, A. Hearing sensitivity of the mongolian gerbil, Meriones unguiculatus. J. Acoust. Soc. Am. 59 (5), 1222-1226 (1976).
- Zwicker, E., Fastl, H. Psychoacoustics Facts and Models. , Springer. (1990).
- Chu, G., Hayakawa, H., Berg, P. Electroporation for the efficient transfection of mammalian cells with DNA. Nucleic Acids Res. 15 (3), 1311-1326 (1987).
- Klenchin, V. A., Sukharev, S. I., Serov, S. M., Chernomordik, L. V., Chizmadzhev, Y. A. Electrically induced DNA uptake by cells is a fast process involving DNA electrophoresis. Biophys J. 60 (4), 804-811 (1991).
- Elias, L., Kriegstein, A. Organotypic Slice Culture of E18 Rat Brains. J. Vis. Exp. (6), e235 (2007).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J. Neurosci. Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Tallini, Y. N., et al. BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons. Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).
