Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optogenetic Funksjonell MRI

Published: April 19, 2016 doi: 10.3791/53346
Automatic Translation
1, 2, 1, 1,2
1Neurology and Neurological Sciences, Stanford University, 2Electrical Engineering, Neurology and Neurological Sciences, Stanford University

Introduction

Optogenetic funksjonell magnetisk resonans imaging (ofMRI) er en ny teknikk som kombinerer romlig oppløsning på high-feltet fMRI med presisjonen i optogenetic stimulering 1-11,38, slik at celletype-spesifikke kartlegging av funksjonelle nevrale kretser og deres dynamikk over hele hjerne. Optogenetics gjør det mulig for spesifikke celletyper å være målrettet for stimulering ved innføring av lysfølsomme trans-membrankonduktans kanaler, kalt opsins. Spesifikke elementer av nevrale kretser er genmodifisert til å uttrykke disse kanalene, slik at millisekund-tidsskala modulering av aktiviteten i intakt hjernen 1-15. fmri gir en ikke-invasiv metode for å bestemme hjernens globale dynamiske respons på optogenetic stimulering av spesifikke nevrale kretser gjennom måling av blod-oksygen-nivå-avhengige (BOLD) signal 16-18, som gir et indirekte mål på neuronal aktivitet.

Kombinasjonen av disse to teknikkene, betegnes optogenetic funksjonell magnetisk resonans imaging (ofMRI), er en fordel i forhold til andre metoder for opptak hjernens aktivitet under stimulering som elektro fordi det kan gi en visning av hele hjernen ved relativt høy romlig oppløsning. Dette gjør det mulig for påvisning av neuronal aktivitet i respons til målrettet stimulering på store avstander fra stedet av stimulering uten behov for implantering av invasive opptak elektroder 1-11. ofMRI er fordelaktig fremfor de mer tradisjonelle metode for å utføre elektrisk stimulering i løpet av fmri, som kan rekruttere ulike celletyper i nærheten av elektroden og således forvirre den kausale påvirkning av hver populasjon 19. I tillegg til elektrodene som brukes for elektrisk stimulering, og den genererte strøm kan produsere gjenstander i løpet av 20 MR. Faktisk muliggjør ofMRI observasjon av påvirkning på global hjerneaktivitet fra den spesifikke modulatipå en av mange forskjellige celletyper ved bruk av avanserte genetisk målrettingsteknikker som Cre-Lox system i transgene dyr eller bruk av aktivatorer. Kombinatorisk optisk kontroll med hel hjerne-overvåking er mulig med ofMRI gjennom bruk av både NpHR for å hemme og ChR2 å eksitere spesifikke celletyper. Den optogenetic verktøysettet er tilgjengelig for bruk i ofMRI er også raskt bedre over tid med innføring av opsins med øket lys-sensitivitet eller forbedret kinetikk, av stabiliserte trinn funksjons opsins (SSFOs) eller av røde forskjøvet opsins som kan oppheve kravet til implanterte fiber optikk, slik at ikke-invasiv stimulering under avbildning 21. Disse mulighetene er ikke tilgjengelig med elektrisk stimulering.

Imidlertid har signal artefakter som følge av vev oppvarming på grunn av lys levering i hjernen blitt rapportert 22, hvor temperatur-indusert modifikasjon av relaksasjonstider har vist seg å produsere pseugjøre aktivering. Forskere utfører ofMRI bør derfor være klar over dette potensialet forvirre. Med riktig oppsett og kontroller, kan problemet løses. I tillegg kan forholdsvis lav tidsoppløsning for måling av hemodynamiske responsen i fmri være en begrensende faktor for visse anvendelser av denne teknikk.

Denne protokollen beskriver første konstruksjonen av de fiberoptiske implantater som muliggjør levering av bestemte bølgelengder av lys dypt inn i hjernen in vivo. Den protokollen beskriver da levering av opsin-kodende viral vektor til en nøyaktig hjerneregion ved bruk av stereotaktisk kirurgi. Neste protokollen beskriver prosessen med hel-hjerne funksjonell MRI under samtidig stimulering lys. Til slutt, skisserer protokollen grunnleggende dataanalyse av de innsamlede data.

Av notatet, optogenetics beskrevet her krever en kronisk implantat for lys levering. Men de fiberoptiske implantater er stabil og bio-kompatibel, noe som åpner for langsgående skanning og undersøkelse av nevrale kretser over en periode på flere måneder 23,24.

I sammendraget, nøyaktig stimulering og hel-hjerne overvåking evne ofMRI er avgjørende faktorene i å gjøre ofMRI et kraftig verktøy for studiet av connectomics av ​​hjernen. I tillegg kan det tilveiebringe en ny innsikt i mekanismen for nevrologiske sykdommer 25 når kombinert med forskjellige dyremodeller. Faktisk ofMRI har blitt brukt for å belyse nettverk aktivitet av distinkte hippocampus-underregioner i forbindelse med beslag 8. Derfor vil laboratorier som er interessert i å svare systemer-nivå nevro spørsmål finner denne teknikken av betydning.

Protocol

Etikk Uttalelse: Eksperimentelle prosedyrer her har blitt godkjent av Stanford University Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC).

1. Klar Patch Kabler og Endehylser Implantater

Merk: Selv om patchkabler og hylse implantater er tilgjengelig kommersielt, produsere disse in-house gjør spesialitet design og vil koste mindre.

  1. For å fremstille en fiber patch-kabel for å levere lys fra laseren til implantatet i hjernen, første spalte den optiske fiber til den ønskede lengde.
    1. Ved hjelp av en fiber cleaver, avslutte den optiske fiber for å produsere en flat slutt på avslutningspunktet. Dersom fiberen er belagt med en kappe, jakke stripe med en fiber-stripping verktøyet på forhånd.
    2. Spalter den andre enden av den optiske fiber for å frembringe den ønskede lengde for kabelen, slik at kabelen er lang nok til å strekke seg fra lyskilden til dyret inne i boringen iskanneren.
  2. Blande en liten mengde av epoksylim i et 1: 1 forhold på et stykke aluminiumfolie kort tid før neste trinn, som epoksylim blir for viskøs for anvendelse 5 minutter etter blanding.
  3. Ved hjelp av en liten trepinne, forsiktig gjelder epoksylim til den delen av fiberen som skal bli plassert inne i den konkave side av den keramiske bøssingen og deretter anvende en liten dråpe på overflaten av den flate siden av hylsen. Etter å sette den i innfatningen, sørge for at en liten lengde på fiber (<0,5 mm) stikker fra den flate siden av keramisk hylse. La epoxy limet herde O / N for optimale resultater.
  4. På siden av den fiberoptiske patch-kabel som skal kobles til den laserlyskilde, forsiktig gjelder epoksylim til den delen av fiberen som skal bli plassert inne i den konkave side av hylsen på den FC / PC-kontakten og deretter anvende en liten falle ned på overflaten av den flate siden av hylsen. Etter å sette den i innfatningen, sikreat en liten lengde på fiber (<0,5 mm) stikker fra den flate siden av innfatningen. La epoxy limet herde O / N for optimale resultater.
  5. Polere den flate enden av hylsene for begge sider av kabelen med en polerings disk ved hjelp av pinsett for å bruke milde press på hylse samtidig som figur-8 rotasjoner på aluminiumoksid lapping ark (fra 3 pm til en pm til 0,3 mikrometer grus ).
  6. Undersøke den flate enden på hylsen med et mikroskop ved 100X forstørrelse. Sikre at overflaten av den flate enden, herunder fiberoptiske overflate i seg selv, er fri for enhver epoksylim; fortsette polering hvis epoksylim forblir på overflaten. Sørg for at den fiberoptiske overflaten ikke ødelagt eller chipped.
    FORSIKTIG: Sørg for personell ta nødvendige laser verne trening klasser og slitasje laser vernebriller før håndtering laserutstyr.
  7. Koble den fiberoptiske patch-kabelen til laser lyskilde gjennom FC / PC-kontakt og justere fiber tips til midtpunktet i koblingen. Mål lys sendeeffekt av fiber med en kraftmåler for å sikre tilstrekkelig lys.
    Merk: Følgende trinn er for å forberede keramiske endehylser med fiberoptikk for kronisk implantering i hjernen; keramiske endehylser er hul i midten og bære fiberoptikk for å levere lys fra en patch-kabel til en region av interesse (ROI) i hjernen.
  8. Ved hjelp av en fiber cleaver, avslutte den optiske fiber for å produsere en flat slutt på avslutningspunktet. Dersom fiberen er belagt med en kappe, jakke stripe med en fiber-stripping verktøyet på forhånd.
  9. Spalter den andre enden av den optiske fiber for å frembringe den ønskede lengde for implantering inn i hjernen. Bestemme lengden av fiberen ved hjelp av en stereotaksiske atlas å målrette ROI i hjernen.
    1. For eksempel: å målrette rygg hippocampus hos rotter som er 3,5 mm under bregma, sørge for at lengden på fiber som stikker ut fra ferrule er 3,5 mm + 0,25 mm, sto for skallen tykkelse og åpner for feilmargin. Kontroller derfor at den endelige lengden på fiber er 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (lengde på hylsen) = 14,25 mm.
  10. Blande en liten mengde av epoksylim i et 1: 1 forhold på et stykke aluminiumfolie kort tid før neste trinn (epoksy-lim blir for viskøs for anvendelse 5 minutter etter blanding).
  11. Ved hjelp av en liten trepinne, forsiktig gjelder epoksylim til den delen av fiberen som skal bli plassert inne i den konkave side av den keramiske bøssingen og deretter anvende en liten dråpe på overflaten av den flate siden av hylsen. Etter å sette den i innfatningen, sørge for at en liten lengde på fiber (<0,5 mm) stikker fra den flate siden av keramisk hylse. La epoxy limet herde O / N for optimale resultater.
  12. Polere den flate enden på hylsen ved hjelp av en polering disk ved hjelp av pinsett for å bruke milde press på hylse samtidig som figur-åtte rotasjons på aluminium oksid lapping ark (fra 3 pm til en pm til 0,3 mikrometer grit).
  13. Undersøke den flate enden på hylsen med et mikroskop ved 100X forstørrelse. Sikre at overflaten av den flate enden, herunder fiberoptiske overflate i seg selv, er fri for enhver epoksylim; fortsette polering hvis epoksylim forblir på overflaten. Sørg for at den fiberoptiske overflaten ikke ødelagt eller chipped.
  14. Par polert innfatningen til en fiberoptisk patch kabel med en hylse ermet og koble patch-kabelen til en laser lyskilde. Mål lyset sendeeffekt på tuppen av fiber med en kraftmåler for å sikre tilstrekkelig effektivitet.
  15. Holde en logg av den effekt som kreves fra plasteret kabelens endehylse for hver fiberhylse implantat for å sende ut det ønskede effektnivå på tuppen av den fiberoptiske (2,5 mW i denne protokoll). Kast endehylser med en dempning på over 50% og med ikke-sirkulært utgang mønster.

2. stereo Implantation kirurgi og Virus Injection

  1. Sørg for at noen eksperimentelle prosedyrer som involverer bruk av dyr er godkjent av den lokale IACUC. Oppretthold aseptiske forhold under overlevelses operasjoner ved å følge aseptiske prosedyrer, blant annet ved hjelp av sterile hansker, steril masker, sterile operasjonsduker og steriliserte kirurgiske instrumenter.
    FORSIKTIG: Kontroller at kirurger er iført riktig personlig verneutstyr (PVU) inkludert vernebriller før du begynner. Følg standard biosikkerhet prosedyrer når du arbeider med adenoassosiert vektor (AAV), ta vare å unngå sprut. Kast AAV avfall i en avfallsbeholder.
  2. Legg i en mikroliter sprøyte med nok AAV for injeksjon i dyret pluss ekstra for å ta høyde for eventuelle volum tap (totalt 4 mL per dyr), holde sprøyten på is før bruk. I denne protokollen, er AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP på en titer av 4x10 12 vg / ml brukes. Plasser dyret i henhold isoflurane anestesi med en induksjonsskammer, som er koblet til en presisjons isofluran fordamper set til 3 - 4% med en oksygengasskilde.
  3. Barbere hodet med en elektrisk barbermaskin og utfører en trippel kirurgisk skrubb på huden ved hjelp av Betadine og en 70% etanol skylling.
  4. Når dyret er i dyp anestesi (sjekk tå refleks og pustefrekvens), immobilisere dyrets hodeskalle i en stereotaktisk apparat med intra-aural posisjonering studs og tann bar.
    Merk: Hele prosedyren vil ta 1-2 timer, fra anestesi induksjon til utvinning.
  5. Still anestesi til et passende nivå (1 - 3% isofluran på fordamperen) og overvåker kontinuerlig dyrets vitale tegn, justering av anestesi som er nødvendig for å opprettholde en pustehastighet på ~ 40 åndedrag / min. Administrere oftalmisk salve på øynene til dyret for å hindre tørrhet mens under anestesi.
  6. Lag en 15 - 20 mm midtlinjen skalp snitt med en skalpell og trekke hodebunnen ved hjelp av kirurgiske hemostats enttached til periosteum. Referanse lambda og bregma å posisjonere bore litt over koordinatene for avkastning.
  7. Bor et lite kraniotomi (2-3 mm) over avkastningen med en dental drill, tar seg ikke å punktere hjernen. Langsomt inn nål festet til den mikroliter sprøyte, gjennom den kraniotomi til ROI i hjernen.
  8. Med en mikropumpekontroller, injisere 2 mL av vektor løsningen inn i ROI. Bruke en strømningshastighet på 150 nl / min for å unngå vevsskade. Etter at injeksjonen er fullført, vente 10 min før å fjerne sprøyten langsomt, med en hastighet på 0,5 mm / min.
  9. Etter injeksjon, tørking av overflaten av skallen. Referanse lambda og bregma å bekrefte koordinater og deretter sette hylse implantat til målet dybde (for eksempel: 3,5 mm under bregma for rygg hippocampus) med en hastighet på 0,5 mm / min. Monter hylse implantatet til skallen ved hjelp av dental sement. Etter at dental sement har stivnet, forsegle såret med sting (size 5-0 for rotter) rundt dental sement cap.
  10. Etter operasjonen plassere dyret i buret sitt enkeltvis plassert med halvparten av buret på toppen av en ovn for anestesi utvinning. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet nok bevissthet til å opprettholde sternal recumbency. Ikke plasser dyret i selskap med andre dyr før det er fullstendig restituert.
  11. For post-operativ behandling av smerte, administrere buprenorfin subkutant hver 12. time i en dose på 0,05 mg / kg i 24 timer. Administrere antibiotika pulver daglig over snittet området for 3 dager.
  12. Fjern sting ca to uker etter operasjonen for å hindre skorpedannelse.
  13. Vent 4 - 6 uker etter at viruset injeksjon for tilstrekkelig uttrykk for optogenetic gener før du utfører eksperimenter.

3. optogenetic Funksjonell MRI

FORSIKTIG: Vær forsiktig rundt permanent magnetfelt en MR-skanner. sikker utstyr;ent, inkludert funksjonsgeneratoren, lyskilde, ventilator, kapnograf og gasstanker, tilstrekkelig langt borte (i det minste utover den 5 Gauss grense).

  1. Plasserer dyret i henhold gassanestesi med en induksjonsskammer, som er koblet til en presisjons isofluran fordamper på inntil 5% med en oksygengasskilde.
  2. Når dyret er i dyp anestesi (check tå refleks og pustefrekvens), intubere dyret i henhold til protokollen som er beskrevet i Rivard et al. (2006) for å tillate overvåking av karbondioksyd ved kapnografi 26. Merk: intubasjon er avgjørende for å opprettholde riktig nivå av ekspiratorisk CO 2 under bildebehandling.
  3. Fest dyr i skanneren vugge.
    Merk: I denne protokollen, ble vuggen tilpasset produsert, men slike vugger er også kommersielt tilgjengelig. De rotte vugge funksjoner for å sikre dyr i skanneren for levering av anestesi, oppvarmet luft og for begrensning av bevegelse.
  4. Levere en blanding av isofluran (Ranging 1,2 til 1,5%) i ca 60% lystgass og 40% oksygen via slangen gjennom holderen. Sørg for at dyrets hode er godt festet for å unngå bevegelsesartefakter.
  5. Gi oppvarmet luft gjennom rør i holderen, og sett inn en rektal termometer med smøremiddel for å overvåke kroppstemperatur. Administrere oftalmisk salve på øynene til dyret for å hindre tørrhet mens under anestesi.
  6. Koble den fiberoptiske patch-kabel til en laserlyskilde og måle utgangen på spissen av plasteret kabelens endehylse med en kraftmåler.
  7. Juster til den aktuelle effektnivå (bestemt tidligere i trinn 1.15) for å frembringe den ønskede utgangs (2,5 mW i denne protokollen) på tuppen av den fiberoptiske implantert inne i hjernen. Siden overdreven effekt fra fiberoptisk kan forårsake vevsskade i hjernen eller forårsake vev oppvarming som vil produsere signal gjenstander, ikke i betydelig grad øke effekt av laserutover den planlagte produksjonen.
  8. Hindre lyslekkasje fra implantatet med en membran av svart elektrisk tape og dekker øynene til dyret. Par den fiberoptiske kabelen til hylsen implantatet på dyret med en hylse hylse.
  9. Plasser spolen over hodet på dyret. Sett holderen med dyret inn i boringen av skanneren.
    Merk: I denne protokollen, single-loop sende-motta spiral var tilpasset produsert og pre-tunet for å få optimal radiofrekvens fra hjernevev.
  10. Overvåk pust og kroppstemperatur gjennom hele denne prosessen, justering av kunstig ventilator og varmeapparat som er nødvendig for å holde fysiologiske verdier innenfor rammer (sikre at expiratory CO 2 er 3-4% ved å rotere knottene på ventilatoren for å justere slag frekvens og volum, og at temperaturen er 37 ° C ved å klikke på pilene for temperaturinnstilling).
  11. Velg en plassering sekvens til bilde dyret hodet plassering. Dersom bregn er ikke på iso-senter, juster dyrehode sted og gjenta skanningen posisjoneringen til hjernen er på iso-senteret. Velg en lineær shimsingen sekvens og klikk last i sekvensen valgvinduet. Klikk deretter begynne å redusere inhomogeniteter av magnetfeltet.
    Merk: Trimmingplater er et viktig skritt som vil direkte påvirke integriteten til fMRI data.
  12. Velg en T2-vektet sekvens og klikk last i sekvensen valgvinduet. Deretter klikker du begynne å tilegne T2-vektet høyoppløselige koronale anatomiske bilder før fMRI for å sjekke om den totale sikkerheten for hjernen og for å bekrefte plasseringen av optisk fiber implantatet.
    Merk: Disse bildene kan brukes som anatomi overlegg for ofMRI scan serien.
  13. Koble BNC kabler fra utløser port av MRI-skanner til funksjonsgeneratoren slik at laserlyskilden er drevet i henhold til en eksperimentell stimulering paradigme.
    Merk: I denne protokollen, stimulering paradigm er 30 sek fra baseline etterfulgt av 20 sekunder på / 40 sek av for seks min.
  14. Velg en multi-slice gradient tilbakekalt ekko (GRE) sekvens og klikk last i sekvensen valgvinduet. Deretter klikker du begynner å erverve 35 mm x 35 mm (2D FOV) i planet koronale skiver med 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm romlig oppløsning.
    Merk: GRE sekvens som brukes her har en repetisjon tid (TR) og ekko tid (TE) av TR / TE = 750/12 msek og 30 ° flip vinkel.
  15. Ved avslutningen av skanningen, fjerne dyret fra skanneren og overvåke før den har vekket fra anestesi og kan opprettholde sternal recumbency.

4. ofMRI Data Analysis

Merk: Følgende trinn utføres i MATLAB som beskrevet i en publikasjon på høy gjennomstrømming ofMRI 27.

  1. Etter rå scan data har blitt overført til datamaskinen som brukes til analyse, bruk glidende vindu gjenoppbygging å oppdatere bildet hver TR, meden fire-inter spiral avlesning, til 750 msek TR og 12 msek ekko tidspunkt erverve 23 skiver per skanning serien. I stedet for konvensjonell rekonstruksjon der nye fMRI bilder er rekonstruert etter at alle interleaves er ervervet for hver skive, skyvevinduet oppbyggingen metode rekonstruerer bildene etter oppkjøpet av hvert skilleark 27.
  2. Behandle rådata for todimensjonal slipe rekonstruksjon, bevegelse korreksjon, og beregning av tidsserier som beskrevet tidligere 27.
  3. Bruke en terskel sammenheng metode for å bestemme aktiverte voksler ved å beregne den prosentvise modulasjon av BOLD-signalet for hver voksel i forhold til grunnlinjen periode oppsamlet før stimulering som beskrevet tidligere 27. Beregne koherens-verdier som størrelsen av Fourier-transformasjonen ved frekvensen av gjentatte stimuleringssykluser dividert med den sum-av-kvadrater av alle frekvenskomponenter 8.
  4. Bruke tidsseriedata for hver vOxel, gjennomsnittlig motion-korrigert bilder som tilhører påfølgende skanninger av samme stimulering paradigmet første. Deretter justerer den gjennomsnittlige 4D bilder til et felles koordinatsystem ramme med en seks grad-av-frihet stivt legeme transformasjon pluss isotropisk skalering for sammenligning innenfor og mellom dyr som beskrevet tidligere 27.

Representative Results

Figur 1 og Figur 2 viser representative data som er resultatet fra 20 Hz (15 millisekunder pulsbredde, 473 nm, 30% driftssyklus) optogenetic stimulering av motoren cortex. En stimulering paradigme 30 sekunder av baseline fulgt av 20 sekunder på / 40 sek av for seks minutter ble brukt. Tidligere studier har vist at dette paradigmet produserer robust BOLD signal fra optogenetic stimulering 1,8. Figur 1 viser aktiverte voxel oppdaget både på det lokale stedet av stimulering (motor cortex) og i thalamus, som et resultat av langtrekkende synaptiske forbindelser mellom disse regionene. Figur 2 viser at tidsmessige informasjonen kan leses ut fra HRFs, som thalamiske responsen er forsinket (lavere initial helling) sammenlignet med motor cortex respons etter stimulering optogenetic.

p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg "/>
Figur 1. Aktivering Kart over BOLD Signal indusert av optogenetic Stimulering av CaMKIIa-uttrykke celler i Motor Cortex. Sammenheng verdier av aktive lydelementer, identifisert som de betydelig synkronisert til gjentatte stimulering, vises kledde på en T2-vektet koronale anatomisk skive. Data som samles inn i løpet av en seks min, 30 sek periode (initial 30 sek baseline og seks stimulerings sykluser på 20 sek på / 40 sek med 473 nm lys, 20 Hz, 15 ms pulsbredde) kondenseres til en aktivering kartet. Sekvensielle skivene er 0,5 mm fra hverandre og plasseringen av det fiberoptiske implantatet er merket med trekant. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Bevegelse av faget i løpet av bildediagnostikk er en betydelig kilde til gjenstand som kan føre til ødelagte data. Passende sikre dyret på bilde holderen kan minimere slike gjenstander som vil opprettholde passende anestesi nivåer. Her brukte vi isofluran men alternative bedøvelsesmidler, som for eksempel medetomidin eller ketamin og xylazin, bør også vurderes. Imidlertid kan nivåene og valg av anestesi påvirke mange parametere i hjernen, inkludert BOLD respons 28. Isofluran kan føre til endringer i nevronale eksitabilitet 29. Andre bedøvelsesmidler kan også påvirke GABA synaptic hemming 30. Således er valget av anestesi viktig når det utføres ofMRI gitt sin evne til å påvirke neuronal aktivitet. ofMRI i fravær av bedøvelse er mulig, men kan være utfordrende med økt bevegelse fra dyr, som kan reduseres hvis dyret er tilvent; slike våken ofMRI studier har tidligere blitt utført ennd ville unngå konfunderende effekt av anestesi på hjernen 9,10. Post-prosessering motion korreksjon algoritmer kan brukes til å sterkt redusere effekten av bevegelse. Flere av disse fremgangsmåter eksisterer, inkludert den inverse Gauss-Newton-algoritmen anvendt i denne protokollen, som minimaliserer summen av kvadratene kostnadsfunksjonen av referansebildet, og bildet i henhold til korreksjon. Algoritmen er nyttig fordi den gjør det mulig hurtig og robust bevegelse korreksjon, ved hjelp av en GPU parallell plattform design for å redusere behandlingstiden 27.

For data rekonstruksjon i denne protokollen, var tilpasset skrevet programvare i et MATLAB miljø som brukes til todimensjonale slipe rekonstruksjon, der spiral prøvene er rekonstruert i k-space inn rutenett bilder 31-33. Seriedata Tid ble generert ved å beregne den prosentvise modulasjon av BOLD-signalet for hver voksel i forhold til grunnlinjen periode oppsamlet før stimulering. Lydelementer som tidsserier ble SYNchronized til blokker av optogenetic stimulering med en sammenheng verdi på 0,35 eller høyere ble definert som aktiverte voxels; denne sammenheng verdien tilsvarer mindre enn 10 -9 P-verdi 8. Koherens-verdier ble beregnet som størrelsen av Fourier-transformasjonen ved frekvensen av gjentatte stimuleringssykluser dividert med den sum-av-kvadrater av alle frekvenskomponenter 8,27. Familywise feilen kan styres med Bonferroni korreksjon for multiple sammenligninger. Alternative metoder for analyse kan anvendes, inklusive parametriske statistiske tester slik som de generelle lineære modeller (GLMs). Sammenhengen metoden krever mindre forkunnskaper i HRF sammenlignet med konvensjonelle generell lineær modell. Derfor er det en fordel når du utforsker data ved hjelp ofMRI. Imidlertid kan den sammenheng metoden kun brukes for data med blokk design eller hendelsesrelaterte design med en fast interstimulus intervall, og kan ikke brukes i ofMRI data med andre arrangement-related design eller blandede design. Deretter kan dynamisk kausal modellering (DCM) brukes til å analysere interaksjoner mellom hjerneregioner som er identifisert gjennom ofMRI. DCM er en Bayesiansk statistisk teknikk utviklet for analyse av funksjonell tilkobling fra system svar på eksperimentelle innganger under fMRI 34.

Ytterligere tekniske bekymringer for ofMRI er diskutert her. Implantater kan bli skadet eller falle av, noe som fører til fjerning av den aktuelle dyret fra studien. Re-implantasjon surgeries er ikke anbefalt på grunn av den ekstra usikkerheten rettet mot samme avkastning som i den opprinnelige implantasjon kirurgi og på grunn av dyrevelferd. På grunn av den betydelig mengde av tid og ressurser investert i hvert dyr gjenstand, hensyn til styrken av materialet er en betydelig bekymring når man velger en passende dentalsement for anvendelse i ofMRI studier. Implantasjon kirurgi er en kritisk faktor i å maksimere levetiden på implant og dyr gjenstand. For eksempel, slik at skallen er tørr før påføring av dental sement og plassere en tilstrekkelig mengde sement rundt keramisk hylse implantat kan sikre stabilitet over potensialet måneder lange tidslinjen av dyret i løpet av studien. I tillegg kan alternative bur design bli undersøkt og diskutert med den lokale dyr omsorg anlegget for å unngå bur med netting topper som holder mat og vann som ofte stikker inn i buret og gi muligheter for dyret å skade implantatet. Viktigere, må dental sement velges nøye for å redusere artefakter som påvirker bildebehandling og alternative sement kan testes ved søknad på en fantom og bildebehandling i en scanner før bruk i dyreforsøk. Prøving og feiling med ulike tann sementer har vist at den sement som brukes i denne protokollen gir relativt få gjenstander. En annen teknisk utfordring i å utføre ofMRI er nøyaktigheten av fiberoptisk plassering på den tiltenkte avkastning, gitt extrEmely små avstander som kan eksistere mellom kjerner i hjernen 35. Etter fullført implantasjon operasjoner, kan T2-vektet anatomiske skanner brukes til å bestemme riktig plassering av overliggende på en hjerne atlas. Ferdigheten av kirurgen og praksis utføre disse operasjonene kan forbedre riktig plassering priser. Spesifisitet og ekspresjon av opsin ved den beregnede ROI kan verifiseres ved avslutningen av undersøkelsen ved perfusert dyret og fiksering av hjerne, ved hjelp av immunohistokjemi eller den endogene fluorescensen til en reporter-protein merket til den opsin for visualisering. Disse rapportør proteinene kan også bli colocalized med andre proteiner for å sikre at opsin er uttrykt i de ønskede neurale celletyper 1,8,15,25. Som nevnt tidligere, kan det oppstå gjenstander ved utførelse ofMRI skyldes vev oppvarming fra lys levering 22. Vevet oppvarming fører til endring av avslapnings ganger, noe som resulterer i falske BOLD signal. For å sikre at acrings følge av lys stimulering i løpet av ofMRI er ikke på grunn av denne gjenstand, bør opsin-negative kontroller utføres i hvilken av enten saltvann injiserte dyr eller dyr injisert med kontroll fluoroforen vektorer (slik som AAV-CaMKIIa-EYFP) gjennomgår ofMRI. I tillegg bør bare godt konstruert fiberoptiske implantater med god lystransmisjon virkningsgrad anvendes for å fjerne behovet for å bruke høye laser krefter. ofMRI utført studier der falsk aktivering på grunn av vev oppvarming har ikke vært et problem 1,6-8,10,11.

Når det gjelder valg av vektor for å innføre de nødvendige optogenetic gener i nerveceller til uttrykk, er AAVs ikke kjent for å forårsake sykdom hos mennesker, og er derfor et praktisk alternativ, gitt lavere biosikkerhetsnivå kreves for å bruke disse legemidlene (BSL-1). I tillegg er en rekke vektor kjerner bære AAVs pakket med ulike optogenetic gener i lager og med flere serotyper. Den serotype av AAV må velges bdessuten økt på den tiltenkte cellepopulasjon mål å sikre optimale uttrykk nivåer 36,37. Lentiviruses kan også brukes men krever et høyere biosikkerhetsnivå. Tidsperioden som er nødvendig for tilstrekkelig ekspresjon av gener optogenetic er variabel, avhengig av den spesifikke dyremodell som brukes, av det spesielle AAV som brukes og av den spesifikke eksperimentelle paradigmet. I denne protokollen, Sprague Dawley rotter ved 11 uker gammel brukt og optogenetic studier begynner fire til seks uker etter virus injeksjon. Transgene mus kan også brukes i optogenetic studier. Det er nødvendig å utføre piloteksperimenter for å bestemme den spesifikke mengden av tid som kreves for tilstrekkelig ekspresjon av opsins. Stimulerings paradigmer kan variere avhengig av den spesifikke opsin anvendes. I denne protokollen, er AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP brukt og stimulering paradigmet er 20 sek på / 40 sek av. Ved hjelp av en SSFO, vil stimulering paradigmet variere fordi den SSFO krever bare en kort lyspuls for å være activated og deretter en kort puls av lys ved en annen bølgelengde som skal avsluttes.

En ytterligere viktig problem ved utføring av ofMRI hindrer lekkasje lyse fra hylsen implantat grensesnitt med den fiberoptiske patch-kabelen under optogenetic stimulering for å forhindre en forvirrende hjerne signal som stammer fra visuell stimulering, selv når dyret er bedøvet. Kjegler av svart elektrisk tape kan benyttes for å blokkere lyset fra hylsene og for å dekke øynene til dyret. Viktigere, må fysiologiske verdier inkludert ekspiratorisk CO 2 og kroppstemperaturen til individet være godt vedlikeholdt gjennom hele varigheten av bildebehandling. Ekspiratorisk CO 2 bør holdes mellom med 3 - 4%, og kroppstemperaturen på 37 ° C. I tillegg til de mellomlegg sekvensene redusere så mye som mulig inhomogeniteter i magnetfeltet før start ofMRI avsøker i stor grad bestemmer kvaliteten av de resulterende BOLD-data. Kontroll av disse faktoreneer avgjørende i å produsere pålitelige ofMRI data. I denne protokollen, DPSS lasere brukes som lyskilde for optogenetic stimulering. Fordi laserlys er sammenhengende, kan mer enn nok kraft være lett tilføres gjennom fiberoptikk. LED lyskilder som er koblet til optiske fibre er tilgjengelige fra kommersielle leverandører, men har den ulempe at de reduserte kraft av lystransmisjon. Laserlyskilden krever justering for hver enkelt fiberoptisk patch-kabel, men med praksis, kan justeringen utføres i løpet av sekunder til minutter.

Fremtidige anvendelser av ofMRI inkluderer bruk av neste-generasjons opsins som røde-skiftet opsins å aktivere non-invasiv stimulering under bildebehandling. I tillegg kan implantasjon av MRI-kompatible EEG eller lignende opptakselektroder sammen med den fiberoptiske implantatet tillater anskaffelse av høy temporal oppløsning data i tillegg til de høye romlige oppløsning data for MRI. ofMRI med electrophysiological opptak kan gi omfattende informasjon om den funksjonelle tilkobling av hjernen. I sammendrag, kraften av ofMRI å overvåke hele hjernen i respons til stimulering av spesifikke cellepopulasjoner som er definert ved genetisk eller anatomisk identitet gjør ofMRI en kritisk verktøy til bruk i studiet av nevrologiske sykdommer og av connectomics av ​​den friske hjernen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
7 Tesla scanner Agilent Technologies Discovery MR901 System
Sprague Dawley rats Charles River Crl:SD 11 weeks old
fiber cleaver Fujikura CT-05
multimode optical fiber Thor Labs AFS105/125Y
fiber stripper   Thor Labs T08S13
ceramic split sleeve Precision Fiber Products SM-CS1140S
epoxy glue Thor Labs G14250
cotton-tipped applicators Stoelting Co. 50975
multimode ceramic zirconia ferrules Precision Fiber Products MM-FER2002
FC/PC multimode connector Thor Labs 30128C3
fiber optic polishing disk Precision Fiber Products M1-80754
aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm Thor Labs LFG03P
aluminum oxide lapping sheet, 1 µm Thor Labs LFG1P
aluminum oxide lapping sheet, 3 µm Thor Labs LFG3P
binocular biological microscope 40X-1,000X Amscope B100
laser safety glasses Kentek KXL-62W01
473 nm DPSS laser Laserglow LRS-0473
594 nm DPSS laser Laserglow LRS-0594
Allen hex wrench set 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser
power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm Thor Labs PM121D
Isoflurane (Isothesia) Henry Schein  50033
isoflurane vaporizer with induction chamber VetEquip 901806
NanoFil 100 µl syringe World Precision Instruments NANOFIL-100
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller World Precision Instruments UMP3-1
function generator A.M.P.I.  Master-8
small animal stereotax David Kopf Instruments Model 940 
Model 683 small animal ventilator  Harvard Apparatus 550000
Type 340 capnograph  Harvard Apparatus 733809
dental drill (rotary micromotor kit) Foredom Electric Co. K.1070
ophthalmic ointment (Artificial Tears) Rugby 00536-6550-91
instrument sterilizer CellPoint Scientific Germinator 500 glass bead sterilizer
antibiotic powder Pfizer NEO-PREDEF neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride
buprenorphine painkiller Hospira NDC:0409-2012 schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lee, J. H., et al. Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring. Nature. 465 (7299), 788-792 (2010).
  2. Weitz, A. J., Lee, J. H. Progress with optogenetic functional MRI and its translational implications. Future Neurol. 8 (6), 691-700 (2013).
  3. Lee, J. H. Informing brain connectivity with optogenetic functional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 62 (4), 2244-2249 (2012).
  4. Lee, J. H. Tracing Activity Across the Whole Brain Neural Network with Optogenetic Functional Magnetic Resonance Imaging. Front. Neuroinform. 5 (October), 1-7 (2011).
  5. Kahn, I., et al. Characterization of the Functional MRI Response Temporal Linearity via Optical Control of Neocortical Pyramidal Neurons. J. Neurosci. 31 (42), 15086-15091 (2011).
  6. Takata, N., et al. Optogenetic Activation of CA1 Pyramidal Neurons at the Dorsal and Ventral Hippocampus Evokes Distinct Brain-Wide Responses Revealed by Mouse fMRI. PLoS ONE. 10 (3), e0121417 (2015).
  7. Iordanova, B., Vazquez, A. L., Poplawsky, A. J., Fukuda, M., Kim, S. -G. Neural and hemodynamic responses to optogenetic and sensory stimulation in the rat somatosensory cortex. J. Cereb. Blood Flow Metab. 35 (6), 922-932 (2015).
  8. Weitz, A. J., et al. Optogenetic fMRI reveals distinct, frequency-dependent networks recruited by dorsal and intermediate hippocampus stimulations. NeuroImage. 107, 229-241 (2015).
  9. Desai, M., et al. Mapping brain networks in awake mice using combined optical neural control and fMRI. J. Neurophysiol. 105 (December 2010), 1393-1405 (2011).
  10. Liang, Z., Watson, G. D. R., Alloway, K. D., Lee, G., Neuberger, T., Zhang, N. Mapping the functional network of medial prefrontal cortex by combining optogenetics and fMRI in awake rats. NeuroImage. 117 (0), 114-123 (2015).
  11. Byers, B., et al. Direct in vivo assessment of human stem cell graft-host neural circuits. NeuroImage. 114 (0), 328-337 (2015).
  12. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  13. Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat. Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
  14. Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3 (10), 785-792 (2006).
  15. Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
  16. Ogawa, S., Lee, T. M., Kay, A. R., Tank, D. W. Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24), 9868-9872 (1990).
  17. Ogawa, S., et al. Intrinsic signal changes accompanying sensory stimulation: functional brain mapping with magnetic resonance imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5951-5955 (1992).
  18. Kwong, K. K., Belliveau, J. W., et al. Dynamic magnetic resonance imaging of human brain activity during primary sensory stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5675-5679 (1992).
  19. Canals, S., Beyerlein, M., Murayama, Y., Logothetis, N. K. Electric stimulation fMRI of the perforant pathway to the rat hippocampus. Magn. Reson. Imaging. 26, 978-986 (2008).
  20. Antal, A., et al. Imaging artifacts induced by electrical stimulation during conventional fMRI of the brain. NeuroImage. 85 (3), (2014).
  21. Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nat. Neurosci. 16 (10), 1499-1508 (2013).
  22. Christie, I. N., et al. FMRI response to blue light delivery in the naïve brain: Implications for combined optogenetic fMRI studies. NeuroImage. 66, 634-641 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J. Neural Eng. 4, S143-S156 (2007).
  24. Pashaie, R., et al. Optogenetic brain interfaces. IEEE Rev. Biomed. Eng. 7, 3-30 (2014).
  25. Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
  26. Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19, 267-274 (2006).
  27. Fang, Z., Lee, J. H. High-throughput optogenetic functional magnetic resonance imaging with parallel computations. J. Neurosci. Meth. 218 (2), 184-195 (2013).
  28. Da Silva, F. L. EEG: Origin and measurement. EEG - fMRI: Physiological Basis, Technique, and Applications. , 19-38 (2010).
  29. Becker, K., et al. Low dose isoflurane exerts opposing effects on neuronal network excitability in neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 7 (6), 3-9 (2012).
  30. Nishikawa, K., Maciver, M. B. Agent-selective Effects of Volatile Anesthetics on GABA A Receptor - mediated Synaptic Inhibition in Hippocampal Interneurons. Anesthesiology. 94 (2), 340-347 (2001).
  31. Jackson, J. I., Meyer, C. H., Nishimura, D. G., Macovski, A. Selection of a convolution function for Fourier inversion using gridding. IEEE Trans. Med. Imag. 10 (3), 473-478 (1991).
  32. Glover, G. H., Lee, A. T. Motion artifacts in fMRI: comparison of 2DFT with PR and spiral scan methods. Magn. Reson. Med. 33 (20), 624-635 (1995).
  33. Kim, D. H., Adalsteinsson, E., Spielman, D. M. Simple analytic variable density spiral design. Magn. Reson. Med. 50, 214-219 (2003).
  34. Friston, K. J., Harrison, L., Penny, W. Dynamic causal modeling. Neuroimage. 19, 1273-1302 (2003).
  35. Alkire, M. T., McReynolds, J. R., Hahn, E. L., Trivedi, A. N. Thalamic microinjection of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat. Anesthesiology. 107 (2), 264-272 (2007).
  36. Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol. Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
  37. Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS ONE. 8 (9), 1-16 (2013).
  38. Liu, J., et al. Frequency-selective control of cortical and subcortical networks by central thalamus. eLife. 4, e09215 (2015).

Tags

Neuroscience optogenetics funksjonell magnetisk resonans imaging (fMRI) optogenetic fMRI (ofMRI) nevrovitenskap hjerne dyp hjernestimulering (DBS)
Optogenetic Funksjonell MRI
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lin, P., Fang, Z., Liu, J., Lee, J.… More

Lin, P., Fang, Z., Liu, J., Lee, J. H. Optogenetic Functional MRI. J. Vis. Exp. (110), e53346, doi:10.3791/53346 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter