Introduction
Optogenetic funktionell magnetisk resonanstomografi (ofMRI) är en ny teknik som kombinerar den rumsliga upplösningen i hög fält fMRI med precision optogenetic stimulering 1-11,38, möjliggör celltyp-specifik kartläggning av funktionella nervbanor och deras dynamik i hela hjärna. Optogenetik möjliggör specifika celltyper som riktas för stimulering av införandet av ljuskänsliga transmembran konduktans kanaler, som kallas opsins. Specifika delar av neurala kretsar är genetiskt modifierade för att uttrycka dessa kanaler, vilket möjliggör millisekund-tidsplan modulering av aktivitet i den intakta hjärnan 1-15. fMRI tillhandahåller en icke-invasiv metod för att bestämma hjärnans globala dynamiska svar på optogenetic stimulering av specifika nervbanor genom mätning av signal blod-syre-nivåberoende (FET) 16 till 18, som ger en indirekt mätning av neuronal aktivitet.
Kombinationen av dessa två tekniker, benämnda optogenetic funktionell magnetisk resonanstomografi (ofMRI), är fördelaktig jämfört med andra metoder för att registrera hjärnans aktivitet under stimulering, såsom elektrofysiologi eftersom det kan ge en bild av hela hjärnan vid relativt hög rumslig upplösning. Detta möjliggör detektion av neuronal aktivitet som svar på riktad stimulering på stora avstånd från platsen för stimuleringen utan behov för implantation av invasiva registreringselektroderna 1-11. ofMRI är fördelaktig jämfört med mer traditionella metoden att utföra elektrisk stimulering under fMRI, som kan rekrytera olika celltyper nära elektroden och sålunda förvirra den kausala påverkan av varje population 19. Dessutom elektrod används för elektrisk stimulering och den genererade strömmen kan producera artefakter under MR-avbildning 20. I själva verket, ofMRI möjliggör observation av påverkan på den globala hjärnaktivitet från den specifika modulatipå av en stor mångfald av celltyper genom användning av avancerade genetiska inriktningstekniker såsom Cre-Lox-systemet i transgena djur eller användning av promotorer. Kombinato optisk styrning med hela hjärnan övervakning är möjlig med ofMRI genom användning av både NpHR att inhibera och ChR2 att excitera specifika celltyper. Den optogenetic verktyg tillgängliga för användning i ofMRI också snabbt förbättras över tiden med införandet av opsins med ökad ljuskänslighet eller förbättrade kinetiken av stabiliserade steg funktions opsins (SSFOs) eller av röda skiftade opsins som kan förneka behovet av implanterad fiber optik, vilket möjliggör icke-invasiv stimulering under avbildning 21. Dessa möjligheter är inte tillgängliga med elektrisk stimulering.
Emellertid har signalartefakter som resulterar från vävnadsuppvärmning på grund av ljus leverans i hjärnan har rapporterats 22, där temperaturframkallad modifiering av relaxationstider har visat sig producera pseudo aktivering. Forskare utför ofMRI bör därför vara medvetna om denna potential FÖRVÄXLA. Med rätt inställning och kontroll, kan problemet lösas. Dessutom kan relativt låg tidsupplösning för att mäta den hemodynamiska svaret i fMRI vara en begränsande faktor för vissa tillämpningar av denna teknik.
Detta protokoll först beskriver konstruktionen av de fiberoptiska implantat som möjliggör leverans av specifika våglängder av ljus djupt in i hjärnan in vivo. Protokollet beskriver sedan leveransen av opsin-kodande viral vektor till en exakt hjärna region med stereotaktisk kirurgi. Nästa protokollet beskriver processen för hela hjärnan funktionell MRI under samtidig lätt stimulering. Slutligen beskriver protokollet grundläggande dataanalys av de förvärvade data.
Notera den optogenetik beskrivs här kräver en kronisk implantat för ljus leverans. Emellertid de fiberoptiska implantat är stabila och bio-kompatibla, vilket möjliggör longitudinell skanning och undersökning av neurala kretsar under en period på några månader 23,24.
Sammanfattningsvis den exakta stimulering och hela hjärnan övervakning förmåga ofMRI är avgörande faktorerna för att göra ofMRI ett kraftfullt verktyg för att studera de connectomics av hjärnan. Dessutom kan det tillhandahålla nya insikt i de mekanismer av neurologiska sjukdomar 25 när den kombineras med ett flertal djurmodeller. I själva verket har ofMRI använts för att belysa nätverksaktivitet distinkta hippocampus regioner i samband med kramper 8. Därför kommer laboratorier som är intresserade av att svara på systemnivå neurovetenskap frågor hitta denna teknik av betydelse.
Protocol
Etik uttalande: Experimentella förfaranden här har godkänts av Stanford University Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC).
1. Förbereda Patch Kablar och beslaget implantat
Obs! Även om kopplingskablar och beslag implantat är kommersiellt tillgängliga, som producerar dessa in-house möjliggör special design och kommer att kosta mindre.
- För att framställa en fiber patch-kabel för att leverera ljuset från lasern till implantatet i hjärnan, först klyva den optiska fibern till den önskade längden.
- Med hjälp av en fiber köttyxa, avsluta den optiska fibern för att producera en platta änden på anslutningspunkten. Om fibern har belagts med en mantel, skala jackan med en fiberskalningsverktyg i förväg.
- Klyva andra änden av den optiska fibern för att producera den önskade längden för kabeln, vilket säkerställer att kabeln är tillräckligt lång för att sträcka sig från ljuskällan till djuret inuti hålet hosskannern.
- Blanda en liten mängd epoxi lim i en 1: 1-förhållande på en bit aluminiumfolie strax innan nästa steg, eftersom epoxilim blir alltför viskös för användning 5 minuter efter blandning.
- Med användning av en liten träpinne, försiktigt på epoxilim på den del av fibern som kommer att placeras inuti den konkava sidan av den keramiska hylsan och sedan applicera en liten droppe på ytan av den platta sidan av hylsan. Efter att ha satt in den i hylsan, se till att en liten fiberlängd (<0,5 mm) skjuter ut från den platta sidan av den keramiska hylsan. Tillåt epoxin lim att härda O / N för optimala resultat.
- På sidan av fiberoptiska patch-kabel som ansluter till laserljuskällan, försiktigt tillämpa epoxilim till den del av fiber som kommer att placeras i den konkava sidan av hylsan av FC / PC-kontakt och sedan använda en liten falla på ytan av den platta sidan av hylsan. Efter att ha satt in den i hylsan, seatt en liten längd av fiber (<0,5 mm) skjuter ut från den plana sidan av hylsan. Tillåt epoxin lim att härda O / N för optimala resultat.
- Polera den platta änden av hylsor för båda sidor av kabeln med en polering disk genom att använda pincett för att tillämpa mild nedåtriktat tryck på hylsan samtidigt som siffran 8 rotationer på aluminiumoxid lappande ark (från 3 pm till 1 pm till 0,3 pm grit ).
- Undersöka den platta änden av hylsan med ett mikroskop vid 100 gångers förstoring. Se till att ytan på den platta änden, inklusive den fiberoptiska själva ytan, är fri från varje epoxilim; fortsätta polering om epoxilim kvar på ytan. Se till att den fiberoptiska ytan inte har brutit eller flisas.
VARNING: Se till personal vidta lämpliga laserskydds utbildningar och bära laserskyddsglasögon innan du hanterar laserutrustning. - Anslut den fiberoptiska patchkabeln till laserljuskällan genom FC / PC-kontakt och passa in fIber spets till brännpunkten av kopplaren. Mäta ljussändningseffekten av fibern med en effektmätare för att säkerställa tillräcklig ljuseffekt.
Obs: Följande steg är för framställning av keramiska hylsor med fiberoptik för kronisk implantation i hjärnan; keramiska skoningar är ihåliga i mitten och bär fiberoptik för att leverera ljus från en anslutningskabel till en region av intresse (ROI) i hjärnan. - Med hjälp av en fiber köttyxa, avsluta den optiska fibern för att producera en platta änden på anslutningspunkten. Om fibern har belagts med en mantel, skala jackan med en fiberskalningsverktyg i förväg.
- Klyva andra änden av den optiska fibern för att producera den önskade längden för implantation in i hjärnan. Bestämma längden av fibern med användning av en stereotaxisk atlas att rikta ROI i hjärnan.
- Till exempel: att rikta rygg hippocampus hos råtta som är 3,5 mm under bregma, se till att längden av fibern sticker ut från ferrule är 3,5 mm + 0,25 mm, som står för skallen tjocklek och möjliggör felmarginalen. Kontrollera därför att den slutliga fiberlängden är 3,5 mm + 0,25 mm + 10,5 mm (längd av hylsan) = 14,25 mm.
- Blanda en liten mängd epoxi lim i en 1: 1-förhållande på en bit aluminiumfolie kort före nästa steg (epoxi lim blir alltför viskös för användning 5 minuter efter blandning).
- Med användning av en liten träpinne, försiktigt på epoxilim på den del av fibern som kommer att placeras inuti den konkava sidan av den keramiska hylsan och sedan applicera en liten droppe på ytan av den platta sidan av hylsan. Efter att ha satt in den i hylsan, se till att en liten fiberlängd (<0,5 mm) skjuter ut från den platta sidan av den keramiska hylsan. Tillåt epoxin lim att härda O / N för optimala resultat.
- Polera den platta änden av hylsan med hjälp av en polering skiva med hjälp av pincett för att tillämpa mild nedåtriktat tryck på hylsan samtidigt som figur-8 rotations på aluminiumoxid lappande ark (från 3 pm till 1 pm till 0,3 pm grit).
- Undersöka den platta änden av hylsan med ett mikroskop vid 100 gångers förstoring. Se till att ytan på den platta änden, inklusive den fiberoptiska själva ytan, är fri från varje epoxilim; fortsätta polering om epoxilim kvar på ytan. Se till att den fiberoptiska ytan inte har brutit eller flisas.
- Par den polerade hylsan till en fiberoptisk patchkabel med en hylsa hylsan och anslut anslutningskabeln till en laserljuskällan. Mäta ljusöverföringseffekt på spetsen av fibern med en effektmätare för att säkerställa tillräcklig effektivitet.
- Håll en logg över uteffekt som krävs från plåstret kabelns hylsa för varje hylsa implantat för att mata ut önskad effektnivå vid spetsen av den fiberoptiska (2,5 mW i detta protokoll). Släng hylsor med en dämpningsgrad på över 50% och med icke-cirkulär utgångsmönster.
2. Stereotaxic Implantation Kirurgi och virus Injection
- Se till att alla experimentella undersökningar som omfattar användning av djur har godkänts av lokala IACUC. Upprätthålla aseptiska förhållanden under överlevnad operationer genom att följa aseptiska förfaranden, bland annat med hjälp av sterila handskar, sterila masker, sterila kirurgiska draperier och steriliserade kirurgiska instrument.
VARNING: Se till att kirurger bär lämplig personlig skyddsutrustning (PPE), inklusive skyddsglasögon innan proceduren påbörjas. Följ standard biosäkerhet förfaranden när man arbetar med adenoassocierat vektor (AAV), var noga med att undvika stänk. Kassera AAV avfall i en behållare för biologiskt riskavfall. - Ladda en mikroliter spruta med tillräckligt AAV för injektion i djuret plus extra att ta hänsyn till eventuella volymförluster (totalt 4 pl per djur), håll sprutan på is före användning. I detta protokoll är AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP vid en titer av 4x10 12 vg / ml används. Placera djuret under isoflurane anestesi med en induktionskammare, ansluten till en precisions isofluran förångare inställd på 3-4% med en syrgaskälla.
- Raka huvudet med en elektrisk rakapparat och utföra en trippel kirurgisk scrub på huden med hjälp av Betadine och 70% etanol skölj.
- När djuret är i djup anestesi (kontrollera tå reflex och andningsfrekvens), immobilisera djurets skallen i en stereotaktisk apparat med intra-aural positioneringsstift och tand bar.
Obs: Hela proceduren tar 1-2 h, från anestesi induktion till återhämtning. - Ställa in anestesi till en lämplig nivå (1 - 3% isofluran på förångaren) och kontinuerligt övervaka djurets vitala tecken, justera anestesi efter behov för att upprätthålla en andningshastighet av ~ 40 andetag / min. Administrera oftalmologiska salva på ögonen på djuret för att förhindra torrhet under narkos.
- Gör en 15-20 mm mittlinje hårbotten snitt med en skalpell och dra in hårbotten med hjälp av kirurgiska peanger enttached till periostet. Referens lambda och bregma att positionera borrkronan över koordinaterna för ROI.
- Borra ett litet kraniotomi (2-3 mm) över ROI med en tandläkarborr, noga med att inte punktera hjärnan. Långsamt in nålen ansluten till mikroliter sprutan genom kraniotomi till ROI i hjärnan.
- Med en mikropumpstyrning, injicera 2 pl av vektorn lösning i ROI. Använda en flödeshastighet av 150 Nl / min för att undvika vävnadsskada. Efter injektionen är slutförd, vänta 10 minuter innan du tar bort sprutan långsamt, med en hastighet av 0,5 mm / min.
- Efter injektion, torka ytan av skallen. Referens lambda och bregma för att bekräfta koordinater och sedan in beslaget implantatet till målet djup (till exempel: 3,5 mm under bregma för rygg hippocampus) med en hastighet av ca 0,5 mm / min. Montera beslaget implantatet skallen med tandcement. Efter det dentala cement har stelnat, täta incisionen med suturer (size 5-0 för råttor) runt dentala cement locket.
- Efter operation, placera djuret i sin bur för sig ligger med halva buren på toppen av en värmare för anestesi återhämtning. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräcklig medvetenhet för att upprätthålla sternala VILA. Placera inte djuret i sällskap med andra djur förrän den har återhämtat sig helt.
- För postkirurgisk behandling av smärta, administrera buprenorfin subkutant varje 12 h vid en dos av 0,05 mg / kg under 24 timmar. Administrera antibiotiskt pulver dagligen under incisionsstället under 3 dagar.
- Ta bort suturerna ungefär två veckor efter operationen för att förhindra strejkbryteri.
- Vänta 4 - 6 veckor efter virusinjektion för tillräcklig expression av optogenetic gener innan du utför experiment.
3. optogenetic Funktionell MRI
VARNING: Var försiktig runt den permanenta magnetfält en magnetkamera. säkra equipment, inklusive funktionsgenerator, ljuskälla, fläkt, kapnografen och gastankar, tillräckligt långt bort (åtminstone bortom 5 Gauss gräns).
- Placera djuret under gas anestesi med en induktionskammare, ansluten till en precisions isofluran förångare inställd på 5% med en syrgaskälla.
- När djuret är i djup anestesi (check tå reflex och andningsfrekvens), intuberas djuret enligt protokollet beskrivs i Rivard et al. (2006) för att möjliggöra övervakning av koldioxid kapnografi 26. Obs: intubation är kritisk för att upprätthålla passande nivåer av utandnings CO2 under avbildning.
- Säkra djuret i skannern vaggan.
Obs: I detta protokoll, var vaggan anpassade produceras men sådana vaggor är också kommersiellt tillgängliga. Råttan vaggan funktioner för att säkerställa djuret i skannern för leverans av anestesi, uppvärmd luft och för begränsning av rörelse. - Leverera en blandning av isofluran (Ranging 1,2-1,5%) i ca 60% kväveoxid och 40% syre via slangen genom vaggan. Se till att djurets huvud är ordentligt fastsatt för att undvika rörelseartefakter.
- Tillhandahålla uppvärmd luft genom slangen i hållaren och sätt i en rektal termometer med smörjmedel för att övervaka kroppstemperaturen. Administrera oftalmologiska salva på ögonen på djuret för att förhindra torrhet under narkos.
- Anslut den fiberoptiska patchkabeln till en laserljuskällan och mäta produktionen vid spetsen av plåstret kabelns hylsa med en kraftmätare.
- Justera till lämplig effektnivå (bestämt tidigare i steg 1,15) för att producera den önskade utsignalen (2,5 mW i detta protokoll) vid spetsen av den fiberoptiska implanterade inne i hjärnan. Eftersom överdriven effektuttag från den fiberoptiska potentiellt kan orsaka vävnadsskada i hjärnan eller orsaka vävnads uppvärmning som kommer att producera signalartefakter, inte signifikant öka uteffekten hos lasernbortom den avsedda utsignalen.
- Förhindra ljusläckage från implantatet med en kon av svart elektrisk tejp och täcka ögonen hos djuret. Koppla den fiberoptiska kabeln till hylsan implantatet på djuret med en skoning hylsa.
- Placera spolen över huvudet på djuret. Sätt i hållaren med djuret in i hålet i skannern.
Obs: I detta protokoll, single-loop-sändnings får spolen var anpassade produceras och förstämd att få den optimala radiofrekvens från hjärnvävnad. - Övervaka andning och kroppstemperatur under hela denna process, justera den artificiella ventilatorn och värmare som behövs för att hålla fysiologiska värden inom vissa gränser (se till att utandnings CO2 är 3-4% genom att vrida rattarna på ventilatorn att justera slagfrekvens och volym och att temperatur är 37 ° C genom att klicka på pilarna för temperaturinställning).
- Välj en positioneringssekvens för att avbilda djurhuvud plats. Om Bregn är inte på iso-centrum, justera djurhuvud plats och upprepa positioneringsskanningen tills hjärnan är i iso-centrum. Välj en linjär mellanlägg sekvens och klicka på lasten i fönstret sekvens val av. Klicka sedan börja minska inhomogeniteter i magnetfältet.
Notera: mellanlägg är ett kritiskt steg som direkt kommer att påverka integriteten hos fMRI data. - Välj en T2-viktad sekvens och klicka på lasten i fönstret sekvens val av. Klicka sedan börja förvärva T2-viktade högupplösta koronala anatomiska bilder före fMRI att kontrollera den totala integriteten av hjärnan och att bekräfta placeringen av implantatet den optiska fibern.
Notera: Dessa bilder kan användas som anatomi över för ofMRI scan serien. - Anslut BNC-kablar från den utlösande porten på MRI skannern till funktionsgeneratorn, så att laserljuskällan drivs i enlighet med en experimentell stimulering paradigm.
Obs: I detta protokoll, stimulering pAradigm är 30 sekunder av baslinjen, följt av 20 sekunder på / 40 sek av för sex minuter. - Välj en multi-slice gradient påminde eko (GRE) sekvens och klicka på lasten i fönstret sekvens val av. Därefter klickar börja förvärva 35 mm x 35 mm (2D FOV) i planet koronala skivor med 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm rumslig upplösning.
Obs! GRE sekvens som används här har en repetitionstid (TR) och eko tid (TE) av TR / TE = 750/12 ms och en 30 ° flip-vinkel. - Vid slutet av skanningen, ta bort djuret från skannern och övervaka tills den har vaknat ur anestesi och kan upprätthålla sternala VILA.
4. ofMRI Dataanalys
Obs: Följande steg utförs i MATLAB som beskrivs i en publikation på hög genomströmning ofMRI 27.
- Efter råscanningsdata har överförts till den dator som används för analys, använder skjutfönster rekonstruktion för att uppdatera bilden varje TR, meden fyra-inter spiral avläsning, 750 ms TR och 12 ms eko tid att förvärva 23 skivor per skanning serie. I stället för konventionell rekonstruktion där nya fMRI bilder rekonstrueras först efter att alla interfolierar förvärvas för varje skiva, rekonstruerar det glidande fönstret återuppbyggnaden metod bilder efter förvärvet av varje mellanskikt 27.
- Bearbeta rådata för tvådimensionell gridding rekonstruktion, rörelse korrigering och beräkning av tidsserier som beskrivits tidigare 27.
- Använda en tröskel samstämmighet metod för att bestämma aktiverade voxlar genom att beräkna den procentuella moduleringen av BOLD signalen för varje voxel i förhållande till referensperioden uppsamlades före stimulering såsom beskrivits tidigare 27. Beräkna konsekvensen värden som storleken av fouriertransformen vid frekvensen av upprepade stimuleringscykler dividerat med summan-av-kvadraterna av alla frekvenskomponenter 8.
- Använda data tidsserie för varje vOxel genomsnittliga rörelse korrigerade bilder som tillhör varandra följande svep av samma stimulans paradigm först. Rikta sedan de genomsnittliga 4D bilder till ett gemensamt koordinatsystem ram med en sex graders frihets stel kropp transformation plus isotropisk skalning för jämförelse inom och mellan djur som beskrivits tidigare 27.
Representative Results
Figur 1 och figur 2 visar representativa data från 20 Hz (15 msek pulsbredd, 473 nm, 30% arbetscykel) optogenetic stimulering av motoriska cortex. Ett stimuleringsparadigm 30 sekunder baslinjen följt av 20 sekunder på / 40 sek av för sex minuter användes. Tidigare studier har visat att denna paradigm alstrar robust BOLD signal från optogenetic stimulering 1,8. Figur 1 visar aktiverade voxlar detekterade både på den lokala platsen för stimulering (motor cortex) och i thalamus, som ett resultat av den långväga synaptiska förbindelser mellan dessa regioner. Figur 2 visar att tids information kan samlas ihop från HRFs eftersom talamisk svaret fördröjs (lägre initial lutning) jämfört med motoriska cortex svar efter optogenetic stimulering.
p_upload / 53.346 / 53346fig1.jpg "/>
Figur 1. Aktivering Karta över BOLD signal inducerad av optogenetic Stimulering av CaMKIIa-uttryckande celler i Motor Cortex. Samstämmighet värden för aktiva voxels, som identifierats som de betydligt synkroniserade upprepade stimuli, visas överlagras på en T2-viktade coronal anatomisk skiva. Data samlas in under en sex min, 30 sek period (första 30 sek baslinjen och sex stimuleringscykler 20 sek på / 40 sek av med 473 nm ljus, 20 Hz, 15 msek pulsbredd) kondenseras i en aktiveringskarta. Sekventiella skivor är 0,5 mm från varandra och placeringen av fiberoptiska implantatet betecknas med triangeln. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Rörelse av ämnet under avbildning är en betydande källa till artefakt som kan leda till att data skadas. Lämpligt säkra djuret på bild vaggan kan minimera sådana artefakter som kommer upprätthålla lämpliga anestesinivåer. Här har vi använt isofluran men alternativa anestetika, såsom medetomidin eller ketamin och xylazin, bör också övervägas. Däremot kan nivåerna och val av anestesi påverka många parametrar i hjärnan, inklusive BOLD svaret 28. Isofluran kan orsaka förändringar i neuronal retbarhet 29. Andra anestetika kan också påverka GABA synaptiska hämning 30. Således är valet av anestesi viktigt när som utför ofMRI med tanke på dess förmåga att påverka nervaktivitet. ofMRI i frånvaro av anestesi är möjligt, men kan vara utmanande med ökad rörelse från djuret, som kan reduceras om djuret är vana; sådana vaken ofMRI studier har tidigare utförts ennd skulle undvika feltolkning på grund av anestesi på hjärnan 9,10. Efterbehandling rörelse korrektionsalgoritmer kan användas för att i hög grad mildra effekterna av rörelse. Flera av dessa metoder finns, inklusive den inversa Gauss-Newton-algoritmen som används i detta protokoll, vilket minimerar summan av kvadraterna kostnadsfunktionen för referensbilden och bilden under korrigering. Algoritmen är användbart eftersom det möjliggör snabb och robust rörelse korrigering, med hjälp av en GPU parallell plattform design för att minska handläggningstiderna 27.
För återuppbyggnad data i detta protokoll, var specialskriven mjukvara i en MATLAB miljö som används för tvådimensionell gridding rekonstruktion, där spiral prover rekonstrueras i k-space i inrutade bilder 31-33. tidsseriedata genererades genom att beräkna procent modulering av BOLD signal för varje voxel i förhållande till referensperioden samlas före stimulering. Voxlar vars tidsserierna synchronized block med optogenetic stimulering med samstämmighet värde på 0,35 eller högre definierades som aktiverade voxlar; denna samstämmighet värde motsvarar en mindre än 10 -9 P-värde 8. Koherens-värden beräknades som storleken av fouriertransformen vid frekvensen av upprepade stimuleringscykler dividerat med summan-av-kvadraterna av alla frekvenskomponenter 8,27. Familywise felet kan styras med Bonferroni korrigering för multipla jämförelser. Alternativa analysmetoder kan användas, inklusive parametriska statistiska tester såsom allmänna linjära modeller (GLMS). Samstämmigheten metod kräver mindre förkunskaper om HRF jämfört med den konventionella allmänna linjära modellen. Därför är det fördelaktigt när utforska data med ofMRI. Däremot kan samstämmigheten metoden endast användas för data med blockera mönster eller valda händelserelaterade mönster med en fast interstimulus intervall och kan inte användas i ofMRI data med andra händelse relaTed designar eller blandade mönster. Därefter kan dynamisk orsaks modellering (DCM) användas för att analysera interaktioner mellan områden i hjärnan som identifierats genom ofMRI. DCM är en Bayesiansk statistisk teknik som utvecklats för analys av funktionell anslutning via systemsvar till experimentella ingångar under fMRI 34.
Ytterligare tekniska problem för ofMRI diskuteras här. Implantat kan skadas eller falla bort, vilket leder till avlägsnande av den drabbade djuret från studien. Re-implantation operationer rekommenderas inte på grund av den ytterligare osäkerhet att rikta samma ROI som i den ursprungliga implantationskirurgi och på grund av djurskyddsfrågor. På grund av den betydande mängd tid och resurser investeras i varje djurindivid, är hänsyn till materialets hållfasthet en betydande oro när man väljer en lämplig dentalcement för användning i ofMRI studier. Implantationen kirurgi är en kritisk faktor för att maximera livslängden av den implant och djurpatient. Till exempel, se till att skallen är torr innan dentalcement och placera en tillräcklig mängd cement runt den keramiska hylsan implantatet kan garantera stabilitet över potentiella månader långa tidslinjen för djuret under studien. Dessutom kan alternativa bur mönster undersökas och diskuteras med den lokala djurvård möjlighet att undvika burar med tråd toppar håller mat och vatten som ofta sträcker sig in i buren och ge möjligheter för djuret att skada implantatet. Viktigt, måste dentalcement väljas med omsorg för att minska artefakter som påverkar imaging och alternativa cement kan testas genom applicering på en fantom och bildbehandling i en scanner före användning i djurförsök. Trial and error med olika tandcement har visat att cement som används i detta protokoll ger relativt få artefakter. En annan teknisk utmaning i att utföra ofMRI är noggrannheten av den fiberoptiska placering vid den avsedda ROI, med tanke på extremely små avstånd som kan finnas mellan kärnor i hjärnan 35. Efter avslutad implantation operationer kan T2-viktade anatomiska skannar användas för att bestämma korrekt placering genom att lägga på en hjärna atlas. Skicklighet kirurgen och praxis att utföra dessa operationer kan förbättra korrekt placering priser. kan verifieras specificiteten och uttryck av opsin vid den avsedda ROI vid slutet av studien genom perfusion djuret och fastställande av hjärnan med hjälp av immunohistokemi eller endogena fluorescens av en reporter-protein taggade till opsin för visualisering. Dessa rapportörproteiner kan även samlokaliserades med andra proteiner för att säkerställa att opsin uttrycks i de önskade neurala celltyper 1,8,15,25. Som tidigare nämnts, kan artefakter uppstå när du utför ofMRI på grund av uppvärmning av vävnad från ljus leverans 22. Vävnads uppvärmning orsakar modifiering av relaxationstider, vilket resulterar i falsk BOLD signal. Att se till att activation till följd av ljus stimulering under ofMRI är inte på grund av denna artefakt, bör opsin-negativa kontroller utföras i vilken antingen saltlösning injicerade djur eller djur som injicerats med kontroll fluorofor vektorer (såsom AAV-CaMKIIa-EYFP) genomgå ofMRI. Dessutom bör endast väl konstruerat fiberoptiska implantat med god ljustransmission verkningsgrad användas för att ta bort behovet av att använda höga lasereffekter. ofMRI studier har genomförts där falsk aktivering på grund av uppvärmning av vävnad har inte varit ett problem 1,6-8,10,11.
När det gäller valet av vektor för att införa de nödvändiga optogenetic gener i neuroner för expression, är AAV inte kända för att orsaka sjukdom hos människor och är därför ett bekvämt alternativ, med tanke på den lägre skyddsnivå som krävs för att använda dessa medel (BSL-1). Dessutom har en mängd vektorkärnor bär AAV förpackade med olika optogenetic gener i lager och med flera serotyper. Serotyp AAV måste väljas bvisar därmed den avsedda cellpopulationen mål att säkerställa optimala expressionsnivåer 36,37. Lentivirus kan också användas, men kräver en högre skyddsnivå. Den tidsperiod som krävs för tillräcklig expression av de optogenetic gener är variabel beroende på den specifika djurmodell som används, på den speciella AAV som används och på den specifika experimentella paradigm. I detta protokoll är Sprague Dawley råttor vid 11 veckor gamla användas och optogenetic studier börjar fyra till sex veckor efter virusinjektion. Transgena möss kan även användas i optogenetic studier. Det är nödvändigt att utföra pilotförsök för att bestämma den specifika tid som krävs för tillräcklig expression av opsins. Stimulering paradigm kan variera beroende på den specifika opsin används. I detta protokoll är AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP används och stimulans paradigm är 20 sekunder på / 40 sek av. Om du använder en SSFO kommer stimulerings paradigm variera eftersom SSFO kräver endast en kort ljuspuls att vara acveras och sedan en kort puls av ljus vid en annan våglängd, som skall avslutas.
En ytterligare kritisk oro när du utför ofMRI hindrar ljusläckage från hylsan implantat gränssnitt med fiberoptiska patch-kabel under optogenetic stimulering för att förhindra en confounding hjärna signal som härrör från visuell stimulans, även när djuret bedövas. Koner av svart eltejp kan användas för att blockera ljuset från hylsorna och för att täcka ögonen på djuret. Viktigt, måste fysiologiska värden inklusive utandnings CO2 och kroppstemperatur av ämnet underhållas under hela bild. Expiratorisk CO 2 bör hållas mellan 3-4% och kroppstemperaturen vid 37 ° C. Dessutom, för att kompensations sekvenserna minska så mycket inhomogenitet som möjligt i det magnetiska fältet före start ofMRI skannar kraftigt avgör kvaliteten på de resulterande BOLD data. Kontroll av dessa faktorerär avgörande för att producera tillförlitliga ofMRI uppgifter. I detta protokoll är DPSS lasrar används som ljuskälla för optogenetic stimulering. Eftersom laserljus är sammanhängande, kan mer än tillräckligt med kraft lätt levereras via fiberoptik. LED-ljuskällor som är kopplade till fiberoptik är tillgängliga från kommersiella leverantörer, men har nackdelen av att minskade kraften i ljustransmission. Laserljuskällan kräver anpassning till varje enskild fiberoptisk patchkablage, men med övning kan anpassning ske inom några sekunder till minuter.
Framtida tillämpningar av ofMRI inkluderar användningen av nästa generations opsins såsom röda skiftade opsins för att möjliggöra icke-invasiv stimulering under avbildning. Dessutom kan implantation av MR-kompatibel EEG eller liknande inspelningselektroder tillsammans med den fiberoptiska implantatet möjliggöra förvärv av hög tidsupplösning uppgifter utöver de hög rumslig upplösning data för MRI. ofMRI med electrophysiological inspelning kan ge omfattande information om den funktionella anslutning av hjärnan. Sammanfattningsvis, makt ofMRI att övervaka hela hjärnan som svar på stimulering av specifika cellpopulationer definieras av genetiska eller anatomiska identitet gör ofMRI ett kritiskt verktyg att använda i studiet av neurologiska sjukdomar och de connectomics av frisk hjärna.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
| Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
| fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
| multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
| fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
| ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
| epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
| cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
| multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
| FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
| fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
| aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
| aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
| aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
| binocular biological microscope 40X-1,000X | Amscope | B100 | |
| laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
| 473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
| 594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
| Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
| power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm | Thor Labs | PM121D | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
| isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
| NanoFil 100 µl syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
| Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
| dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
| instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
| antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
| buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock |
References
- Lee, J. H., et al. Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring. Nature. 465 (7299), 788-792 (2010).
- Weitz, A. J., Lee, J. H. Progress with optogenetic functional MRI and its translational implications. Future Neurol. 8 (6), 691-700 (2013).
- Lee, J. H. Informing brain connectivity with optogenetic functional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 62 (4), 2244-2249 (2012).
- Lee, J. H. Tracing Activity Across the Whole Brain Neural Network with Optogenetic Functional Magnetic Resonance Imaging. Front. Neuroinform. 5 (October), 1-7 (2011).
- Kahn, I., et al. Characterization of the Functional MRI Response Temporal Linearity via Optical Control of Neocortical Pyramidal Neurons. J. Neurosci. 31 (42), 15086-15091 (2011).
- Takata, N., et al. Optogenetic Activation of CA1 Pyramidal Neurons at the Dorsal and Ventral Hippocampus Evokes Distinct Brain-Wide Responses Revealed by Mouse fMRI. PLoS ONE. 10 (3), e0121417 (2015).
- Iordanova, B., Vazquez, A. L., Poplawsky, A. J., Fukuda, M., Kim, S. -G. Neural and hemodynamic responses to optogenetic and sensory stimulation in the rat somatosensory cortex. J. Cereb. Blood Flow Metab. 35 (6), 922-932 (2015).
- Weitz, A. J., et al. Optogenetic fMRI reveals distinct, frequency-dependent networks recruited by dorsal and intermediate hippocampus stimulations. NeuroImage. 107, 229-241 (2015).
- Desai, M., et al. Mapping brain networks in awake mice using combined optical neural control and fMRI. J. Neurophysiol. 105 (December 2010), 1393-1405 (2011).
- Liang, Z., Watson, G. D. R., Alloway, K. D., Lee, G., Neuberger, T., Zhang, N. Mapping the functional network of medial prefrontal cortex by combining optogenetics and fMRI in awake rats. NeuroImage. 117 (0), 114-123 (2015).
- Byers, B., et al. Direct in vivo assessment of human stem cell graft-host neural circuits. NeuroImage. 114 (0), 328-337 (2015).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat. Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3 (10), 785-792 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ogawa, S., Lee, T. M., Kay, A. R., Tank, D. W. Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24), 9868-9872 (1990).
- Ogawa, S., et al. Intrinsic signal changes accompanying sensory stimulation: functional brain mapping with magnetic resonance imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5951-5955 (1992).
- Kwong, K. K., Belliveau, J. W., et al. Dynamic magnetic resonance imaging of human brain activity during primary sensory stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5675-5679 (1992).
- Canals, S., Beyerlein, M., Murayama, Y., Logothetis, N. K. Electric stimulation fMRI of the perforant pathway to the rat hippocampus. Magn. Reson. Imaging. 26, 978-986 (2008).
- Antal, A., et al. Imaging artifacts induced by electrical stimulation during conventional fMRI of the brain. NeuroImage. 85 (3), (2014).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nat. Neurosci. 16 (10), 1499-1508 (2013).
- Christie, I. N., et al. FMRI response to blue light delivery in the naïve brain: Implications for combined optogenetic fMRI studies. NeuroImage. 66, 634-641 (2013).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J. Neural Eng. 4, S143-S156 (2007).
- Pashaie, R., et al. Optogenetic brain interfaces. IEEE Rev. Biomed. Eng. 7, 3-30 (2014).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19, 267-274 (2006).
- Fang, Z., Lee, J. H. High-throughput optogenetic functional magnetic resonance imaging with parallel computations. J. Neurosci. Meth. 218 (2), 184-195 (2013).
- Da Silva, F. L. EEG: Origin and measurement. EEG - fMRI: Physiological Basis, Technique, and Applications. , 19-38 (2010).
- Becker, K., et al. Low dose isoflurane exerts opposing effects on neuronal network excitability in neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 7 (6), 3-9 (2012).
- Nishikawa, K., Maciver, M. B. Agent-selective Effects of Volatile Anesthetics on GABA A Receptor - mediated Synaptic Inhibition in Hippocampal Interneurons. Anesthesiology. 94 (2), 340-347 (2001).
- Jackson, J. I., Meyer, C. H., Nishimura, D. G., Macovski, A. Selection of a convolution function for Fourier inversion using gridding. IEEE Trans. Med. Imag. 10 (3), 473-478 (1991).
- Glover, G. H., Lee, A. T. Motion artifacts in fMRI: comparison of 2DFT with PR and spiral scan methods. Magn. Reson. Med. 33 (20), 624-635 (1995).
- Kim, D. H., Adalsteinsson, E., Spielman, D. M. Simple analytic variable density spiral design. Magn. Reson. Med. 50, 214-219 (2003).
- Friston, K. J., Harrison, L., Penny, W. Dynamic causal modeling. Neuroimage. 19, 1273-1302 (2003).
- Alkire, M. T., McReynolds, J. R., Hahn, E. L., Trivedi, A. N. Thalamic microinjection of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat. Anesthesiology. 107 (2), 264-272 (2007).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol. Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS ONE. 8 (9), 1-16 (2013).
- Liu, J., et al. Frequency-selective control of cortical and subcortical networks by central thalamus. eLife. 4, e09215 (2015).
