Introduction
Optogenetic fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (ofMRI) genelinde hücre tipine özgü fonksiyonel nöral devrelerin haritalama ve onların dinamiklerini sağlayan optogenetic stimülasyon 1-11,38 hassasiyetle yüksek alan fMRI uzaysal çözünürlüğü birleştiren yeni bir tekniktir beyin. spesifik hücre tipleri ışık duyarlı membran ötesi iletkenliğini kanal adı verilen opsins sokulmasıyla uyarılması için hedef için optogenetics sağlar. Nöral devrelerin belirli unsurları genetik bozulmamış beyin 1-15 faaliyet milisaniye-zaman ölçeğini modülasyonu sağlayan, bu kanalları ifade etmek değiştirilir. fMRI nöronal aktivitenin dolaylı bir ölçüm sağlar, kan oksijen seviyesi bağımlı (BOLD) sinyal 16-18 ölçümü yoluyla belirli nöral devrelerin optogenetic uyarılması beynin küresel dinamik tepki belirlenmesi non-invaziv bir yöntem sağlar.
nispeten yüksek uzaysal çözünürlükte tüm beynin bir görünüm sağlayabilir, çünkü bu iki tekniğin kombinasyonu, optogenetic fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (ofMRI) olarak adlandırılan, örneğin elektrofizyoloji olarak uyarılması sırasında kayıt beyin aktivitesinin diğer yöntemlere göre avantajlıdır. Bu invaziv kayıt elektrotları 1-11 implantasyonu için gerek kalmadan uyarım bölgesinden uzak mesafelerde hedef uyarılmasına tepki olarak nöronal aktivitenin tespit edilmesini sağlar. ofMRI elektrotun yakın farklı hücre tiplerini işe ve böylece her nüfus 19 nedensel etkisi bulandırabilir fMRI sırasında elektrik stimülasyonu gerçekleştirme daha geleneksel yöntem üzerinde avantajlıdır. Buna ek olarak, elektrotlar elektrik stimülasyonu için kullanılan ve oluşturulan akım MR 20 sırasında eserler üretebilir. Nitekim, ofMRI belirli modulati küresel beyin aktivitesi üzerine etkisi gözlem sağlarBu tür transgenik hayvanlarda Cre-lox sistemi ya da promotörlerin kullanılması gibi gelişmiş bir genetik hedefleme teknikleri kullanılarak hücre tipleri çok çeşitli ilgili. tüm beyin izleme kombinatoryal optik kontrol özel hücre tipleri uyarmak için önleyen ve ChR2 hem NpHR kullanılarak ofMRI ile mümkündür. ofMRI kullanıma hazır Optogenetic araç takımı, aynı zamanda hızlı bir şekilde implante elyaf gerekliliğini ortadan olabilir stabilize basamak fonksiyonu opsins (SSFOs) veya kırmızı-kaydırılmış opsins arasında artan ışık hassasiyeti ya da geliştirilmiş kinetiği ile opsins tanıtımıyla zamanla gelişmektedir görüntüleme 21 sırasında non-invaziv stimülasyon sağlayan optik,. Bu olasılıklar elektrik stimülasyonu ile kullanılamaz.
Bununla birlikte, beyin ışık teslimat doku ısıtmadan elde edilen sinyal eserler gevşeme sürelerine sıcaklığı kaynaklı modifikasyon pseu üretmek için gösterilmiştir 22, rapor edilmiştiraktivasyonu yapmak. ofMRI performans Araştırmacılar, bu nedenle bu potansiyel yıkmak farkında olmalıdır. Doğru kurulum ve kontroller ile, konu ele alınabilir. Buna ek olarak, fMRI'da hemodinamik yanıtı ölçmek için, nispeten düşük zamansal çözünürlüğü bu tekniğin bazı uygulamalar için sınırlayıcı bir faktör olabilir.
Bu protokol, ilk derin in vivo beyin içine ışığın belirli dalga boyuna sahip verilmesini sağlamak fiber optik implant yapımını da tarif eder. protokol daha sonra stereotaktik cerrahi ile kesin bir beyin bölgesine opsin kodlama viral vektör teslim tarif eder. protokolü Sonraki eşzamanlı ışık uyarılması sırasında tüm beyin fonksiyonel MRI işlemi anlatılmaktadır. Son olarak, protokol elde edilen verilerin temel veri analizini özetlemektedir.
Unutmayın ki, burada açıklanan optogenetics ışık teslimat için kronik bir implant gerektirir. Ancak, fiber optik implantlar kararlı ve biyo vardıruyumlu bir uzunlamasına tarama ve ay 23,24 bir süre boyunca sinir devresi araştırılması için izin.
Özet olarak, hassas uyarılması ve ofMRI bütün beyin izleme yeteneği beyin connectomics çalışma için güçlü bir araç ofMRI yapımında önemli faktörlerdir. Buna ek olarak, farklı hayvan modellerinde ile birleştiğinde nörolojik hastalıklar 25 mekanizmalarına yeni fikir verebilir. Nitekim, ofMRI nöbet 8 ile ilişkili farklı hipokampal alt bölgelerin ağ etkinliğini aydınlatmak için kullanılır olmuştur. Bu nedenle, sistem düzeyinde sinirbilim soruları yanıtlayan ilgilenen laboratuarlar önem bu tekniği bulacaksınız.
Protocol
Etik Beyanı: Burada Stanford Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır deneysel prosedürler.
1. hazırlanması Patch Kablolar ve Ferrule İmplantlar
Not: patch kablolar ve yüksük implantları üreten, piyasada mevcut olmasına rağmen bu in-house özel tasarımlar sağlar ve daha az mal olacak.
- İlk istenilen uzunlukta fiber optik tutunmaya, beyinde implanta lazer ışığı dağıtmak için bir fiber patch kablo hazırlamak için.
- Fiber balta kullanarak, sonlandırma noktasına düz bir ucunu üretmek için optik fiber sonlandırma. Fiber bir ceket ile kaplı olması durumunda, daha önce bir elyaf soyma aleti ile ceketini şerit.
- Kablo deliği içinde hayvana ışık kaynağından uzanacak şekilde yeterli uzunlukta olması sağlanır, kablo istenen uzunluğu elde etmek fiber optiğin diğer ucunu klivajtarayıcı.
- Epoksi tutkal karıştırıldıktan sonra kullanımı, 5 dakika için çok viskoz olduğunda, kısa bir süre bir sonraki aşamada önce, bir alüminyum folyo parçası üzerine: 1 oranında bir 1 epoksi yapıştırıcı bir miktar karıştırın.
- küçük tahta bir çubuk kullanarak yavaşça seramik halka içbükey tarafı içine yerleştirilir ve daha sonra halkanın düz tarafı yüzeyi üzerine küçük bir damla uygulanır edilecek lif parçası epoksi yapıştırıcı uygulanır. halkalı içine yerleştirdikten sonra, lif (<0.5 mm) küçük bir uzunluk seramik halka düz tarafı çıkıntı emin olun. epoksi tutkal en iyi sonuçlar için O / N sertleşmesini bekleyiniz.
- lazer ışık kaynağına bağlanacak fiber optik patch kablo tarafında, hafifçe FC / PC bağlacının halkanın konkav içine alınacaktır lif kısmına epoksi yapıştırıcı uygulayın ve sonra küçük bir uygulayın halkanın düz tarafı yüzeyine bırakın. halkalı içine yerleştirdikten sonra, garantiBu lif (<0.5 mm), küçük bir uzunlukta halkasının düz kısmı arasında uzanmaktadır. epoksi tutkal en iyi sonuçlar için O / N sertleşmesini bekleyiniz.
- 3 mikron 1 mikron mikron kum 0,3 alüminyum oksit alıştırma sayfaları (üzerinde şekil-8 dönmeler yaparken yüksük nazik aşağı yönlü baskı uygulamak için cımbız kullanarak bir parlatma diski kullanarak kablonun her iki taraf için ferrüllerle düz ucunu parlatmak ).
- 100X büyütmede bir mikroskop ile yüksük düz ucunu inceleyin. fiber optik yüzeyi kendisi de dahil olmak üzere yassı sonunda, yüzey, herhangi bir epoksi yapıştırıcı serbest olduğundan emin olun; epoksi tutkal yüzeyinde kalırsa parlatma devam edin. fiber optik yüzeyi kırık veya yontulmuş olmadığından emin olun.
DİKKAT: emin olun personelin uygun lazer güvenlik eğitimi dersleri almak ve lazer işleme ekipmanı önce lazer güvenlik gözlük takın. - FC / PC bağlantısı aracılığıyla lazer ışık kaynağına fiber optik patch kablosunu bağlayın ve f hizalamaKuplörün odak noktasına iber ipucu. Yeterli ışık çıkışını sağlamak için bir güç metre ile fiber ışık iletim gücünü ölçün.
Not: Aşağıdaki adımlar beyine kronik implantasyon için fiber optik ile seramik yüksükler hazırlamak içindir; seramik yüksük ortasındaki çukur ve beyin içinde ilgi (ROI) bir bölgeye bir yama kablosu ışık sunmak için fiber optik taşırlar. - Fiber balta kullanarak, sonlandırma noktasına düz bir ucunu üretmek için optik fiber sonlandırma. Fiber bir ceket ile kaplı olması durumunda, daha önce bir elyaf soyma aleti ile ceketini şerit.
- beyin içine implantasyon için istenen uzunluğu elde etmek fiber optiğin diğer ucunu bölmektedir. beyin içinde ROI hedef stereotaksik atlas kullanarak lif uzunluğunu belirler.
- Örnek: bregma aşağıdaki 3,5 mm sıçan dorsal hipokampus hedef, lif uzunluğu ferrul çıkıntı sağlamake + 0,25 mm 3,5 mm, kafatası kalınlığı için muhasebe ve hata marjı sağlayan olduğunu. Bu nedenle, lif nihai uzunluğu + 0.25 mm + 10,5 mm 3,5 mm (ferrüle uzunluğu) = 14.25 mm olup olmadığını kontrol edin.
- 1 epoksi yapıştırıcı az miktarda karıştırmak: kısa bir süre sonraki aşamada önce, bir alüminyum folyo parçası üzerine 1 oranında (epoksi yapıştırıcı karıştırma sonrası kullanımı, 5 dakika için çok viskoz hale gelir).
- küçük tahta bir çubuk kullanarak yavaşça seramik halka içbükey tarafı içine yerleştirilir ve daha sonra halkanın düz tarafı yüzeyi üzerine küçük bir damla uygulanır edilecek lif parçası epoksi yapıştırıcı uygulanır. halkalı içine yerleştirdikten sonra, lif (<0.5 mm) küçük bir uzunluk seramik halka düz tarafı çıkıntı emin olun. epoksi tutkal en iyi sonuçlar için O / N sertleşmesini bekleyiniz.
- Şekil-8 rotasyonu yaparken yüksük nazik aşağı yönlü baskı uygulamak için cımbız kullanarak parlatma diski kullanarak halkanın düz ucunu parlatmakAlüminyum oksit alıştırma sayfaları ile ilgili (3 um 1 mikron 0.3 mikron kum için).
- 100X büyütmede bir mikroskop ile yüksük düz ucunu inceleyin. fiber optik yüzeyi kendisi de dahil olmak üzere yassı sonunda, yüzey, herhangi bir epoksi yapıştırıcı serbest olduğundan emin olun; epoksi tutkal yüzeyinde kalırsa parlatma devam edin. fiber optik yüzeyi kırık veya yontulmuş olmadığından emin olun.
- Çift cilalı bir yüksük kol ile bir fiber optik patch kablo yüksük ve bir lazer ışık kaynağı yama kablosunu bağlayın. Yeterli verimliliği sağlamak için bir güç metre ile fiber ucundaki ışık iletim gücünü ölçün.
- çıkışına her yüksük implant fiber optik (Bu protokol 2.5 mW) ucunda istenen güç seviyesi için yama kablosunun halkalı gerekli güç çıkışı bir günlük tutun. % 50'nin üzerinde bir zayıflatma oranı ile ve dairesel olmayan çıkış desenli yüksükler atın.
2. Stereotaksik İthlantation Cerrahi ve Virüs enjeksiyonundan
- Hayvanların kullanımını içeren herhangi bir deneysel prosedürler yerel IACUC tarafından onaylanmış olduğundan emin olun. steril eldiven, steril maske, steril cerrahi örtüler ve sterilize cerrahi aletler kullanarak da dahil olmak üzere, aseptik prosedürleri izleyerek hayatta kalma ameliyatları sırasında aseptik koşullarda korumak.
DİKKAT: cerrahlar işlemine başlamadan önce emniyet gözlükleri dahil olmak üzere uygun kişisel koruyucu donanım (KKD) giyiyor emin olun. sıçramasını önlemek için özen, adeno-ilişkili vektörü (AAV) ile çalışırken standart biyogüvenlik prosedürlerini izleyin. Bir biyolojik tehlikeli atık kabına AAV atık bertaraf edin. - Kullanmadan önce buz üzerinde şırınga tutarak, hayvana enjeksiyon için yeterli AAV ile bir mikrolitre şırınga yükleyin artı potansiyel hacim kayıpları (hayvan başına 4 ul total) hesaba ekstra. Bu protokol, 4x10 12 vg / ml bir titrede AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP kullanılır. izofluran altında hayvan yerleştirinBir oksijen gazı kaynağı ile% 4 - 3 de hassas izofluran buharlaştırıcı setine bağlı bir indüksiyon odasına e anestezi,.
- Bir elektrikli tıraş makinesi ile tıraş ve betadin ve% 70 etanol durulama kullanarak cilt üzerinde üçlü bir cerrahi fırçalayın gerçekleştirin.
- Hayvan derin anestezi (ayak refleksini ve solunum hızını kontrol edin) geldikten sonra, içi işitsel konumlandırma Çıtçıt ve diş çubuğu ile bir stereotaksik aparat hayvanın kafatasını hareketsiz.
Not: Tüm prosedür 1 alacak - anestezi indüksiyonu gelen kurtarma, 2 saat. - (- Buharlaştırıcı üzerinde% 3 izofluran 1) ve sürekli 40 nefes / dk ~ bir solunum hızını korumak için gerekli olarak anestezi ayarlayarak, hayvanın hayati işaretleri takip uygun bir seviyeye anestezi ayarlayın. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için hayvanın gözleri oftalmik merhem uygulayın.
- Bir bir neşter ile 20 mm orta hat kafa derisi insizyon ve cerrahi hemostat kullanarak kafa derisi geri - 15 yapmakperiosta ttached. Referans lambda ve Bregma ROI için koordinatlar üzerinde matkap ucu konumlandırmak için.
- beyin delinme vermemeye dikkat ederek, bir diş matkap ile ROI üzerinde - (3 mm 2), küçük bir kraniotomi delin. Yavaş yavaş beyindeki YG kraniyotomi ile mikrolitre şırınga bağlı iğne takın.
- Bir mikroenjektör pompa kontrolörü ile, ROI içine vektör solüsyonu 2 ul enjekte edilir. Doku zarar görmesini önlemek için, 150 Nl / dak bir akış hızı kullanarak. Enjeksiyon işlemi tamamlandıktan sonra, 0.5 mm / dakika arasında bir oranda, bir şırınga içinden yavaşça çıkarmadan önce 10 dakika bekleyin.
- enjeksiyonu takiben, kafatası yüzeyi kurulayın. yaklaşık 0.5 mm / dakika arasında bir oranda: Koordinatları ve sonra, (dorsal hipokamp için bregma 3.5 mm altına, örneğin) hedef derinliği yüksük implantı yerleştirmek için referans Lambda bregma. Diş çimento kullanarak kafatasına ferrule implant monte edin. Diş çimento katılaşmış sonra, dikişlerle kesi mühür (siDiş çimento kapağı etrafında sıçanlar için ze 5-0).
- Ameliyattan sonra, tek başına anestezi kurtarma için bir ısıtıcı üstüne kafes yarısı ile yer olan kafeste hayvan yerleştirin. sternal yatma korumak için yeterli bilinci yerine kadar gözetimsiz bir hayvan bırakmayın. Tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirkette hayvan koymayın.
- ağrı, ameliyat sonrası yönetimi, 24 saat süre ile 0.05 mg / kg bir dozajda Yönetici buprenorfin deri altından her 12 saat için. 3 gün boyunca kesi sitesi üzerinden günlük antibiyotik tozu yönetme.
- kabuklanma önlemek için yaklaşık iki hafta ameliyattan sonra sütür çıkarın.
- deneyler gerçekleştirmeden önce Optogenetic genlerin yeterli ifadesi için virüsünün, enjeksiyondan sonra 6 hafta - 4 bekleyin.
3. optogenetic Fonksiyonel MRI
DİKKAT: MRI tarayıcısı kalıcı manyetik alanın etrafında dikkatli olun. Güvenli equipmfonksiyon jeneratörü, ışık kaynağı, vantilatör, kapnograf ve gaz tankları da dahil olmak üzere ent, yeterince uzakta (en az 5 Gauss sınırın ötesine).
- Bir oksijen gazı kaynağı ile% 5 hassas izofluran buharlaştırıcı setine bağlı bir indüksiyon odasına, gaz anestezi altında hayvan yerleştirin.
- Hayvan derin anestezi (çek ayak refleksi ve solunum hızında) geldikten sonra, Rivard ark ayrıntılı protokole göre hayvan entübe. (2006) kapnografi 26 karbon dioksit izlenmesine olanak verecek şekilde. Not: entübasyon görüntüleme sırasında ekspiratuar CO 2 uygun seviyelerde tutulması önemlidir.
- Tarayıcı beşiği hayvan sabitleyin.
Not: Bu protokol, beşik özel hazırlanır ancak bu beşik de ticari olarak mevcuttur. Sıçan beşik fonksiyonları anestezi, ısıtılmış havanın verilmesi için ve hareket kısıtlılığı için tarayıcının içindeki hayvanı olarak güvenceye alın. - izofluran karışımı (Rangin sununbeşik ile tüp aracılığıyla yaklaşık% 60 azot oksit ve% 40 oksijen)% 1.5 - 1.2 g den. Hayvanın kafası güvenli hareket eserler önlemek için sabit olduğundan emin olun.
- beşikteki tüp aracılığıyla ısıtılmış havayı sağlamak ve vücut ısısını izlemek için yağ ile bir rektal termometre yerleştirin. anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için hayvanın gözleri oftalmik merhem uygulayın.
- Bir lazer ışık kaynağına fiber optik patch kablo bağlayın ve bir güç metre ile yama kablosunun halkanın ucunda çıkışını ölçün.
- beynin içinde implante fiber optik ucunda istenen çıktı (bu protokolde 2.5 mW) üretmek için (adım 1.15 daha önce belirlenen) uygun güç seviyesine ayarlayın. Fiber optik aşırı güç çıkışı potansiyel beyninde doku hasarına neden ya da sinyal eserler üretecek doku ısıtma neden olabilir, çünkü önemli ölçüde lazer güç çıkışını artırmak değilamaçlanan çıktı ötesinde.
- siyah elektrik bandı bir koni ile implanttan ışık sızıntısını önlemek ve hayvan gözleri kapsamaktadır. Çift yüksük kol ile hayvan yüksük implanta fiber optik kablo.
- hayvanın başının üzerinde bobin yerleştirin. Tarayıcının deliğine hayvan kızağı yerleştirin.
Not: Bu protokol, tek döngü bobin özel üretildi ve beyin dokusundan optimum radyo frekansı almak için ön-ayarlı iletim-alma. - % 4 strok frekansını ve ses seviyesini ayarlamak için ventilatör üzerinde düğmeleri çevirerek ve - bu süreç boyunca hızı ve vücut ısısı nefes sınırlar içinde fizyolojik değerleri tutmak için gerekli yapay vantilatör ve ısıtıcı ayar Monitör (temin etmesi ekspiratuar CO 2 3 olduğunu Eğer sıcaklık ayarı için oklar) tıklatarak 37 ° C dir.
- Resme bir konumlandırma dizisi hayvan kafası konumu seçin. b iseyağmur hayvan kafasının yerini ayarlamak ve beyin iso-merkezde kadar konumlandırma taramasını tekrarlayın, iso-merkezde değil. doğrusal layneri dizisi seçin ve dizi seçim penceresinde yükü tıklayın. Sonra, manyetik alanın homojen olmayan düzensizlikleri azaltmak başlar tıklayın.
Not: terazi ayarına doğrudan fMRI verilerin bütünlüğünü etkileyecek kritik bir adımdır. - Bir T2 ağırlıklı dizisini seçin ve dizi seçim penceresinde yükü tıklayın. Sonra, beynin genel bütünlüğünü kontrol etmek ve optik fiber implantın yerini onaylamak için önce fMRI için T2 ağırlıklı yüksek çözünürlüklü koronal anatomik görüntüler elde başlar tıklayın.
Not: Bu görüntüler ofMRI tarama serisi için anatomi bindirmeleri olarak kullanılabilir. - lazer ışık kaynağı deneysel stimülasyon paradigmaya göre sürülür, böylece fonksiyon jeneratörü için MRI tarayıcısı tetikleme limanından BNC kablolarını bağlayın.
Not: Bu protokol, uyarım pAradigm, altı dakika süre ile / 40 sn kapalı 20 saniye, ardından taban 30 sn'dir. - gradyan eko (GRE) dizisi hatırladı çok dilim seçin ve dizi seçim penceresinde yükü tıklayın. Sonra, 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm uzaysal çözünürlüğü ile koronal dilim düzlem 35 mm x 35 mm (2B FOV) elde etmek için başlangıç tıklatın.
Not: Burada kullanılan GRE dizisi TR / TE tekrarı süresi (TR) ve eko zamanı (TE) sahiptir = msn 750/12 ve 30 ° çevirme açısı. - tarama bitiminde, tarayıcıdan hayvan çıkarın ve anestezi uyandırdı ve sternum yatma koruyabilirsiniz kadar izler.
4. ofMRI Veri Analizi
Not: Aşağıdaki adımlar MATLAB gerçekleştirilir yüksek verimlilik üzerinde bir yayında ofMRI 27 anlatıldığı gibi.
- Ham tarama veri analizi için kullanılan bilgisayara transfer edildikten sonra, birlikte, görüntüyü her TR güncellemek için pencere yeniden sürgülü kullanınDört Interleave spiral okuma, 750 msn TR ve 12 msn eko zamanlı tarama seri başına 23 dilim elde etmek. Bunun yerine tüm asetat ara her dilim için satın alınan ancak daha sonra yeni FMRG'de yeniden konvansiyonel rekonstrüksiyonu, sürgülü pencere yeniden yöntemi 27 Araya her kazanılmasından sonra görüntüleri yeniden yapılandırır.
- Daha önce 27 açıklandığı gibi iki boyutlu gridding yeniden yapılanma, hareket düzeltme ve zaman serisi hesaplamak için ham verileri işlemek.
- Daha önce 27 açıklandığı gibi önceki uyarıya toplanan taban döneme her voksel göreli BOLD sinyal yüzde modülasyonu hesaplanarak aktive vokseller belirlemek için bir eşik tutarlılık yöntemi kullanın. Fourier büyüklüğü tüm frekans bileşenlerinin 8 toplamı-of-kareler bölünmesiyle tekrarlanan stimülasyon döngülerinin frekansta dönüşümü tutarlılık değerleri hesaplayın.
- Her v için zaman serisi verileri kullanılarakOxel, ortalama hareket düzeltilmiş görüntüler ilk aynı uyarım paradigmasının ardışık taramalar ait olduğu. Daha önce 27 açıklandığı gibi daha sonra içinde ve hayvanlar arasındaki karşılaştırma için bir altı derecelik serbestlik rijit gövde dönüşümü artı izotropik ölçekleme ile ortak koordinat çerçevesine ortalama 4D görüntüleri hizalamak.
Representative Results
Şekil 1 ve Şekil 2 20 Hz (15 msn darbe genişliği, 473 nm,% 30 görev döngüsü) motor korteksin optogenetic uyarılmasından kaynaklanan temsili verileri gösterir. Altı dakika kullanılmıştır için başlangıçtaki 30 saniyelik bir uyarım paradigması / 40 saniye 20 saniye ile kapalı izledi. Önceki çalışmalar bu paradigma optogenetic uyarım 1,8 dan sağlam BOLD sinyal üretir olduğunu göstermiştir. 1 aktive vokseller stimülasyon (motor korteks) yerel yerinde hem algılanan gösterileri ve talamus Şekil, uzun menzilli sinaptik bağlantıları sonucunda bu bölgeler arasında. Şekil 2 talamik cevap gecikmeli olarak zamansal bilgiler, HRFs panoda edilebildiğini göstermektedir (alt ilk eğim) optogenetic stimülasyon sonra motor korteks yanıta göre.
p_upload / 53346 / 53346fig1.jpg "/>
Motor Korteks Hücreleri CaMKIIa-ifade optogenetic Uyarım Bağlı BOLD Sinyal Şekil 1. Aktivasyon Haritası. Anlamlı tekrarlanan uyarılara senkronize olanlar olarak tanımlanan aktif vokseller, Uyumu değerleri, bir T2 ağırlıklı koronal anatomik dilim üzerine işlenmiş gösterilir. Veriler tek bir aktivasyon haritası yoğunlaşmış olan (473 nm ışık, 20 Hz, 15 msn darbe genişliği ile / 40 sn kapalı 20 sn ilk 30 sn bazal ve altı stimülasyon döngüleri) altı dakika, 30 saniye süre boyunca toplanan. Sıralı dilimler 0.5 mm arayla ve fiber optik implantın yeri üçgen ile gösterilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
görüntüleme sırasında konunun hareket veri bozulmasına yol açabilir dışlayıcı önemli bir kaynağıdır. Uygun şekilde uygun anestezi düzeylerini korumak olacak gibi eserler en aza indirebilirsiniz görüntüleme beşiği hayvan güvence. Burada, izofluran ancak medetomidin ya ketamin ve ksilazin gibi alternatif anestezikler, kullanılan da dikkate alınmalıdır. Bununla birlikte, anestezinin seviyeleri ve seçimi KALIN karşılık 28 de dahil olmak üzere, beyinde birçok parametre etkileyebilir. Izofluran nöronal eksitabilite 29 değişikliklere neden olabilir. Diğer anestezikler da GABA sinaptik inhibisyon 30 etkileyebilir. ofMRI nöronal aktivitenin etkileme kabiliyetini verilen gerçekleştirilmesi Böylece, anestezi seçimi önemlidir. anestezi olmadan ofMRI mümkündür hayvansal alışkanlık ise azaltılabilir hayvan, artan hareketi ile zor olabilir; Böyle uyanık ofMRI çalışmaları daha önceden yapılmıştır birnd beyinde 9,10 anestezi karıştırıcı etkisini önlemek olacaktır. Post-processing hareket düzeltme algoritmaları büyük ölçüde hareket etkilerini azaltmak için kullanılabilir. Bu yöntemlerin bazıları düzeltme altında kareler maliyet referans görüntü fonksiyonu ve görüntü toplamını minimize Bu protokol, istihdam ters Gauss-Newton algoritması dahil, mevcuttur. Bu işlem sürelerini 27 azaltmak için GPU paralel platformu tasarımı kullanılarak, hızlı ve sağlam hareket düzeltme sağlar çünkü algoritma yararlıdır.
Bu protokolde veri yeniden inşası için, MATLAB ortamında özel yazılmış yazılım spiral örnekleri Gridlenmiş görüntülere 31-33 içine k-uzayda yeniden iki boyutlu gridding yeniden inşası için kullanılmıştır. Zaman serisi verileri stimülasyon öncesi toplanan bazal süre için her voksel nisbetle KALIN sinyalinin yüzdesi modülasyonu hesaplanmak suretiyle meydana çıkartılmıştır. kimin zaman serileri voksellerini syn edildiaktif vokseller olarak tanımlandı 0.35 ya da daha büyük bir tutarlılık değeri Optogenetic stimülasyon blok chronized; Bu tutarlılık değeri en az 10 -9 P değeri 8'e karşılık gelir. Fourier büyüklüğü tüm frekans bileşenlerinin 8,27 toplamı-of-kareler bölünmesiyle tekrarlanan stimülasyon döngülerinin frekansta dönüşümü tutarlılık değerleri hesaplanmıştır. Familywise hatası çoklu karşılaştırmalar için Bonferroni düzeltmesi ile kontrol edilebilir. Analiz alternatif yöntemler, genel doğrusal modeller (GLMs) olarak parametrik istatistiksel testler de dahil olmak üzere, kullanılabilir. tutarlılık yöntemi, geleneksel genel doğrusal modele kıyasla İHÖ'ye az ön bilgi gerektirir. ofMRI kullanarak veri araştırma, bu nedenle, avantajlıdır. Bununla birlikte, tutarlılık yöntemi yalnızca aralığı interstimulus sabit ve diğer etkinlik iliflkilerimiz ile ofMRI veri kullanılamaz olan olay ile ilgili tasarımları blok tasarımları veri için kullanılabilir veya seçilebilirted tasarımları veya karışık tasarımlar. Daha sonra, dinamik nedensel modelleme (DCM) ofMRI ile tespit beyin bölgeleri arasında etkileşimler analiz etmek için kullanılabilir. DCM fMRI 34 sırasında deneysel girişlere sistem yanıtları fonksiyonel bağlantı analizi için geliştirilmiş bir Bayes istatistiksel tekniktir.
ofMRI için ek teknik kaygılar burada tartışılır. İmplantlar hasarlı veya çalışma etkilenen hayvan kaldırılmasına yol düşmek olabilir. Yeniden implantasyon ameliyatı nedeniyle hayvan refahı konularında özgün implantasyon cerrahisi gibi ve yine aynı ROI hedefleyen ek belirsizlik tavsiye edilmez. Çünkü her bir hayvan deneğe için harcanan zaman ve kaynak önemli miktarda malzemenin mukavemetinin dikkate ofMRI çalışmalarda kullanım için uygun bir diş çimento tercih önemli bir husustur. implantasyon cerrahisi implan uzun ömürlü maksimize kritik bir faktördürt ve hayvan konu. Örneğin, kafatası çalışma sırasında hayvanın potansiyel aylarca süren bir zaman çizelgesi üzerinde istikrarı sağlamak için seramik halka implantın etrafında çimento yeterli miktarda diş çimento uygulamadan ve yerleştirmeden önce kuru olması sağlanmış. Buna ek olarak, alternatif kafes tasarımları araştırdı ve sık sık kafes içine çıkıntı tel yiyecek tutan üstleri ve su ile kafesleri önlemek ve implant zarar hayvan için fırsatlar sağlamak için yerel hayvan bakım tesisi ile ele alınabilir. Önemlisi, diş çimento görüntüleme ve alternatif çimentolar hayvan deneylerinde kullanılmadan önce bir tarayıcı bir hayalet ve görüntüleme üzerine uygulama ile test edilebilir etkileyen eserler azaltmak için dikkatle seçilmelidir. çeşitli simanların ile deneme yanılma Bu protokolde kullanılan çimento görece az sayıda eserler verdiğini göstermiştir. ofMRI gerçekleştirmede başka teknik zorluk extr verilen, amaçlanan ROI fiber optik yerleştirme doğruluğubeyin 35 çekirdekleri arasında var olabilir Emely küçük mesafelerde. implantasyon ameliyatı tamamladıktan sonra, T2 ağırlıklı anatomik taramaları beyin atlası üzerine kaplayan doğru yerleştirme belirlemek için kullanılabilir. cerrah ve bu cerrahisine uygulama becerisi doğru yerleştirme oranlarını artırabilir. amaçlanan ROI özgünlüğü ve opsin ifadesi hayvan perfüze ve beyin sabitleme, immünhistokimya veya görselleştirme opsin etiketli bir muhabir-proteinin endojen floresan kullanarak çalışmanın sonuca doğrulanabilir. Bu haberci proteinleri de opsin istenen nöronal hücre tipleri 1,8,15,25 ifade sağlamak için başka proteinler ile birlikte lokalize edilebilir. Daha önce de belirtildiği gibi hafif teslim 22 nedeniyle doku ısıtma ofMRI yaparken, eserler ortaya çıkabilir. Doku ısıtma yanlış BOLD sinyal sonuçlanan gevşeme süreleri değişiklik neden olur. Bu ac sağlamak içinofMRI sırasında ışık uyarılmasından kaynaklanan tivation Bu yapıyı bağlı değildir, opsin-negatif kontroller (örneğin, AAV-CaMKIIa-EYFP gibi) kontrol florofor vektörleri ile enjekte salin enjekte edilmiş hayvanların veya hayvanlarda ofMRI tabi yapılmalıdır. Ayrıca, iyi bir ışık iletim verimliliği ile iyi yapılmış fiber optik implantlar yüksek lazer yetkileri kullanmak gerek kaldırmak için kullanılmalıdır. ofMRI çalışmaları nedeniyle doku ısıtma da yanlış aktivasyon gerçekleştirilmiştir bir sorun 1,6-8,10,11 olmamıştır.
ekspresyon için nöronları gerekli Optogenetic genlerin sokulması için de vektörün seçimi ile ilgili olarak, AAVler insanlarda hastalığa neden olduğu bilinmektedir ve bu nedenle, uygun bir seçenek, bu maddeler (BSL-1) kullanmak için gerekli düşük biyo-güvenlik seviyesi verilmez. Buna ek olarak, vektör çekirdeklerinin çok sayıda stok ve çoklu serotipleri ile çeşitli optogenetic genler ile paketlenmiş AAVS taşırlar. AAV serotip B seçilmelidirOptimal ifade seviyelerini 36,37 sağlamak amacıyla hücre popülasyonu hedef ased. Lentiviruses da kullanılabilir, ancak daha yüksek bir biyogüvenlik düzeyi gerektirir edilebilir. Optogenetic genlerin yeterli ifadesi için gerekli olan zaman süresi, kullanılan özel AAV ve spesifik deneysel paradigmasında, kullanılan özel hayvan modeline bağlı olarak değişkendir. Bu protokol, 11 haftalıkken Sprague Dawley sıçanları kullanılmıştır ve optogenetic çalışmalar virüs enjeksiyonundan sonra dört ila altı hafta başlayacak. Transgenik fareler, Optogenetic çalışmalarda kullanılabilir. Opsins yeterli ekspresyonu için gerekli zaman miktarının saptanması pilot deneyleri için gereklidir. Stimülasyon paradigmaları kullanılan özel opsin bağlı olarak değişebilir. Bu protokolde, AAV5-CaMKIIa-hChR2 (H134R) -EYFP kullanılır ve stimülasyon paradigma / 40 sn kapalı 20 sn. SSFO AC için ışığın sadece kısa bir darbe gereklidir çünkü SSFO kullanılıyorsa, stimülasyon paradigma değişirgenelinde ekili ve daha sonra başka bir dalga boyunda ışık kısa bir darbe sona edilmesi.
ofMRI hayvan anestezi bile, görsel uyarı kaynaklanan bir karıştırıcı beyin sinyali engellemek için optogenetic uyarılması sırasında fiber optik patch kablo ile yüksük implant arayüzü ışık sızıntısını engelleyen performans ek kritik endişe. siyah elektrik bandı Kozalaklar yüksükler gelen ışığı engellemek için hayvanın gözlerini kapsayacak şekilde kullanılabilir. Önemli olarak, konunun ekspiratuar CO2 ve vücut sıcaklığı dahil olmak üzere, fizyolojik değerleri düzgün görüntüleme süresince muhafaza edilmelidir. 37 ° C 'de% 4 ve vücut sıcaklığı - ekspiratuar CO2 3 arasında tutulmalıdır. Buna ek olarak, shimming dizileri önce ofMRI büyük tarar elde KALIN verilerin kalitesini belirleyen başlangıç için manyetik alan içinde mümkün olduğu kadar homojen olmayan azaltır. Bu faktörlerin kontrolügüvenilir ofMRI veri üretiminde kritiktir. Bu protokol, DPSS lazerler Optogenetic uyarılması için ışık kaynağı olarak kullanılır. Lazer ışığı, tutarlı olduğu için, daha da fazla güç kolayca fiber optik ile temin edilebilir. Fiber optik bağlanmış LED ışık kaynakları ticari satıcılardan temin edilebilir, ancak ışık iletimi azalan güç dezavantajına sahiptir. lazer ışık kaynağı her bir fiber optik patch kablo uyum gerektirmez, ancak uygulama ile, hizalama dakika saniye içinde yapılabilir.
ofMRI gelecekteki uygulamaları gibi görüntüleme sırasında non-invazif uyarımı sağlamak için kırmızı-kaymıştır opsins gibi yeni nesil opsins kullanımını içerir. Ayrıca, MR-uyumlu EEG veya fiber optik implant ile birlikte benzer kayıt elektrotları implantasyonu MRG yüksek uzaysal çözünürlüğü verilere ek olarak, yüksek zamansal çözünürlüklü veri edinimi için izin verebilir. ofMRI ile Electrophvsiological kayıt beynin fonksiyonel bağlantı hakkında geniş bilgi verebilir. Özet olarak, genetik ya da anatomik kimliği tarafından tanımlanmış belirli bir hücre popülasyonlarının uyarılmaya karşılık olarak, tüm beyin izlemek için ofMRI gücü ofMRI nörolojik hastalıklar çalışmada sağlıklı beyin connectomics kullanımı kritik bir araçtır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 7 Tesla scanner | Agilent Technologies | Discovery MR901 System | |
| Sprague Dawley rats | Charles River | Crl:SD | 11 weeks old |
| fiber cleaver | Fujikura | CT-05 | |
| multimode optical fiber | Thor Labs | AFS105/125Y | |
| fiber stripper | Thor Labs | T08S13 | |
| ceramic split sleeve | Precision Fiber Products | SM-CS1140S | |
| epoxy glue | Thor Labs | G14250 | |
| cotton-tipped applicators | Stoelting Co. | 50975 | |
| multimode ceramic zirconia ferrules | Precision Fiber Products | MM-FER2002 | |
| FC/PC multimode connector | Thor Labs | 30128C3 | |
| fiber optic polishing disk | Precision Fiber Products | M1-80754 | |
| aluminum oxide lapping sheet, 0.3 µm | Thor Labs | LFG03P | |
| aluminum oxide lapping sheet, 1 µm | Thor Labs | LFG1P | |
| aluminum oxide lapping sheet, 3 µm | Thor Labs | LFG3P | |
| binocular biological microscope 40X-1,000X | Amscope | B100 | |
| laser safety glasses | Kentek | KXL-62W01 | |
| 473 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0473 | |
| 594 nm DPSS laser | Laserglow | LRS-0594 | |
| Allen hex wrench set | 2.0 mm (5/64") for alignment of fiber tip to focal point of coupler in the laser | ||
| power meter, Si Sensor, 400-1,100 nm | Thor Labs | PM121D | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein | 50033 | |
| isoflurane vaporizer with induction chamber | VetEquip | 901806 | |
| NanoFil 100 µl syringe | World Precision Instruments | NANOFIL-100 | |
| UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller | World Precision Instruments | UMP3-1 | |
| function generator | A.M.P.I. | Master-8 | |
| small animal stereotax | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Model 683 small animal ventilator | Harvard Apparatus | 550000 | |
| Type 340 capnograph | Harvard Apparatus | 733809 | |
| dental drill (rotary micromotor kit) | Foredom Electric Co. | K.1070 | |
| ophthalmic ointment (Artificial Tears) | Rugby | 00536-6550-91 | |
| instrument sterilizer | CellPoint Scientific | Germinator 500 | glass bead sterilizer |
| antibiotic powder | Pfizer | NEO-PREDEF | neomycin sulfate, isoflupredone acetate and tetracaine hydrochloride |
| buprenorphine painkiller | Hospira | NDC:0409-2012 | schedule III controlled substance, 0.3 mg/ml stock |
References
- Lee, J. H., et al. Global and local fMRI signals driven by neurons defined optogenetically by type and wiring. Nature. 465 (7299), 788-792 (2010).
- Weitz, A. J., Lee, J. H. Progress with optogenetic functional MRI and its translational implications. Future Neurol. 8 (6), 691-700 (2013).
- Lee, J. H. Informing brain connectivity with optogenetic functional magnetic resonance imaging. NeuroImage. 62 (4), 2244-2249 (2012).
- Lee, J. H. Tracing Activity Across the Whole Brain Neural Network with Optogenetic Functional Magnetic Resonance Imaging. Front. Neuroinform. 5 (October), 1-7 (2011).
- Kahn, I., et al. Characterization of the Functional MRI Response Temporal Linearity via Optical Control of Neocortical Pyramidal Neurons. J. Neurosci. 31 (42), 15086-15091 (2011).
- Takata, N., et al. Optogenetic Activation of CA1 Pyramidal Neurons at the Dorsal and Ventral Hippocampus Evokes Distinct Brain-Wide Responses Revealed by Mouse fMRI. PLoS ONE. 10 (3), e0121417 (2015).
- Iordanova, B., Vazquez, A. L., Poplawsky, A. J., Fukuda, M., Kim, S. -G. Neural and hemodynamic responses to optogenetic and sensory stimulation in the rat somatosensory cortex. J. Cereb. Blood Flow Metab. 35 (6), 922-932 (2015).
- Weitz, A. J., et al. Optogenetic fMRI reveals distinct, frequency-dependent networks recruited by dorsal and intermediate hippocampus stimulations. NeuroImage. 107, 229-241 (2015).
- Desai, M., et al. Mapping brain networks in awake mice using combined optical neural control and fMRI. J. Neurophysiol. 105 (December 2010), 1393-1405 (2011).
- Liang, Z., Watson, G. D. R., Alloway, K. D., Lee, G., Neuberger, T., Zhang, N. Mapping the functional network of medial prefrontal cortex by combining optogenetics and fMRI in awake rats. NeuroImage. 117 (0), 114-123 (2015).
- Byers, B., et al. Direct in vivo assessment of human stem cell graft-host neural circuits. NeuroImage. 114 (0), 328-337 (2015).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nat. Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Carter, M. E., et al. Tuning arousal with optogenetic modulation of locus coeruleus neurons. Nat. Neurosci. 13 (12), 1526-1533 (2010).
- Zhang, F., Wang, L. P., Boyden, E. S., Deisseroth, K. Channelrhodopsin-2 and optical control of excitable cells. Nat. Methods. 3 (10), 785-792 (2006).
- Zhao, S., et al. Cell type-specific channelrhodopsin-2 transgenic mice for optogenetic dissection of neural circuitry function. Nat. Methods. 8 (9), 745-752 (2011).
- Ogawa, S., Lee, T. M., Kay, A. R., Tank, D. W. Brain magnetic resonance imaging with contrast dependent on blood oxygenation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87 (24), 9868-9872 (1990).
- Ogawa, S., et al. Intrinsic signal changes accompanying sensory stimulation: functional brain mapping with magnetic resonance imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5951-5955 (1992).
- Kwong, K. K., Belliveau, J. W., et al. Dynamic magnetic resonance imaging of human brain activity during primary sensory stimulation. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89, 5675-5679 (1992).
- Canals, S., Beyerlein, M., Murayama, Y., Logothetis, N. K. Electric stimulation fMRI of the perforant pathway to the rat hippocampus. Magn. Reson. Imaging. 26, 978-986 (2008).
- Antal, A., et al. Imaging artifacts induced by electrical stimulation during conventional fMRI of the brain. NeuroImage. 85 (3), (2014).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nat. Neurosci. 16 (10), 1499-1508 (2013).
- Christie, I. N., et al. FMRI response to blue light delivery in the naïve brain: Implications for combined optogenetic fMRI studies. NeuroImage. 66, 634-641 (2013).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. J. Neural Eng. 4, S143-S156 (2007).
- Pashaie, R., et al. Optogenetic brain interfaces. IEEE Rev. Biomed. Eng. 7, 3-30 (2014).
- Gradinaru, V., Mogri, M., Thompson, K. R., Henderson, J. M., Deisseroth, K. Optical deconstruction of parkinsonian neural circuitry. Science. 324, 354-359 (2009).
- Rivard, A. L., et al. Rat intubation and ventilation for surgical research. J. Invest. Surg. 19, 267-274 (2006).
- Fang, Z., Lee, J. H. High-throughput optogenetic functional magnetic resonance imaging with parallel computations. J. Neurosci. Meth. 218 (2), 184-195 (2013).
- Da Silva, F. L. EEG: Origin and measurement. EEG - fMRI: Physiological Basis, Technique, and Applications. , 19-38 (2010).
- Becker, K., et al. Low dose isoflurane exerts opposing effects on neuronal network excitability in neocortex and hippocampus. PLoS ONE. 7 (6), 3-9 (2012).
- Nishikawa, K., Maciver, M. B. Agent-selective Effects of Volatile Anesthetics on GABA A Receptor - mediated Synaptic Inhibition in Hippocampal Interneurons. Anesthesiology. 94 (2), 340-347 (2001).
- Jackson, J. I., Meyer, C. H., Nishimura, D. G., Macovski, A. Selection of a convolution function for Fourier inversion using gridding. IEEE Trans. Med. Imag. 10 (3), 473-478 (1991).
- Glover, G. H., Lee, A. T. Motion artifacts in fMRI: comparison of 2DFT with PR and spiral scan methods. Magn. Reson. Med. 33 (20), 624-635 (1995).
- Kim, D. H., Adalsteinsson, E., Spielman, D. M. Simple analytic variable density spiral design. Magn. Reson. Med. 50, 214-219 (2003).
- Friston, K. J., Harrison, L., Penny, W. Dynamic causal modeling. Neuroimage. 19, 1273-1302 (2003).
- Alkire, M. T., McReynolds, J. R., Hahn, E. L., Trivedi, A. N. Thalamic microinjection of nicotine reverses sevoflurane-induced loss of righting reflex in the rat. Anesthesiology. 107 (2), 264-272 (2007).
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol. Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).
- Aschauer, D. F., Kreuz, S., Rumpel, S. Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain. PLoS ONE. 8 (9), 1-16 (2013).
- Liu, J., et al. Frequency-selective control of cortical and subcortical networks by central thalamus. eLife. 4, e09215 (2015).
