Introduction
المقايسات خلية مقرها الحساسة والميكانيكية تسمح للتحقيق في الخلايا الملتصقة، مع مجموعة واسعة من التطبيقات التي تعكس الدور المحوري الذي يمكن أن تلعبه الميكانيكا في بيولوجيا الخلية. هذه التطبيقات غالبا ما تركز على الآليات الأساسية التي تقود عمليات التحت خلوية أو السلوك خلية كاملة. من جهة، يمكن أن العوامل البيئية الخارجية مثل اضافية تكوين مصفوفة الخلوية أو مصفوفة الصلابة تؤثر بشكل كبير على الاستجابة الميكانيكية والبيولوجية للخلية. 1 والشيء نفسه يمكن ملاحظتها بعد استخدام فئات كثيرة من المركبات النشطة صيدليا، وآثار والتي هي غالبا ما تتميز باستخدام نماذج ثقافة الخلية. 2 وفي غيرها من الخصائص الوراثية اليد، مثل تلك التي تسببها طفرات جينية عفوية أو تجريبيا يسببها، ويمكن أن تحدث تغيرات ملحوظة في النمط الظاهري الخلية التي ترتبط مع التغيرات في بنية الهيكل الخلوي وظيفة. 3 هذه الأمثلة ل فقط عدد قليل من كثير ممكنالموضوعات التي phenotyping الميكانيكي للخلايا هو ذات الصلة، وجرى التحقيق مع كل هذه مفيدة مع المصفوفات micropost.
وفي وقت كتابة هذا التقرير، تم نشر ما يقرب من 200 المقالات التي تصف التفاعل خلية micropost. هذه الأعمال مناقشة الجوانب النظرية للمبادئ انحراف micropost وكذلك الإرشادات العملية على صنعها. تم نشر المقالة الأولى التي تصف التفاعل بين الخلايا والمصفوفات micropost مرنة تان وزملاؤه في عام 2003. 4 وعلى النقيض من الكلاسيكية المجهري قوة الجر (TFM) حيث تستخدم ركائز لينة مستمرة لتقدير انقباض الخلايا nanonewton النطاق، تان وآخرون. وصف طريقة استخدام عدة عوارض رأسية متباعدة عن كثب مصنوعة من السيليكون والمطاط الصناعي. المزايا الرئيسية لهذه التقنية الخروج من اثنين من السمات الرئيسية. أولا من أجل تغيير خلايا واضحة الركيزة صلابة واحد يحتاج فقط إلى تغيير أبعاد micropost مع الحفاظتكوين الركيزة خلاف مستمر وبالتالي تجنب الاختلافات في طوبولوجيا السطحية والكيمياء. microposts الثانية تتصرف مثل الينابيع الفردية التي يمكن تحليلها بتحفظ مع قوة ودقة مكانية بناء على أمر من الالتصاقات البؤرية الفردية ويمكن أن تقلل من التحديات التحليلية التي هي ملازمة لتحليل مماثل من قبل ستاندرد TFM.
اليوم مجموعة من التطبيقات للصفائف micropost يتجاوز بكثير مجرد رسم الخرائط من القوات لبضع خلايا مفردة. على سبيل المثال، أكياما تقارير استخدام من الأنسجة سفينة ظهري معزولة عن يرقة العث بمثابة المحرك للمجموعة micropost، من أجل وضع الحشرات التي تعمل بالطاقة العضلية مستقلة الصغرى الروبوت. 5
ومع ذلك، فقد ركزت معظم التطبيقات المنشورة microposts على دراسات الحالات الطبية مثل العدوى أو السرطان. على سبيل المثال، تم استخدام المصفوفات micropost لدراسة توليد قوة المجمعة النوع الرابع الشعرة لبكتيريا gonorrhالمستعمرات أويا مقترن شلالات إشارة المعززة للعدوى. وقد استخدمت 6 آخرون microposts لدراسة خلايا سرطان الثدي تعامل مع المركبات الدوائية استهداف الهيكل الخلوي. 7
غالبا ما يوصف انحراف لmicropost باستخدام نظرية الكلاسيكية شعاع لناتئ مع نهاية الحمل على افتراض الخلية تعلق فقط على الحافة جدا من micropost. هنا F القوة المطبقة التي تسبب δ انحراف يعتمد على micropost في "الانحناء صلابة" ك ويحسب عن طريق:
(1)
مع E، I، وL يجري معامل يونغ، لحظة مجال الجمود وشعاع طول التوالي. ومع ذلك، النتائج من هذه المعادلة تعطي سوى تقريب العام للقوات في العمل منذ شعاع القص والثني وكذلك لا تؤخذ تزييفها الركيزة في ميلانالعد. وبالنظر إلى أن microposts تكون عادة مصنوعة من مواد لينة مثل polydimethylsiloxane (PDMS) المستندة مطاط السيليكون تحتاج هذه العوامل التي ينبغي إدراجها. . شوين آخرون أثبتت أن هناك مثل هذا عامل التصحيح بناء على نسبة العرض إلى الارتفاع micropost (L / D) والبوليمر المقابلة للنسبة بواسون ضد 8 وتعطى من قبل:
(2)
مع الميل T (ت) أن يكون معامل إمالة يتضمن كما يمكن العثور عليها في المادة نفسها المناسب المعلمة = 1.3:
(3)
وهذا يعني صلابة وmicropost لتصحيح ك المراسل هو نتاج خالص الانحناء صلابة ك = ك الانحناء ومعامل التصحيح نيوسقدمها:
(4)
لذلك، يجب أن يتم تنفيذ العمليات الحسابية قوة الخلية باستخدام الاختلاف أكثر دقة من المعادلة (1) القراءة الآن:
(5)
تأثير التصحيح يصبح أكثر وضوحا في أقرب وقت يتم استخدام القيم النموذجية لأبعاد micropost. على سبيل المثال، micropost 15 ميكرون طويل مع المقطع العرضي دائري وقطره 5 ميكرومتر المصنوعة من المطاط سيليكون القائمة على PDMS-يؤدي إلى معامل التصحيح 0.77 وبالتالي على حساب غير المصححة أن المبالغة قوات خلية المبذولة بنسبة 23٪. هذا يصبح أكثر حدة لmicroposts مع نسب أصغر.
تقليديا، كما تم على أساس micropost تحليل الصورة على شعاع المثالي نظرية الانحناء. في عام 2005 المجموعة التي كانت رائدة في استخدام ميكرصفائف opost نشرت برمجيات تحليل صورة مناسبة لتحليل micropost 9 البرنامج يتطلب ترخيص البرمجيات ويجب على المستخدم أن تأخذ ثلاث صور لكل موقف؛ واحد من كل من أعلى وأسفل طائرات micropost في اسطة نقل واحدة أخرى في وضع مضان مع الخلية الملون. بعد مقارنة المناصب العليا والسفلي لكل micropost البرنامج يحدد حقل القوة ناقلات ويحسب المعلمات ذات الصلة مثل قوة لكل وظيفة. وجود حزم البرامج الأخرى وذكرت المبادئ تحليلهم لفترة وجيزة في المواد ذات الصلة التي تصف لهم، ولكن هذه حزم البرامج التحليلية هي عموما ليست متاحة للجمهور. 10،11
ويمكن تصنيف صفائف micropost مصممة للقوات خلية رسم الخرائط إما يجري في تخطيط micropost متعامد أو أحد سداسية، وهذه الأخيرة التي لديها ميزة الثغرات مسافة واحدة بين جميع microposts الجار. microposts نموذجية هكتارلقد مقطع عرضي دائري وأبعادها تتراوح من 1.0 ميكرون إلى 10 ميكرون في القطر و2-50 ميكرون في الطول. 4 ومع ذلك، كما تم الإبلاغ عن microposts مع المقطع العرضي بيضاوي الشكل أو مربع. 12،13
استخدام مخاليط سيليكون استنادا PDMS-كمادة micropost يسمح لإضافة النانوية إلى الخليط. على سبيل المثال إضافة الكوبالت النانو قضبان تمكن التنشيط المغناطيسي للmicropost وبالتالي يعطي آخر درجة من الحرية للتصاميم تجريبية المحتملة. 14 معظم الجماعات تنتج صفائف micropost على ركائز صلبة مسطحة مثل غطاء زجاجي أو داخل طبق بتري. ومع ذلك، ذكرت مان وزملاء العمل مؤخرا مجموعة micropost شكلت على غشاء لمط 15 يسمح هذا التطبيق من خلية القوات تمتد إلى الخلايا الملتصقة أثناء دراسته يعيش خلايا التحت خلوية الردود ديناميكية من حيث انقباض الخلايا.
العاملين على نطاق واسع، ومعظم إنشوتستند عملية أسسنا لجعل صفائف micropost على الطباعة الحجرية الناعمة كما هو موضح في البروتوكولات الثاقبة من Sniadecki والزملاء. 16-18 في عمليات غرف الأبحاث قياسية قصيرة وتستخدم لتوليد المجهرية على رأس رقاقة السيليكون باستخدام مقاومة للضوء SU8. ويلي ذلك عملية النسخ حيث يلقي المطاط سيليكون على هياكل نقلها إلى قوالب. في الخطوة الثانية وتستخدم هذه القوالب لتكرار المجهرية الأولية باستخدام المطاط سيليكون على رأس الركيزة المختار. ولكن على الرغم من العدد الكبير والمتزايد من المنشورات المتعلقة تطبيقها، وإنشاء عملية التصنيع لmicroposts يأخذ قدرا كبيرا من الوقت حتى لخبراء الهندسة الدقيقة. هناك العديد من الخطوات العملية التي تتطلب التحسين والتكيف مع بيئة معملية محددة وتخطيط micropost أن يؤديا إلى مستوى جودة مقبول.
صفائف micropost التجارية متوفرة الآن في استعداد رس استخدام ("خارج على الرف") تنسيق مع جودة عالية على الدوام. على هذا النحو فهي بديل لعملية التصنيع المعقدة والطويلة اللازمة لإنتاج في الموقع. في هذه الورقة تم استخدام مجموعة micropost المتاحة تجاريا لرسم خرائط القوات الخلوية باستخدام مشرق الميدان صورة واحدة المجهري. الأهم توضح هذه المادة ويوثق تماما وظيفية برمجيات المصدر المفتوح اسمه MechProfiler، والذي يتوفر للتحميل كمادة تكميلية لهذه المخطوطة. نسخة الحفاظ بنشاط من البرنامج يمكن أيضا الاطلاع على http://www.orthobiomech.ethz.ch.
مزيج من "حاضرة" فحص وتحليل البرمجيات مفتوحة المصدر متوافق يخفض بشكل ملحوظ العقبة دخول إلى تحقيق تجارب TFM دقيقة. يمكن للباحثين من دون الوصول إلى أي مرافق غرفة نظيفة أو الخبرة لتطوير البرمجيات تحليل قوات الخلوية بنجاح. انها تمكن المستخدم من التركيز على mechanosensitivity الناتج الفحص بدلا من التكنولوجيا في حد ذاتها، ويجعل قياسات قوة الجر المتاحة للمجتمع الأوسع. وعلاوة على ذلك، وهذا هو خطوة هامة لتمهيد الطريق نحو الفحص التلقائي بالكامل من صفائف micropost.
برامج التحليل MechProfiler بمعالجة الصور في ملف تنسيق TIFF، PNG، BMP و JPG. يمكن أن تؤخذ الصور باستخدام مضان، الطوري أو مشرق الميدان المجهر الضوئي. تشغيل برنامج مستقل مع حرية ماتلاب مترجم وقت التشغيل (متوفر على العنوان التالي: الشكل 12) والخوارزميات الكامنة تسمح لمعالجة الصور مبسط، والتي تمكن المستخدم من معالجة الصور مع الخلايا وحيدة أو متعددة في حوالي 1 دقيقة. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا قد تكون إما يعيشون أو "ثابتة".
برنامج MechProfiler قادر على زيادة كبيرة في تحليل البيانات الإنتاجية من خلال الاعتماد على استنساخ صفائف micropost التجاري الجودة، وبشكل أكثر تحديدا، الافتراضي & #8220؛ غير نحيد "موقف كل وظيفة في مجموعة يمكن افتراض ضد شبكة مثالية (الانحرافات التصنيع للحصول على الشبكة في صفائف المستخدمة في هذه الدراسة كانت أقل من 100 نانومتر).
في واحد قصير يفتح مجموعة مختارة من ملفات الصور لتحليل والمحاصيل منهم إلى المنطقة من الفائدة، ويحدد المشاركات التي كتبها مغطاة بخلايا أو التي تحتاج إلى التخلص منها، ويحدد المواقف آخر، وحساب الانحرافات / القوات ضد الشبكة المثالية، وأخيرا يوفر جميع البيانات خلية محددة مع وجود إمكانية للتصدير، بما في ذلك جدول المكتبية العادية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. خلايا التثقيف على Micropost صالحة
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية لضمان العقم. وبالنظر إلى الكميات هنا هي لT25 قوارير زراعة الخلايا. هي الأمثل والمتوسطة وصفة وبذر خلية كثافة زراعة الخلايا للخطوط الخلايا السرطانية العظام HuO9 وM132.
- إعداد ثقافة خلية لزرع البذور على مجموعة micropost.
- تفقد نوعية ثقافة الخلية عن طريق وضع قارورة الثقافة على المجهر ضوء معيار. تأكد من أن الخلايا تظهر نمو نموذجي والتشكل من خلال تقدير كم من أسفل قارورة الثقافة وتغطيتها. A تغطية 70٪ -80٪ تعكس معدل نمو صحي. إيلاء الاهتمام لكمية من الخلايا العائمة لأنها تمثل الخلايا الميتة و / أو ثقافة متضخمة.
- يعرض للتريبسين الخلايا عن طريق إزالة المتوسطة وغسل 4 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) العازلة. إضافة 0.8 مل 1X التربسين / ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) واحتضان في RT حتى الخليةالصورة طرد، والتي تأخذ حوالي 2-4 دقائق. تحقق من هذه العملية مع المجهر وأحيانا الاستفادة من القارورة بلطف لدعم تهجير.
- إضافة 5 مل مستنبت الخلية (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) / F12 مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، 1٪ البنسلين / streptavidin (القلم / بكتيريا)) لوقف رد فعل ويغسل الخلايا المتبقية التي لا تزال الجلوس في أسفل القارورة. وفي وقت لاحق ماصة هذا التعليق صعودا وهبوطا عدة مرات للحصول على مزيج متجانس. تأكد من ماصة جميع الحلول في جميع أنحاء منطقة نمو الأصلية للقارورة لكسب تهجير فعال.
- نقل تعليق خلية في لأنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي باستخدام أحد كبار الطرد المركزي في الجدول 0.5 x ج لمدة 3 دقائق.
- إزالة طاف واعادة تعليق بيليه خلية في 5 مل المتوسطة من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات. تأكد لتجنب توليد فقاعات أثناء القيام بذلك.
- تحديد كثافة الخلية باستخدام غرفة عد الخلايا وmicrosco خفيفةالمؤسسة العامة. تحقق من تعليق خلية في غرفة العد خلية لخلية المجاميع وضمان أن يكون الخلايا واحدة فقط للتجربة لاحقة. ماصة مرة أخرى صعودا وهبوطا عدة مرات إذا كانت الخلايا تميل الى تشكيل مجاميع للفصل بينهما.
- تمييع تعليق الخلية مع متوسط كافية للحصول على حل الخلية من 25000 خلية / مل. يخلط المزيج جيدا بواسطة أنبوب عكس مغلقة عدة مرات.
- إعداد مجموعة micropost لزرع الخلايا.
الحرجة ملاحظة: لا ماصة على مجموعة micropost مباشرة وهذا يحتمل أن تضر microposts، وخصوصا عندما يتم إدخال فقاعات غير المرغوب فيها. وعلاوة على ذلك، تأكد من أن مجموعة micropost أبدا يجف كما تحدث قوات الشعرية تؤدي إلى الانهيار من microposts.- وضع الركيزة الزجاج مع مجموعة micropost مواجهة في بئر من لوحة 12-جيدا باستخدام زوج من ملاقط والرطب عن طريق إضافة 1 مل ايثانول (99٪). في احتضان RT لمدة 20-30 ثانية.
- تمييع الإيثانولالتدرجي عن طريق إضافة حوالي 1 مل-المتأينة الماء المعقم (DI الماء) على الجانب جيدا والشفط ما يقرب من 1 مل باستخدام ماصة نقل أو الجهاز التنفسي. كرر هذه الخطوة 3 مرات على الأقل.
- استبدال DI-الماء مع PBS العازلة بنفس الطريقة عن طريق إضافة والشفط حوالي 1 مل. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
- استبدال PBS عازلة مع المتوسط عن طريق إضافة والشفط حوالي 1 مل من المتوسط. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
- ماصة الحل 1 مل الخلية (25000 الخلايا) على رأس كل مجموعة micropost المعدة. إغلاق لوحة متعددة جيدا وتحويلها إلى حاضنة (CO 2 5٪، 37 ° C). السماح للخلايا الالتزام وتنمو على رأس microposts لمدة 6 -7 ساعة.
- تفقد عملية التصاق بعض الأحيان باستخدام ضوء المجهر. تحقق من أن معظم الخلايا تظهر انتشرت عبر microposts متعددة.
2. إصلاح وتلطيخ الخلايا
ملاحظة: جميع الخطوات ووبالنظر إلى الكميات هنا هي لبئر واحدة من لوحة 12-جيدا. فمن المستحسن أن العملية لا يزيد عن أربعة من اثني عشر بئرا في وقت لتجنب جفاف الآبار بعد تطلع أي سائل، الأمر الذي سيؤدي في انهيار microposts.
- نضح المتوسطة من البئر وغسل خلايا 2X مع 1 مل PBS عازلة. للتأكد من تطبيق قوة لطيف في حين غسل مع PBS لإزالة الحطام الخلية التي تراكمت على مجموعة micropost أثناء الحضانة وفصل الخلايا الميتة.
- إصلاح الخلايا مع 0.5 مل 3.7٪ محلول الفورمالديهايد مخزنة لمدة 5 دقائق.
- استبدال حل الفورمالديهايد من قبل غسل 2X مجموعة micropost مع 1 مل من الماء DI العقيمة.
- وصمة عار على الخلايا مع صبغة (0.05٪ Coomassie بريليانت الأزرق في الماء 50٪، 40٪ من الإيثانول وحمض الخليك 10٪) لمدة 90 ثانية. غسل حل تلطيخ الزائد 2X مع 1 مل من الماء DI العقيمة. إضافة 1 مل من الماء DI إلى micropost مجموعة.
- تحقق نتيجة تلطيخ باستخدام المجهر الضوئي. كرر رانه تلطيخ الخطوة، إذا خلايا الجسم هو خافت جدا بحيث لا يمكن تصور.
- صفائف مخزن micropost مع الخلايا الملون على رأس القائمة في الثلاجة على 4 درجات مئوية. ضمان لإبقائهم تحت الماء في جميع الأوقات.
التصوير 3. خلية
ملاحظة: الخطوة 4 يطبق فقط على المجاهر دون اللانهاية تصحيح البصريات.
- إضافة 2 مل DI-المياه إلى طبق بيتري مع قاع زجاجي رقيق للالتصوير عالية الدقة.
- نقل مجموعة micropost باستخدام زوج من الملقط في طبق التصوير مع microposts مواجهة.
- وضع التصوير طبق بتري على خشبة المسرح المنقولة من المجهر الضوئي.
- تحويل عصابة تعويض العدسة المستخدمة في التصوير حتى الرقم على نطاق ويمثل سمك الكلي لجميع المواد على طول مسار بصري للتعويض عن عدم تطابق في مؤشرات الانكسار الركيزة الزجاج، والمطاط الصناعي السيليكون والسائل على القمة. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى مظهر مشرق من micropostsالنوى.
- إغلاق القزحية على الجانب الإضاءة وصولا الى 50٪ وإزالة أي حلقات المرحلة النقيض من مسار بصري تمكن من وضع مشرق الميدان العاديين.
- محاذاة مجموعة micropost أن microposts شكل خط أفقي عبر مجال المراقبة. تحديد نقطة البداية (على سبيل المثال، أعلى اليسار) ونقل طبق بيتري تدريجي عبر المرحلة مسح مجموعة micropost في حين أخذ العديد من الصور.
- اتخاذ جميع الصور مع أعلى دقة الإعداد للكاميرا باستخدام الهدف 20X 40X أو. نهدف إلى أن خلية واحدة في وسط الصورة.
- اكتساح على طول محور Z من خلال الركيزة حتى نصائح micropost هي في التركيز. استخدام غرامة عجلة ضبط تركيز المجهر وتحويلها نحو التركيز على الجزء السفلي micropost لحوالي 2-3 ميكرون.
- وضع إجراء التصوير القياسية من خلال اتخاذ سلسلة من الصور اختبار واحد قسم مجموعة تجتاح المعلمات التصوير في وقت واحد (على سبيل المثال، وقت التعرض،وضع قزحية، إعدادات مصباح الخ). تحليل الصور مع MechProfiler وتحديد مجموعة المعلمة مناسبة لتحليل سريعة وموثوق بها.
تحليل 4. صورة مع برامج المصدر المفتوح "MechProfiler"
ملاحظة: يمكن تفعيل جميع وظائف البرنامج مع جهاز تأشير باستخدام زر الماوس الأيسر. ومع ذلك، فإن عامل المدربين استخدام مفاتيح الاختصار وثقت مصممة لتكون على النصف الأيسر من لوحة المفاتيح لتمكين باليدين معالجة الصور كفاءة.
- بدء تحليل الصور برنامج MechProfiler وفتح مجموعة من الصور التي تحتاج إلى تحليل بالنقر على "فتح".
- إدراج جميع المعلمات في قسم "الإعدادات" التي قدمها مطور برمجيات. تحديد المعايير التي يجب تكوين مخصص (أي عتبة كفاف والحد الأدنى من المسافة) وفقا للإجراءات وصفها بالتفصيل دليل البرامج.
- تحليل صورةالصورة واحدة تلو الأخرى من قبل الاقتصاص منهم لمجال الاهتمام باستخدام "اقتصاص" (انقر واسحب مع ضغط زر الماوس لأسفل). انقر مرتين داخل المستطيل رسمها لإنهاء هذا الإجراء.
- بمناسبة كل مخطط الخلية مرئية واحدة من جانب واحد عن طريق النقر على "رسم الخطوط العريضة خلية" واستخدام المؤشر الشعر عبر عن الرسم بما في ذلك جميع microposts يتم إرفاق الخلية.
- تجاهل أي microposts غير المرغوب فيها بالنقر على "تجاهل المشاركات" واستخدام المؤشر الشعر عبر عن رسم. أرفق كل microposts التي تنتمي إلى خلية خارج القسم صورة أو التي تهرب لأي سبب آخر ولكن ليس من قبل خلية من الفائدة.
- بدء برنامج فرعي "البحث Centroids" عن طريق النقر بالماوس. ضبط مرشح وضع بجوار زر "البحث Centroids" حتى يتم تسجيل جميع microposts، وهو أمر واضح من قبل الصليب الأحمر في مركزهم. إذا كان الإعداد المرشح هو أيضا سيتم تجاهل microposts منخفضة، وإذا كان مو عالية جداسيتم وضع علامة مواقف ltiple لmicropost واحد. الحفاظ على تصفية وضع ثابت خلال جلسة التحليل.
- استخدام دليل وظيفة تحرير "تحرير يدوي" لcentroids مع مواقف micropost متعددة أو غاب. استخدام الماوس عبر الشعر لتحديد micropost في السؤال عن طريق النقر وسحبه عبر. انقر مرتين داخل المستطيل ووضع علامة حمراء في عداد المفقودين في قسم صورة الموسع، الذي يغلق تلقائيا. تجاهل مثل هذه micropost إذا كان خارج المخطط التفصيلي الخلية تعادل (راجع الخطوة 4.5) قبل المتابعة.
- العثور على شبكة micropost مثالية من خلال تفعيل "إنشاء شبكة" وظيفة مع النقر بالماوس. ضمان موقف يتوافق مع رئيس micropost صحيح، كما هو موضح من قبل عصابة زرقاء، داخل المخطط التفصيلي الخلية استخلاصها.
- تصحيح أي صانع الشبكة في غير محله داخل منطقة الخلية حيث الحاجة باستخدام الدالة المناظرة "مانويل تحرير" مع النقر بالماوس. استخدام الشعر عبر لتحديد micropost في تشوestion عن طريق النقر وسحبه عبر. انقر مرتين داخل المستطيل الظهور ووضع علامة زرقاء المفقودة في القسم صورة الموسع، الذي يغلق تلقائيا.
- استخدم زر "حساب الإمالات" عن طريق النقر بالماوس للحصول على الرسم البياني للانحراف القيم محسوبة على أساس الفرق بين موقف وmicropost من داخل قسم صورة وشبكة مثالية ولدت.
- حفظ تحليل كامل بما في ذلك جداول القيم عن طريق النقر بالماوس على "حفظ".
- مواصلة تحليل الصور إما عن طريق النقر على "إعادة نظر" وتحليل قسم آخر صورة أو النقر بالماوس على "الصورة التالية"، الذي مريح يمكن أن يتم ذلك باستخدام مفتاح القاذف لوحة المفاتيح الصحيح.
5. تحليل البيانات - Mechanoprofiling
- فتح ملف "results.xls" مع برنامج جدول بيانات مكتب من المجلد الذي يحتوي على الصور التي تم تحليلها. أنه يحتوي على البيانات مع تنظيم القاعدةل القيم المحسوبة بما في ذلك جميع الانحرافات micropost والتدابير المشتقات القياسية مثل العمل (أي الطاقة الركيزة تشوه) من قبل خلية تحليلها.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
والميزة الرئيسية لهذه التقنية وصفها تكمن في بساطته وإمكانية الاندماج السريع والفعال في العمل في المعمل الروتيني. مزيج من جودة عالية صفائف استشعار التجارية يقترن برمجيات المصدر المفتوح يوفر معلومات حول والميكانيكية الحساسية التي من شأنها أن تتطلب خلاف ذلك إمكانية الوصول إلى مرافق غرف الأبحاث والمعرفة المتعمقة من تحليل الصور وتطوير البرمجيات. الشكل 1 يوضح سير العمل وطريقة عرضها. وهي تبدأ مع إعداد وبذر خلايا على مجموعة micropost. بعد تحديد وتلطيخ الخلايا صفائف micropost جاهزة للتصوير. الجزء الأوسط من هذه التقنية هو تحليل الصور باستخدام برنامج MechProfiler. ويمكن للمستخدم بدء analyszng الصور مباشرة بعد دخول جميع المعلمات ذات الصلة في "إعدادات" من واجهة المستخدم الرسومية. حجم بكسل المقابل هو طول أن يمثله بكسل واحد ويعتمد على الإعداد للمستخدم. انها تحتاجتنشأ بشكل منفصل لكل التكبير المستخدمة من قبل التقاط الصور من الكائنات مع حجم معروف. تم اعطاء مثال في الشكل التكميلي 9.
جودة الصورة هي عامل رئيسي لأنها تؤثر بشدة عملية التحليل. من أجل تحقيق أعلى مستوى من الجودة ينبغي لأحد أن نتأكد من أن يكون منصة التصوير مستقرة والخدمات بشكل روتيني كما هو مبين في الشكل 2. وعلى وجه الخصوص، والمواءمة بين مصدر الضوء لا يقل أهمية عن اختلال سيتسبب الظلال غير المرغوب فيها التي يمكن أن يكون مشكلة عند تحليل الصور. وعلاوة على ذلك، وضع مجهر الضوء على قمة جدول مضادة للاهتزاز أو لوحة هو مفيد في معظم المختبرات لأنها تعطي الاستقرار إضافية أثناء التصوير.
وتشمل مزايا استخدام كوب رقيقة أسفل طبق بيتري للتصوير القيم الفتحة العددية أعلى الفعالة التي تترجم إلى صور أكثر إشراقا مع زيادة القرار.
عندما تقينانوغرام الصور في وضع مشرق الميدان ينصح 50٪ قزحية مغلقة، كما تركز على نصائح microposts مما يسهل نظرا لمحيطات يبدو وكأنه حلقة مظلمة هش. وعلاوة على ذلك، في حالة الهدف المستخدمة لديه حلقة التعويض، لا بد من تعيينها بشكل صحيح لتحقيق قراءات القوة دقيقة. أثر هذه الميزة يمكن أن ينظر إليه من خلال مقارنة الشكل 3A و 3B الشكل. الصور التي يمكن تحليلها بسرعة تتحقق من خلال الجمع بين الإعداد الصحيح للحلقة تعويض جنبا إلى جنب مع الإضاءة المثلى كما هو مبين في الشكل 3C. تباين قوي بين micropost ومحيطها يقلل من الوقت تحليل لأنه يسرع خوارزمية البحث. وسيكون للمستخدمين العثور على ما هو مطلوب خبرة الحد الأدنى فقط لتحقيق الصور التي يمكن تحليلها بكل سهولة.
الأهم من ذلك، البروتوكولات فوق التغلب على عقبة حاسمة ومشتركة لتحقيق التكامل السريع والفعال لصفائف micropost إلى روتينالعمل في المعمل. تنبع هذه العقبة من ضرورة مراقبة جودة مجموعة - وهو مطلب يمكن تحقيقه إلا من خلال توصيف تجريبي شامل ومفصل من أجهزة الاستشعار استنساخ، والحساسية والدقة. ومع ذلك، من خلال تحويل صفائف micropost المتاحة تجاريا يتم تجنب هذه العقبة الكبيرة تماما. أرقام 4A و 4B توضيح دقة مثل مجموعة micropost. انحراف موقف microposts جيدا تحت 200 نانومتر، وعلى هذا النحو يمكن مقارنتها مع "خطأ بكسل" التي ترافق الكاميرا / مزيج موضوعي التي أسفرت عن حجم بكسل 82 نانومتر لإعداد المستخدمة. يوضح تحليل الصور مع خلايا تشتيت microposts أن قيم انحراف المفروضة الخلية هي أعلى بكثير من 200 نانومتر (كما هو موضح في الشكل 4C والشكل 4D) مما يؤدي إلى إشارة مريحة إلى نسبة الضوضاء.
الرقم 5 illustratوفاق أنواع مختلفة من مباراة لmicroposts داخل صورة تبعا ما إذا كان نحيد ذلك أم لا. كما ذكر أعلاه microposts غير نحيد لها مظهر مشرق الدائري مع عصابة الظلام من حولهم. موقفهم يمكن تحديد باستخدام التحول هوغ، وهي تقنية استخراج ميزة لتحليل الصور الرقمية.
وعلاوة على ذلك، فإنه يدل على أن microposts تسديدة على مجهر مقلوب تظهر اثنين من مواجهة الأشكال نصف القمر المظلمة (انظر الشكل 5A). في المجهر تستقيم حافة الحافة micropost والظلام شكل نصف القمر واحد وبشكل صحيح واضحة في حين أن الثانية يصبح من الصعب اكتشافها. هذه الخصائص هي أساسا لحساب مواقف الصور مجهر حقل مشرق من النصائح من microposts تهرب، الذي تم تطويره لهذا البروتوكول، وكان اسمه "محيط النهج".
الرقم 5B هو مثال واحد من سرطان العظام HuO9خلية في microposts تصوير على مجهر مقلوب (أعلى). النسخة تحليل تلك الصورة تظهر النتائج من نهج كفاف التطبيقية (القاع). وقد اتخذ الشكل 5C باستخدام نفس مجموعة micropost مع المجهر تستقيم (أعلى). مرة أخرى النسخة تحليلها وتبين النتائج من استخدام النهج كفاف.
تبدأ كل دورة تحليل الصور من قبل المستخدم التحقق من المعلمات في قسم "الإعدادات" لMechProfiler. وفيما يلي بعض من قبل الشركة المصنعة micropost مثل micropost أبعاد مجموعة ربيع وثابتة. يتم تعريف الآخرين من قبل المستخدم مثل قيم عتبة كفاف وعتبة انحراف الحد الأدنى وفقا للإجراءات المبينة في دليل البرنامج. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن هذه القيم ينبغي اختيار بعناية ويجب أن تكون ثابتة لجميع الصور ضمن مجموعة مترابطة من الصور لضمان إمكانية المقارنة. في حين أن خطوات المعالجة المسبقة للصورة تحليل سياسيالصورة، مثل زراعة المحاصيل، وشرح الذاتي الاستراتيجيات الكامنة وراء وظائف البرنامج مثل "العثور على Centroids"، "إنشاء شبكة" و "كونتور نهج" الحاجة تفسيرات أكثر تفصيلا.
كشف حسابي من موقف micropost الافتراضي (كما تسليمها من قبل الشركة المصنعة) يبدأ باستخدام "centroids العثور على" وظيفة البرنامج. تبدأ الخوارزمية في الزاوية العليا اليسرى للصورة تبحث عن micropost الأول. وفي وقت لاحق تم العثور على جميع microposts الأخرى على أساس إحداثيات أن micropost الأول بالإضافة إلى القيم لشبكة وmicropost حجم معين من قبل الشركة المصنعة في أعقاب الهندسة سداسية. يتم احتساب النقطه الوسطى لكل micropost العثور على استخدام تحولا هوغ. المنزلق مرشح بجوار زر الأمر من واجهة المستخدم الرسومية يسمح ضبط حساسية من هذا التحول. وتتميز جميع microposts جدت مع وجود الصليب الأحمر وأشار مواقعهم لسوعمليات bsequent.
المقبل، وظيفة "إنشاء شبكة" يؤدي إلى إحداثيات كل microposts النصائح. هم النتائج من عملية متعددة الخطوات. أولا تحل وظيفة الأمثل بما في ذلك المواقف الأولية من تنفيذه الخوارزمية السابقة "البحث centroids" لإنشاء شبكة مثالية. ثانيا تحسب مواقف microposts داخل منطقة الخلية. تتم معالجة Microposts مع أقل انحراف من المعرفة في إعداد المعلمة "الحد الأدنى للعتبة انحراف" نسبة إلى شبكة مثالية مع التحول هيو. يتم احتساب جميع البنود micropost طرف أخرى باستخدام نهج كفاف المذكورة أعلاه لmicroposts نحيد. هنا البرنامج يبدأ البحث من النقطه الوسطى الأولية بعيدا عن مركز الخلية لحافة دائرية (مشرق إلى الظلام) ضمن زاوية 15 درجة (انظر الشكل 5A). مرة واحدة وجدت أن حافة دائرة بقطر micropost معين يتم تركيبها على رحافة قبعة باستخدام قيمة العتبة كفاف من الإعدادات في واجهة المستخدم الرسومية. تحدد تلك المعلمة التي يستخدم بكسل قيمة الرمادية لعملية تركيب. وكلما ارتفعت هذه القيمة هي أكثر المناسب يميل نحو مركز micropost أكثر إشراقا وأقل أن نقدر أكثر تناسبها أن الدائرة إلى مخطط micropost أغمق. بمجرد اختيار هذه القيمة يجب أن تبقى ثابتة لتحليل كل صورة ضمن دراسة بالنظر الى تجنب إضافة انحراف الاصطناعي، أو الدعوة إلى الانحرافات متحفظ جدا.
على سبيل المثال، يوضح الشكل (6) على أهمية اتخاذ قرار لقيمة عتبة كفاف المناسبة. البرنامج يسمح للمستخدم أن يختار لمجموعة واسعة (0،1-0،9) ليشمل جميع الحالات الممكنة الإضاءة جسديا. ونظرا لترجمة المعلومات البصرية إلى مسافات انحراف نظرا لكلا النقيضين وقيمة أكثر واقعية في الوسط في الشكل 6B. ومع ذلك، مستخدمي البرمجيات المدربين في كثير من الأحيان convergه إلى القيم الحدية كفاف مشابهة جدا، مما يؤدي إلى نتائج مماثلة كما يمكن أن يرى في الشكل 6C. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام إجراءات موحدة لتلطيخ الخلايا والتصوير يقلل من خطر القيم عتبة كفاف غير صالحة، والتي عادة يجب أن تبقى ثابتة داخل لمجموعات مترابطة من الصور.
من أجل إثبات متانة الأسلوب وتتلخص مجموعة مختارة من النتائج التنميط والميكانيكية في الشكل 7. في ومقارنة الشكل 7A نتيجتين من خلايا سرطان العظام HuO9 واثنين من M132. جميع المصفوفات الأربعة هي من نفس دفعة الإنتاج، وبالتالي لها خصائص ميكانيكية متطابقة. تم إجراء التحليل مع مجموعة ثابتة من المعلمات من أجل الحد الأدنى من انحراف (0.25 ميكرون)، وللعتبة كفاف (0.125). بالإضافة إلى ذلك، أعطيت مجموعتين متطابقتين من الصور من SaOS سرطان العظام 2 إلى اثنين من المحللين دون مزيد من المعلومات حول إعدادات المعلمة (انظر الشكل 7B). تم اختبار تأثير تلطيخ على تحليل بأخذ الصور من خلايا سرطان العظام ملطخة Coomassie الأزرق R. وفي وقت لاحق تم إزالة الصبغة. بعد إعادة تلوين مع Coomassie الأزرق G اتخذ مجموعة ثانية من الصور. ويوضح الشكل 7C النتائج من كل مجموعة، والتي تم تحليلها من قبل المستخدم نفسه مع قيم متماثلة للانحراف الحد الأدنى (0.25 ميكرون)، وعتبة كفاف (0.25) .
ويرد مثال نموذجي لتطبيق والميكانيكية التنميط في الشكل 8A، حيث يتم تقديم بيانات جمعتها لسرطان العظام خطوط الخلايا HuO9 وM132 بعد تحليل 151 الخلايا مجمعة من كل أربعة صفوف. في هذه اللمحة عن قيم المؤشرات أعلى لHuO9 من لM132 تشير بالفعل إلى أن الخلايا HuO9 تطبيق أكثر قوة من M132. ومع ذلك، فإن البيانات من تحليل الصور يحتوي على كمية كبيرة من المعلومات وحيدة الخلية الإضافية التي يمكن استخراجها من المناجم إلى فهم أفضل كايسيotypic السلوك خط الخلية وتقلب الخلية الى خلية ضمن خط معين. من خلال تقديم النتائج للقوة في micropost في مؤامرة مربع واحد يرى أنه على الرغم الدنيا مماثل وماكسيما، توزع قيم البيانات بشكل مختلف، والواقع انخفاض خط الخلية النقيلي خلايا HuO9 تميل إلى تطبيق المزيد من القوة من خط M132 المنتشر للغاية (انظر الشكل 8B). وعلاوة على ذلك، من خلال تصنيف القيم التنفيذ بالنسبة إلى منطقة خلية واحدة يجد أن متوسط قوة في الخلية لا تكون مرتفعة فقط لخلايا HuO9 مقارنة M132 ولكن أيضا أن متوسط القوة في زيادة micropost مع انتشار الخلايا حتى متوسط القوة في المجرى آخر قيمة أكثر استقرارا (كما يمكن أن يرى في الشكل 8C). وعلاوة على ذلك لخلايا تغطي سبعة microposts القيم تكاد تكون متطابقة، والتي ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن تظهر عادة في شكل سداسي مع مركزية واحدة غير نحيد micropost مستقلة عن خط الخليوي. وبصرف النظر عن فرقالفروق في انقباض، يمكن قياس الاختلافات الشكلية مع نتيجة مثيرة للاهتمام. على سبيل المثال وعلى النقيض من الخلايا M132 المتنقل للغاية كان هناك عدد قليل جدا من الخلايا HuO9 التي غطت microposts ثلاثة فقط. مقارنات شكلية أخرى بين خطوط الخلايا يمكن إجراء، بما في ذلك توزيع مساحة الخلية التي يمثلها عدد من microposts مغطاة الشكل 8D يوضح أن خطوط الخلايا اثنين تختلف أيضا في ديناميكية السلوك ينتشر عندما المتزايد على رأس microposts. وباختصار، فإن mechanoprofile للخط الخلوي الوالدين HuO9 يكشف أنها تغطي عادة مساحة أكبر وتطبيق أكثر قليلا القوة لmicroposts في حين أن خط الخلية المنتشر M132، خلية العدوانية التي تستمد من HuO9، ويغطي مميز أقل microposts وينطبق أقل قوة في micropost . هذه النتائج تدل على احتمال وجود نهج قائم على TFM لتطبيقات التمييزية.
الشكل 2. إعداد التصوير. ويستخدم مجهر مقلوب معيار لتصوير الخلايا على المصفوفات micropost. ويتضمن الإعداد أيضا كاميرا المجهر وحدة تحكم، والتي يمكن أيضا أن توفر وظائف تخزين البيانات. الشاشة الكبيرة المعروضة يست ضرورية ولكنها مع ذلك مريحة للتصوير موسعةجلسات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. المبدأ التوجيهي للتصوير micropost. (A) صورة من الخلايا الملون على مجموعة micropost التي اتخذت مع عدسة 40X في وضع مشرق الميدان. microposts غير نحيد-تظهر عصابات الظلام كما هو الحال عندما تصويرها. المشاركات تسديدة تفترض شكل بيضاوي الشكل مع كل من المناطق الداكنة وأكثر إشراقا الفرعية. الخلايا الملون التي تغطي microposts يجعلها تبدو أكثر قتامة لدرجة أنه لا يوجد تباين بين micropost والخلية. (B) صور متطابقة اتخذت بعد ضبط عصابة تعويض العدسة وإعادة التركيز. هنا النوى من microposts تصبح أكثر إشراقا بشكل كبير وتعطي المزيد من التباين. (C) ونفس الموقف تصويرها مرة أخرى بعد موقف قابل للتعديلتينغ جميع المعلمات إضاءة مع وحدة تحكم الكاميرا. وmicroposts يقف بحرية تظهر الدوائر كما مشرقة مع عصابة الظلام. تظهر microposts تسديدة "ظل" مون نصف متميز في جميع أنحاء الأساسية خليج على طول المحور سحب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.>
الرقم 4. لقطات MechProfiler من microposts تحليلها. (A) والمثال النموذجي من فارغة ويمكن رؤية مجموعة micropost في هذه الصورة. يتم ترتيب microposts في نمط سداسية المستمر. (B) الرسم البياني مع القيم انحراف عن هذه microposts يبين أن جميع القيم هي أقل من 200 نانومتر. (C) مثال نموذجي لHuO9 العظام تغطي الخلايا السرطانيةوسحب على microposts متعددة. ويمكن ملاحظة أن كمية سحب غير متجانسة. (D) والرسم البياني مع القيم انحراف للخلية HuO9 يظهر طيف واسع من الانحرافات التي تنشأ من تفاعل الخلايا مع الركيزة micropost. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
يظهر الشكل 5. مباراة Micropost في الإضاءة مشرق الميدان واستراتيجيات لحساب موقفهم داخل صورة. (A) microposts غير نحيد كمنطقة دائرية مشرقة مع الطوق الخارجي المظلمة. يتم احتساب النقطه الوسطى من التحول هوغ. تظهر microposts نحيد المظلمة الأشكال نصف القمر. اعتمادا على الإعداد المجهر إذا تواجه microposts للمن ligh ر المصدر (على سبيل المثال، مجهر مقلوب) هناك نوعان مرئية جيدا الأشكال نصف القمر. إذا تواجه microposts عدسة (على سبيل المثال، المجهر تستقيم) واحد فقط نصف القمر مرئيا بشكل جيد ولكن أيضا حافة جدا من الحافة. في كلتا الحالتين يجب استخدام نهج كفاف لحساب طرف micropost. (ب) الأصلي صورة (أعلى) باستخدام مجهر مقلوب من HuO9 خلية سرطان العظام وإصدار تحليل لها (القاع) باستخدام نهج كفاف. (C) الصورة الأصلية من نفس مجموعة micropost (أعلى) باستخدام مجهر تستقيم والنسخة تحليلها، مرة اخرى بتطبيق نهج كفاف (القاع) ولكن مع أقل بكثير قيمة كفاف عتبة أكثر ملاءمة لاستدعاء الداكن حافة على شكل حلقة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تحميل / 53350 / 53350fig6.jpg "/>
الرقم 6. نهج كفاف واختيار قيمة العتبة المناسبة. (A) وتوضح لقطات ثلاث نفس microposts تحليلها باستخدام ثلاث قيم عتبة كفاف مختلفة. إذا تم تعيين قيمة إما منخفضة جدا (يسار) أو مرتفعة جدا (يمين) من البرنامج يناسب الحلقة الزرقاء التي تمثل رأس micropost بشكل غير صحيح. أنه يقلل أو انحرفت الموقف الحقيقي للرئيس micropost. قيمة عتبة اختيار صحيح تمكن البرنامج لتتناسب مع هذا الطوق الأزرق إلى نصف القمر على شكل منطقة مظلمة داخل micropost التي تشكل من خلال انحراف. (B) ويبين الرسم البياني متوسط كمية انحراف تعتمد على عتبة كفاف المختار للmicroposts هو مبين في أعلاه. ويوضح أيضا أن القيم لmicroposts خارج المخطط التفصيلي الخلية لا تتأثر منذ المناسب كفاف لا يطبق هناك. (C) ويوضح الرسم البياني أن اختيارقيمة عتبة ضمن فترة زمنية معتدلة minimalizes من خطر الإفراط أو التقليل من الانحرافات micropost. الفرق بين القيم التي يختارها المستخدمين تدريب مختلف هو عادة أقل من 0.05، مما يؤدي إلى اختلافات مقبولة في متوسط القيم انحراف. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. المتانة اختبار للحصول على نتائج والميكانيكية الشخصي من مختلف خطوط الخلايا السرطانية العظام. أشرطة الخطأ تمثل انحراف معياري واحد (A) والميكانيكية التنميط النتائج من أربعة صفائف micropost متطابقة بعد البذر الخلايا HuO9 على مجموعة 1 و M132 على مجموعة 3 - بذر بعد أربعة أيام HuO9 على مجموعة 2 و M132 على مجموعة 4. (B) مقارنة النتائج من مechano-التنميط استنادا إلى مجموعات متماثلة من الصور بعد التحليل من قبل اثنين من المحللين المستقلين. (C) مقارنة نتائج تحليل الصور من اثنين مختلفة سلسلة الصورة الأولى التي اتخذت بعد تلطيخ مع Coomassie الأزرق R والثانية بعد الانتهاء من ازالة الصبغة وإعادة تلطيخ مع Coomassie الأزرق G. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم .>
الرقم 8. والميكانيكية التنميط من خطوط الخلايا السرطانية العظام. (A) والمقارنة بين خطوط الخلايا السرطانية اثنين من العظام HuO9 (إمكانات المتنقل منخفضة) وM132 (المنتشر جدا) يبين الرسم البياني أن جميع قيم المؤشرات أعلى للخط الخلوي HuO9 ( مجموع N = 302؛ مجموعتين مستقلة من التجارب، خطأ بار = الانحراف المعياري). (B ترونج>) وتوضح مؤامرة مربع أن قوات تطبيقها في micropost هي في الجزء الأسفل من نطاق النانو نيوتن. ومع ذلك، وخلايا HuO9 سحب أكثر من الخلايا M132 (تمثل شعرات الحد الأدنى والحد الأقصى البيانات). (C) ويمكن الاطلاع على نتيجة مماثلة بمقارنة الخلايا التي تغطي نفس عدد microposts. خلية HuO9 تطبيق أكثر قوة من الخلايا M132. عدد الخلايا HuO9 تغطي ثلاث microposts ليس تمثيلا وشمل فقط للتأكد من اكتمالها (شريط الخطأ = الانحراف المعياري). (D) وتوزيعات مختلفة في جميع أنحاء أعداد microposts مغطاة تثبت أن كل عظم خط الخلايا السرطانية لديها خاصية نشر خاصة بها عند التعامل مع المصفوفات micropost. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ppfig9.jpg "/>
الشكل التكميلي 9. عادة يتم تحديد حجم بيكسل للإعداد باستخدام المجهر شريحة المجهر خاصة مع شريط النطاق على ذلك. بدلا من ذلك تخطيط مجموعة micropost، بالنظر من قبل الشركة المصنعة يمكن استخدامها. على سبيل المثال، 15 وحدة مع 13 ميكرون (195 ميكرون الطول الإجمالي) مقسوما 2375 بكسل (التي أنشئت مع أداة معالجة الصور) يؤدي إلى 0.082 ميكرون / PXL. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 10. مقارنة بين صور خلية سرطان العظام HuO9 مأخوذة من نفس الموقع باستخدام اثنين من تقنيات الإضاءة على مجهر مقلوب. في ديو الملون microposts هي الفلورية الخضراء. (A وضع مشرق الميدان. (B) بتحليل ط بركه اتخذ بعد التحول إلى قناة مضان الخضراء دون إعادة تركيز. (C) صورة مضان الثانية بعد تصحيح التركيز على micropost جدا النصائح. (D) تراكب من كل القنوات الإضاءة لغرض التوضيح فقط. (E) مؤشرات والميكانيكية التنميط كنتائج من الصور الثلاث. على الرغم من تصحيح التركيز لا يمكن تقدير انحراف كامل من الصور مضان. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
فاي التكميليجوري 11. تسلسل صورة نفس الموقف من microposts الملون fluorescently باستخدام الجاذبة على مجهر تستقيم (A) صورة مشرق الميدان؛ هناك ثلاثة microposts لمس كل منهما الآخر على الحافة. (B) نفس الموقف بعد التحول إلى قناة الفلورسنت أعلى قليلا من رؤوس microposts. (C) تخفيض البؤري لغيض جدا من microposts. (DE) صور متتالية بعد مزيد من خفض تدريجي البؤري نحو قاع microposts. (F) صورة من microposts بعد خفض البؤري داخل الركيزة سيليكون المطاط الصناعي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل التكميلي 12. لقطة من MechProfiler GUI. النموذجية نتيجة التحليل من التنميط خلية سرطان العظام HuO9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ويسعى هذا العمل للمضي قدما في مجال قوة الجر المجهري عن طريق خفض كبير الحواجز التقنية والعملية للدخول. هذه الحواجز تأتي من الجانبين. أولا وقبل كل شيء هي العديد من التحديات التقنية غير تافهة التي يجب التغلب عليها لتصنيع بتكاثر وتكليف مجموعة micropost تجريبيا. الثاني، هو الحاجة بالمثل غير تافهة لتحليل شبه الآلية يمكن الاعتماد عليها القوات خلية واحدة - مع الأخذ في الاعتبار أن تجربة نموذجية قد يتطلب تحليل مئات أو حتى آلاف من الخلايا. وقد وضعت هذه الأساليب المذكورة أعلاه لجعل micropost أساس قوة الجر المجهري يمكن الوصول إليها داخل مختبرات بيولوجيا الخلية التي ليس لديها الخبرة الهندسية المقيمين. يجب أن أجهزة الاستشعار وتقنيات التحليل الوارد في هذه المادة تسمح غير الخبراء لتحليل بسهولة وبدقة قوات من الخلايا واحدة المبذولة.
وبصرف النظر عن الوصول إلى بيولوجيا الخلية لأب مع ما لا يقل عن منتصف الصف المجهر مشرق الميدان، الأساليب المذكورة تتطلب بعض العناصر التقنية الإضافية. يمكن هنا معظم المستخدمين أداء صالحة تجارب قوة الجر المجهري حتى مع تجربة محدودة، على الرغم من قوة وبراعة من التقنية. ومع ذلك هناك ثلاثة جوانب حاسمة في بروتوكول المعروضة التي يجب أخذها بعين الاعتبار. أولا لا بد من التأكد من أن صفائف micropost تغطيها دائما مع السائل لتجنب أن انهيارها بسبب القوى الشعرية. والثاني يحتاج إلى تحسين المعلمات التصوير للصور micropost المكتسبة، التي من الأفضل القيام باتخاذ سلسلة من الصور لموقف مجموعة ذاته في حين تتراوح مدة التعرض، القزحية الفتحة، ووضع عصابة التعويض. فمن المهم للعثور على الطائرة التنسيق الصحيح للطرف micropost، وهذا الجانب لا تأخذ بعض الخبرة نظرا لعمق الأبعاد صغير من صفائف الاستشعار. ثلث يجب تحميل يمكن الوصول إليها علنا تحليل الصور برنامج MechProfiler discusseد هنا، والتي تتوفر في موقع التحميل ومفصلة دليل المستخدم والتدريب الأمثلة. بعد بعض التجارب باستخدام برنامج لتحليل الأمثلة المقدمة مع الدليل، يجب على المستخدم التقاط صور الاختبار على الإعداد والتصوير لاستخدامها وذلك لتكوين إعدادات المجهر مناسبة. استنادا إلى الصور التي تم الحصول عليها، ينبغي أن يكون الأمثل قيمة العتبة كفاف بالمثل. صورة micropost واحدة يمكن تحليلها من قبل مستخدم المدربين في غضون دقيقة باستخدام برنامج MechProfiler المصدر المفتوح بغض النظر عن ما إذا كان يحتوي خلية واحدة أو أكثر، والسماح للجيل النتائج ذات الصلة إحصائيا (تحليل عدة مئات من الخلايا) في غضون ساعات قليلة .
الجانب الآخر الذي يتطلب بعض ضبط هو الامثل أي إجراء تلطيخ الخلايا التطبيقية. عندما الخلايا هي ملطخة مفرطة في البرنامج يمكن أن يفشل في تسجيل المواقف micropost الصحيحة. من ناحية أخرى إذا كان تلطيخ هو خافت جدا أنها تتطلب المزيد من الجهد من قبل المستخدم للكشف عن"صحيح" مخطط الخلية كما نتوءات خلية رقيقة يمكن تفويتها.
ومع ذلك، من خلال تطبيق بروتوكول ثابت للتلوين الخلية والتصوير مجموعة الإجراء النطاق لهذا الخطأ يصبح منخفض مقبول. خلال هذا العمل تم اختبار مختلف الإجراءات تلطيخ الخلية، استنادا إلى تركيزات مختلفة من اللون البنفسجي وضوح الشمس، وجود السطحي مثل توين 20 أو تريتون-X، أو مزيج من الأصباغ بإضافة يوزين. ومع ذلك، فإن شدة تلطيخ وكذلك استقراره تفاوتت بشكل كبير من تجربة إلى تجربة. أظهر فقط استخدام بريليانت الأزرق G كما هو موضح أعلاه ومقبولة متانة تلطيخ الخلايا جنبا إلى جنب مع كثافة كافية للا تزال ترى مخطط الخلية رقيقة ولكن دون التدخل في نهج كفاف نموا.
بشكل عام، وهناك خيارات لتعديل أسلوب المقدمة. على سبيل المثال من خلال الجمع بين تقنيات مشرق الميدان المعروضة هنا مع مضان المجهر العضيات تلطيخمثل نواة أو شبكة خيوط الأكتين، والتي يمكن أن توفر معلومات إضافية حول عمليات الخلية الأساسية في سياق الميكانيكا الخلية. وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام carboxycyanines الألكيل سلسلة طويلة (الجاذبة أو ديو) وmicroposts تصبح الفلورسنت (14). ومع ذلك، فمن المهم للسيطرة على كل انحراف عن هذه التقنية المقدمة. الأرقام التكميلية 10 والشكل 11 توضح المخاطر المحتملة. الصور التي التقطت من خلية الليفية NIH 3T3 Coomassie الأزرق G الملون في القناة مضان الخضراء (الشكل 10B و10C) باستخدام مجهر مقلوب تقدم الهيئات micropost الرئيسية ولكن ليس على نصائح يؤدي إلى تحليل الموقف الخاطئ (الشكل 10E). وعلى الرغم من أفضل الجهود المبذولة لإعادة تركيز بعد التبديل من وضع مشرق الميدان (الشكل 10A) النصائح micropost لا يمكن تصويرها، والتي قد يكون عائدا لامتصاص إشارة مضان من قبل وصمة عار الخلية. هذا هو على النقيض من معهد العالم العربيغيس التي اتخذت مع قناة مضان الصفراء المجهر تستقيم (الشكل 11B-11F) حيث يمكن أن تكون الصور واضحة متعددة الحصول على طول محور ض. هنا يحتاج المستخدم لضمان أن يتم التقاط الصورة مع المستوى البؤري عند منتهى طرفه (الشكل 11C) وليس في مكان أقرب إلى أسفل micropost لتجنب استدعاء القيم انحراف الخاطئ.
وتجدر الإشارة إلى أن هناك أيضا قيود فنية لفحوصات micropost. على سبيل المثال، دقة انحراف الكشف عن تعتمد على جودة الإعداد البصرية. وغالبا ما الأمثل المجاهر للتصوير مضان حيث حساسية الضوء للكاميرا متصلة لديها أولوية أعلى من عدد كبير من بكسل. وبطبيعة الحال، وهذا يؤدي إلى صور مع أكبر حجم بكسل. وعلاوة على ذلك، تجدر الإشارة إلى أن الصور مشرق الميدان لا يمكن تحديد ما إذا كان نتوءات خلية تصل إلى أسفل الركيزة. ومع ذلك، تم اختبار المصفوفات micropost التجارية باستخدام متحد البؤرالمجهر. تبين أن الخلايا يبدو لقبول طلاء ثنائي تعزز التصاق فقط على نصائح micropost وليس لبقية مجموعة micropost. يستمد عامل آخر من الخطأ الموضعية للمجموعة micropost، وهو ما ثبت أن تكون 0.2 ميكرون. جنبا إلى جنب مع ثابت الربيع معين من 2.8 ن ن / ميكرون هذا يؤدي إلى وجود خطأ في القوة قراءة من 0.6 ن ن. عائقا آخر لفحوصات micropost مستمد من حقيقة أن القوات تطبيقها من microposts المشتركة من قبل خلايا متعددة لا يمكن تحديدها. وبالتالي، يمكن تحليل الخلايا وحيدة معزولة فقط. وجود قيود محددة لبروتوكول المعروضة مستمد من التطبيق الصحيح للنهج كفاف حساسة، الأمر الذي يتطلب قدرا معينا من التدريب للمستخدم من أجل الحصول على نتائج موثوقة. وعلاوة على ذلك، لتحليل أسرع يجب على المستخدم التقاط صور حيث يتم محاذاة مجموعة micropost لتشكيل أفقي أو خط عمودي على طول حافة مجال المراقبة. Despitه أن خوارزمية البرنامج لإيجاد microposts داخل هندسة شبكة سداسية لا يقتصر بزاوية دوران تصوير microposts أكثر من 5 درجات قبالة محور تجعل من الصعب على المحاصيل إلى قسم صورة غير المحتوية على microposts غير مكتملة، مما يؤدي بعد ذلك لتقصير من "إنشاء شبكة" وظيفة. في مثل هذه الحالة يمكن للمستخدم استخدام وظيفة دوران متكاملة قبل البدء في تحليل المواقف micropost.
تم تطبيق الطريقة الموصوفة في المقام الأول إلى تميز اثنين من خطوط الخلايا السرطانية العظام، خط خلية الوالدين اسمه HuO9، وخط المنتشر غاية المستمدة المقومة M132. وفي هذا السياق اتخذت أكثر من ستمائة الصور وحيدة الخلية في وضع حقل مشرق وتحليلها باستخدام برنامج MechProfiler. وكشف التنقيب عن البيانات اللاحقة أن خط الخلية الوالدين HuO9 يمارس أكثر قليلا القوة ويغطي عادة أكثر microposts في كل خلية من الخلايا من خط الخلية المنتشر M132. لكن الخلايالم يتم مزامنة وبالتالي في مراحل مختلفة من دورة الخلية في لحظة التثبيت، والتي من المرجح ساهمت في مجموعة واسعة من النتائج. من خلال اتخاذ الصور الخلية الحية على مدى فترات زمنية تصل إلى 24 ساعة، وجدنا أنه بعد نشر لا تزال العديد من الخلايا في موقفهم المبدئي في حين أن الآخرين الهجرة والانتشار، قطع وتهاجر مرة أخرى مع سرعات مختلفة (انظر الفيديو التكميلية). هذا يدل على أن الملف الشخصى الميكانيكي للخلية في كثير من الأحيان يست ثابتة ويمكن أن تختلف بشكل كبير بين سكان الخلية أو حتى داخل خلية واحدة اعتمادا على نشاطها الحالي. يمكن أن يكون عاملا مساهما آخر أن على مجموعة micropost يضطر خلية لتنفيذ الخطوات المنفصلة الهجرة للوصول إلى micropost آخر، وهو على النقيض من TFM الكلاسيكية، حيث خلايا التمسك الأسطح المسطحة ويمكن أن تهاجر مع خطوات دقيقة. ومع ذلك، من أجل تحليل هذه الخطوات الصغيرة لا بد من التقاط صور الفلورسنت من النقاط التصاق التنسيق، التي يتطلب الوصول إلى متقدمة جدا مicroscopes وتفصيلا غاية برمجيات تحليل الصور. ومع ذلك، فإن توزيع التشكيلات الميكانيكية داخل أعدادا كبيرة من السكان لا يزال في كثير من الأحيان السمة المميزة لخط الخلية. وهكذا طريقة الإنتاجية العالية التي تمكن توصيف عدد كبير من الخلايا أمر ضروري. عملية التصوير اليدوي وبرامج الوصول المفتوح المعروضة هنا تؤوي إمكانات كبيرة لتوسيع نطاق نظم المجهر التلقائي بالكامل.
وباختصار فإننا سنطرح نهجا قويا قوة الجر المجهري الذي هو تبنيهم بسهولة في معيار مختبر بيولوجيا الخلية. سير العمل بأكمله من البذر الخلية لتحليل الصور هي بسيطة وفعالة. في حين أن البروتوكولات المذكورة هنا هي تعمل بكامل طاقتها، وإدخال تحسينات مستمرة على التكيف خوارزميات التحليل لتكون قادرة على التعامل أيضا micropost المصفوفات مع تخطيطات المتعامدة والإجراءات النامية التي تبسيط تحليل تسلسل الصور من تصوير الخلايا الحية. في سياق مع نتائج لى خلية سرطان العظاممتنوعه، والنهج وصفها هنا يمكن استخدامها لخلايا الشاشة من الخزعات السريرية من أجل تحديد ما إذا كانت هذه المقايسات قد تحمل قيمة النذير، تمكن الأطباء من التنبؤ إمكانات المتنقل من الخلايا تحتاج فحص من مرضى سرطان العظام. ومن شأن هذا الفحص تؤثر على الاستراتيجيات العلاجية. تطبيقات محتملة أخرى تتعلق المركبات النشطة اختبار صيدليا على خلايا نشطة ميكانيكيا مثل خلايا العضلات الملساء أو العضلية، يحتمل أن تكون للمساعدة في إقامة فعالية الدواء أو السمية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm |
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
- Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
- Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
- Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
- Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
- Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
- Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
- Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
- Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
- Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
- Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
- Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311 (2007).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
- Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).
