Introduction
Mechano के प्रति संवेदनशील सेल आधारित assays यांत्रिकी कोशिका जीव विज्ञान में खेल सकते हैं कि केंद्रीय भूमिका को प्रतिबिंबित कि आवेदनों की एक विस्तृत श्रृंखला के साथ, पक्षपाती कोशिकाओं की जांच के लिए अनुमति देते हैं। इन आवेदनों अक्सर subcellular प्रक्रियाओं या पूरे सेल व्यवहार कि ड्राइव अंतर्निहित तंत्र पर ध्यान केंद्रित। एक तरफ, इस तरह के अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स संरचना या मैट्रिक्स कठोरता के रूप में बाह्य पर्यावरणीय कारकों नाटकीय रूप से एक सेल के यांत्रिक और जैविक प्रतिक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं। एक ही pharmaceutically सक्रिय यौगिकों के कई वर्गों के उपयोग के बाद मनाया जा सकता है, जिसके प्रभाव से कर रहे हैं अक्सर सेल संस्कृति मॉडल का उपयोग होती है। 2 ऐसे cytoskeleton संरचना और समारोह में परिवर्तन के साथ जुड़े रहे हैं कि सेल phenotype में चिह्नित परिवर्तन के लिए प्रेरित कर सकते हैं सहज या प्रयोगात्मक प्रेरित आनुवंशिक परिवर्तन की वजह से उन के रूप में दूसरी ओर genotypic गुण, पर। 3 ये उदाहरण हैं कई संभव के कुछ हीविषयों के लिए जो कोशिकाओं के यांत्रिक phenotyping के लिए प्रासंगिक है, और इनमें से सभी उपयोगी micropost सरणियों के साथ जांच की गई है।
इस लेखन के समय में, लगभग 200 लेख सेल micropost बातचीत का वर्णन प्रकाशित किया गया है। ये काम करता है micropost विक्षेपन सिद्धांतों के सैद्धांतिक पहलुओं के साथ ही उनके निर्माण पर व्यावहारिक निर्देश पर चर्चा की। कोशिकाओं और लचीला micropost सरणियों की बातचीत का वर्णन पहला लेख निरंतर नरम substrates टैन एट अल nanonewton पैमाने पर सेल सिकुड़ना, अनुमान लगाने के लिए उपयोग किया जाता है, जहां क्लासिक कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी (TFM) के विपरीत 2003 4 में टैन और उनके सहयोगियों द्वारा प्रकाशित किया गया था। सिलिकॉन elastomer के बने कई निकट दूरी पर खड़ी उपयोग कर मुस्कराते हुए एक विधि का वर्णन किया। इस तकनीक का मुख्य लाभ के दो प्रमुख सुविधाओं से उभरेगा। जबकि रखते हुए सबसे पहले सेल स्पष्ट सब्सट्रेट कठोरता को बदलने के क्रम में एक ही micropost आयाम बदलने की जरूरत हैअन्यथा स्थिर है और इस तरह की सतह टोपोलॉजी और रसायन शास्त्र में मतभेद से बचने सब्सट्रेट रचना। दूसरा microposts कड़ाई से व्यक्तिगत फोकल adhesions के आदेश पर बल और स्थानिक संकल्प के साथ विश्लेषण किया जा सकता है और मानक TFM द्वारा अनुरूप विश्लेषण के लिए निहित हैं कि विश्लेषणात्मक चुनौतियों को कम कर सकते हैं कि व्यक्ति स्प्रिंग्स की तरह काम करते हैं।
आज micropost सरणियों के लिए आवेदनों की रेंज बहुत कुछ एकल कक्षों के लिए बलों की सिर्फ मानचित्रण से अधिक है। उदाहरण के लिए, Akiyama एक कीट पेशी संचालित स्वायत्त सूक्ष्म रोबोट विकसित करने के क्रम में, एक micropost सरणी के लिए एक actuator के रूप में एक कीट कमला से एक अलग पृष्ठीय पोत ऊतक के उपयोग की रिपोर्ट। 5
हालांकि, microposts की सबसे प्रकाशित अनुप्रयोगों संक्रमण या कैंसर जैसे चिकित्सा की स्थिति के अध्ययन पर ध्यान केंद्रित किया है। उदाहरण के लिए, micropost सरणियों नेसेरिया gonorrh के बंडल प्रकार चतुर्थ पिली के बल पीढ़ी का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। संकेत झरने संक्रमण को बढ़ाने के साथ जुड़ा हुआ है 6 अन्य cytoskeleton को लक्षित दवा यौगिकों के साथ इलाज स्तन कैंसर की कोशिकाओं का अध्ययन करने के microposts का इस्तेमाल किया है कि OEA कालोनियों। 7
एक micropost के नीचे को झुकाव अक्सर सेल संभालने का अंत भार के साथ एक ब्रैकट के लिए शास्त्रीय किरण सिद्धांत का उपयोग वर्णित है केवल micropost की बहुत टिप के लिए देता है। एक विक्षेपन δ का कारण बनता है कि यहाँ लागू बल एफ micropost के "झुकने कठोरता" कश्मीर पर निर्भर करता है और कर की जाती है:
(1)
ई, मैं, और एल जा रहा है यंग मापांक, क्रमशः जड़ता और किरण लंबाई के क्षेत्र पल के साथ। सब्सट्रेट warping के एसी में नहीं ले रहे हैं लेकिन, जैसा कि इस समीकरण से परिणाम केवल किरण कर्तन के बाद से काम और के रूप में अच्छी तरह से झुकने पर बलों की एक सामान्य सन्निकटन देगिनती। Microposts आम तौर पर polydimethylsiloxane (PDMS) की तरह नरम सामग्री से बना रहे हैं कि ध्यान में रखते हुए इन कारकों को शामिल किए जाने की जरूरत है सिलिकॉन रबर आधारित। । Schoen एट अल micropost (एल / डी) और इसी बहुलक का पॉसों अनुपात वी के पहलू अनुपात के आधार पर इस तरह के एक सुधार कारक है कि वहाँ का प्रदर्शन 8 यह द्वारा दिया जाता है।:
(2)
टी झुकाव (v) एक ही लेख में पाया जा सकता है के रूप में फिटिंग पैरामीटर एक = 1.3 शामिल है कि एक झुकने गुणांक होने के साथ:
(3)
यही कारण है कि एक micropost के सुधारा कठोरता कश्मीर CORR शुद्ध झुकने कठोरता कश्मीर = कश्मीर मोड़ के उत्पाद और सुधार कारक CORR इसका मतलब यह हैद्वारा दिए गए:
(4)
इसलिए, सेल बल गणना अब पढ़ समीकरण (1) के और अधिक परिष्कृत भिन्नता का उपयोग किया जाना चाहिए:
(5)
सुधार के प्रभाव के रूप में जल्द ही micropost आयामों के लिए विशिष्ट मूल्यों उपयोग किया जाता है के रूप में और अधिक स्पष्ट हो जाता है। उदाहरण के लिए, एक परिपत्र पार अनुभाग और PDMS आधारित सिलिकॉन रबर के बने 5 माइक्रोन की एक व्यास के साथ एक 15 माइक्रोन लंबे micropost 0.77 की एक सुधार कारक की ओर जाता है और इसलिए एक अनुशासनहीन गणना 23% द्वारा लगाए गए सेल बलों overestimate होगा। यह और भी अधिक गंभीर छोटे पहलू अनुपात के साथ microposts के लिए हो जाता है।
परंपरागत रूप से, micropost छवि विश्लेषण भी आर्दश किरण झुकने के सिद्धांत पर आधारित है। 2005 में माइकर के उपयोग का बीड़ा उठाया है कि समूहopost सरणियों micropost विश्लेषण के लिए अनुकूल एक छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रकाशित 9 सॉफ्टवेयर एक सॉफ्टवेयर लाइसेंस की आवश्यकता है और उपयोगकर्ता प्रत्येक पद के लिए तीन छवियों ले लेना चाहिए। प्रसारण विधा और दाग सेल के साथ प्रतिदीप्ति मोड में एक दूसरे में micropost के ऊपर और नीचे के विमानों से एक-एक। प्रत्येक के लिए ऊपर और नीचे के पदों पर तुलना करने के बाद सॉफ्टवेयर एक बल वेक्टर क्षेत्र निर्धारित करता है और पोस्ट के अनुसार बल की तरह संबंधित मानकों की गणना करता है micropost। अन्य सॉफ्टवेयर संकुल मौजूद हैं और उनके विश्लेषण के सिद्धांतों उन्हें संक्षेप में वर्णन है कि इसी लेख में उल्लेख कर रहे हैं, लेकिन इन विश्लेषणात्मक सॉफ्टवेयर संकुल आम तौर पर सार्वजनिक रूप से उपलब्ध नहीं हैं। 10,11
मानचित्रण सेल बलों के लिए डिज़ाइन किया गया micropost सरणियों सभी पड़ोसी microposts के बीच समान दूरी के अंतराल का फायदा है जो बाद के एक orthogonal micropost लेआउट या एक हेक्सागोनल एक में किया जा रहा है या तो के रूप में वर्गीकृत किया जा सकता है। ठेठ microposts हाएक परिपत्र पार अनुभाग किया है और उनके आयाम अण्डाकार या वर्ग पार अनुभाग के साथ microposts भी सूचित किया गया है, हालांकि लंबाई में 50 माइक्रोन से 1.0 माइक्रोन के लिए व्यास में 10 माइक्रोन और 2। 4 लेकर। 12,13
micropost सामग्री के रूप में PDMS आधारित सिलिकॉन मिश्रण का इस्तेमाल मिश्रण में नैनोकणों जोड़ने के लिए अनुमति देता है। कोबाल्ट नैनो-छड़ जोड़ने उदाहरण के लिए micropost की एक चुंबकीय सक्रियण सक्षम बनाता है और इस प्रकार संभावित प्रयोगात्मक डिजाइन करने के लिए स्वतंत्रता का एक और डिग्री देता है। 14 अधिकांश समूहों कवर कांच की तरह या एक पेट्री डिश के अंदर फ्लैट कठोर substrates पर उनकी micropost सरणियों का उत्पादन। हालांकि, मान और सह कार्यकर्ताओं ने हाल ही में एक stretchable झिल्ली पर गठित एक micropost सरणी की सूचना दी। 15 सेल सिकुड़ना के मामले में रहते सेल subcellular गतिशील प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करते हुए यह पक्षपाती कोशिकाओं को सेल खींच बलों के आवेदन की अनुमति देता है।
व्यापक रूप से कार्यरत हैं और सबसे स्थापितSU8 photoresist का उपयोग कर एक सिलिकॉन वेफर के शीर्ष पर microstructures उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं कम मानक cleanroom प्रक्रियाओं में Sniadecki और सहकर्मियों। 16-18 की व्यावहारिक प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में micropost सरणियों बनाने के लिए lished प्रक्रिया नरम लिथोग्राफी पर आधारित है। यह सिलिकॉन रबर सांचों में उन्हें स्थानांतरित संरचनाओं पर डाली है जिसमें एक नकल की प्रक्रिया के बाद है। एक दूसरे चरण में इन नए नए साँचे एक चुना सब्सट्रेट के शीर्ष पर सिलिकॉन रबर का उपयोग करते हुए प्रारंभिक microstructure को दोहराने के लिए उपयोग किया जाता है। हालांकि microposts के लिए एक निर्माण की प्रक्रिया की स्थापना के उनके आवेदन से संबंधित प्रकाशनों की बड़ी और बढ़ती संख्या के बावजूद माइक्रो इंजीनियरिंग विशेषज्ञों के लिए भी समय की काफी राशि लेता है; एक स्वीकार्य गुणवत्ता के स्तर की उपज के लिए विशिष्ट प्रयोगशाला वातावरण और micropost लेआउट के लिए अनुकूलन और अनुकूलन की आवश्यकता है कि कई प्रक्रिया कदम उठाए हैं।
वाणिज्यिक micropost सरणियों एक पहले से तैयार टी में अब उपलब्ध हैंएक लगातार उच्च गुणवत्ता के साथ ओ-उपयोग ("मुस्तैद") प्रारूप। जैसे वे साइट पर उत्पादन के लिए आवश्यक जटिल और लंबी निर्माण की प्रक्रिया के लिए एक विकल्प है। इस पत्र में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध micropost सरणी एक भी उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोपी छवि का उपयोग सेलुलर बलों मानचित्रण के लिए इस्तेमाल किया गया था। इससे भी महत्वपूर्ण बात यह आलेख वर्णन करता है और इस पांडुलिपि के लिए अनुपूरक सामग्री के रूप में डाउनलोड के लिए उपलब्ध है जो MechProfiler नाम की एक पूरी तरह कार्यात्मक खुला स्रोत सॉफ्टवेयर, दस्तावेजों। सॉफ्टवेयर के एक सक्रिय रूप से बनाए रखा संस्करण भी http://www.orthobiomech.ethz.ch पर पाया जा सकता है।
एक "मुस्तैद" परख और एक संगत खुला स्रोत सॉफ्टवेयर विश्लेषण के संयोजन स्पष्ट रूप से सटीक TFM प्रयोगों को प्राप्त करने के लिए प्रवेश बाधा को कम करती है। साफ कमरे सुविधाओं या सॉफ्टवेयर विकास विशेषज्ञता या तो करने के लिए उपयोग के बिना शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक सेलुलर बलों का विश्लेषण कर सकते हैं। यह mechanos पर ध्यान केंद्रित करने के लिए एक उपयोगकर्ता सक्षम बनाता हैensitivity परख उत्पादन के बजाय प्रौद्योगिकी ही है, और एक व्यापक समुदाय के लिए उपलब्ध कर्षण बल मापन करता है। इसके अलावा, इस micropost सरणियों की पूरी तरह से स्वचालित स्क्रीनिंग की ओर मार्ग प्रशस्त करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।
MechProfiler विश्लेषण सॉफ्टवेयर फ़ाइल स्वरूप झगड़ा, पीएनजी, बीएमपी और वालपेपर छवियों प्रक्रियाओं। छवियों प्रतिदीप्ति, चरण विपरीत या उज्ज्वल क्षेत्र प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर लिया जा सकता है। स्टैंडअलोन कार्यक्रम (उपलब्ध है: चित्रा 12) मुक्त मैटलैब संकलक क्रम के साथ एक साथ चलाता है और अंतर्निहित एल्गोरिदम के बारे में 1 मिनट में एक या कई कोशिकाओं के साथ छवियों की प्रक्रिया करने के लिए उपयोगकर्ता सक्षम बनाता है जो सुव्यवस्थित इमेज प्रोसेसिंग, के लिए अनुमति देते हैं। इसके अलावा, इन कोशिकाओं या तो रह जा सकता है या "निर्धारित"।
MechProfiler सॉफ्टवेयर बहुत गुणवत्ता वाणिज्यिक micropost सरणियों के reproducibility पर भरोसा करके डेटा विश्लेषण throughput बढ़ाने के लिए सक्षम है, और अधिक विशेष रूप से, डिफ़ॉल्ट & #8220; गैर हटाया हुआ "सरणी में प्रत्येक पद के पद के लिए एक स्मार्ट ग्रिड के खिलाफ माना जा सकता है (इस अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया सरणियों में ग्रिड के लिए विनिर्माण विचलन कम से कम 100 एनएम) थे।
कम एक में, हित के क्षेत्र के लिए उन्हें फसलों, विश्लेषण के लिए छवि फ़ाइलों की एक चयन खोलता कोशिकाओं द्वारा कवर पदों को परिभाषित करता है या खारिज किए जाने की जरूरत है, जो पद पदों को निर्धारित करता है, विक्षेपण / आदर्श ग्रिड के खिलाफ सेना की गणना करता है, और अंत में एक मानक कार्यालय स्प्रेडशीट के लिए सहित, निर्यात के लिए एक संभावना के साथ सभी सेल विशिष्ट डेटा बचाता है।
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Protocol
Micropost सारणियों पर 1. संवर्धन कोशिकाओं
नोट: सभी कदम बाँझपन सुनिश्चित करने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में प्रदर्शन किया जाना चाहिए। यहां दी गई संस्करणों T25 सेल संस्कृति बोतल के लिए कर रहे हैं। सेल संस्कृति के माध्यम नुस्खा और सेल बोने घनत्व हड्डी कैंसर कोशिका लाइनों HuO9 और M132 के लिए अनुकूलित कर रहे हैं।
- एक micropost सरणी पर बोने के लिए एक सेल संस्कृति तैयार करें।
- एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप पर संस्कृति कुप्पी रखकर सेल संस्कृति की गुणवत्ता का निरीक्षण किया। कोशिकाओं कवर किया जाता है कितना संस्कृति कुप्पी नीचे का आकलन करके एक ठेठ विकास और आकृति विज्ञान बताते हैं कि सुनिश्चित करें। 70% -80% की कवरेज के लिए एक स्वस्थ विकास दर को दर्शाता है। वे मृत कोशिकाओं और / या एक ऊंचा हो गया संस्कृति का प्रतिनिधित्व के रूप में कोशिकाओं चल की राशि पर ध्यान दे।
- 4 मिलीलीटर 1x फॉस्फेट के साथ मध्यम और वाशिंग हटाने के द्वारा कोशिकाओं Trypsinize खारा (पीबीएस) बफर बफर। सेल तक आरटी पर 0.8 मिलीलीटर 1x trypsin / ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) जोड़ें और सेतेके बारे में 2-4 मिनट लगते हैं जो जगह देना। माइक्रोस्कोप के साथ प्रक्रिया की जांच और कभी-कभी dislodging समर्थन करने के लिए धीरे कुप्पी नल।
- 5 मिलीलीटर सेल संस्कृति माध्यम (Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS के साथ / F12), 1% पेनिसिलिन / streptavidin (पेन / Strep)) प्रतिक्रिया को रोकने के लिए और अभी भी बैठते हैं कि अवशिष्ट कोशिकाओं को धोने के लिए जोड़ें कुप्पी के तल पर। इसके बाद एक समरूप मिश्रण हासिल करने के लिए ऊपर और नीचे कई बार इस निलंबन विंदुक। एक प्रभावी dislodging हासिल करने के लिए कुप्पी का मूल विकास क्षेत्र भर में सभी समाधान पिपेट करना सुनिश्चित करें।
- एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में सेल निलंबन स्थानांतरण और 3 मिनट के लिए 0.5 XG पर एक तालिका के शीर्ष सेंट्रीफ्यूज का उपयोग कर इसे अपकेंद्रित्र।
- तैरनेवाला निकालें और pipetting और 5 बार नीचे 5 मिलीलीटर मध्यम में सेल गोली फिर से निलंबित। जबकि ऐसा करने के बुलबुले की पीढ़ी से बचने के लिए सुनिश्चित करें।
- एक सेल गिनती कक्ष और एक प्रकाश microsco का उपयोग करके सेल घनत्व निर्धारणपे। सेल समुच्चय के लिए सेल गिनती कक्ष में सेल निलंबन की जाँच करें और बाद में प्रयोग के लिए केवल एकल कोशिकाओं के लिए किया जाता है। पिपेट कोशिकाओं उन्हें अलग करने के समुच्चय के रूप में करने के लिए फिर से ऊपर है और कई बार नीचे करते हैं।
- 25,000 कोशिकाओं / एमएल के एक सेल समाधान हासिल करने के लिए पर्याप्त मध्यम के साथ सेल निलंबन पतला। बंद ट्यूब कई बार inverting द्वारा यह अच्छी तरह से मिलाएं।
- सेल बोने के लिए एक micropost सरणी तैयार करें।
महत्वपूर्ण नोट: इस संभावित microposts नुकसान पहुँचा सकता है सीधे रूप में अवांछित बुलबुले पेश कर रहे हैं, खासकर जब micropost सरणी पर पिपेट मत करो। इसके अलावा, micropost सरणी कभी नहीं केशिका बलों microposts के ढहने के लिए नेतृत्व होने वाली के रूप में बाहर सूख जाता है कि सुनिश्चित करें।- चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग करके एक 12 अच्छी तरह से थाली के एक कुएं में ऊपर का सामना करना और 1 मिलीलीटर इथेनॉल (99%) जोड़कर इसे गीला micropost सरणी के साथ कांच के अध रखें। 20-30 सेकंड के लिए आरटी पर सेते हैं।
- इथेनॉल पतलाअच्छी तरह से पक्ष पर लगभग 1 मिलीलीटर बाँझ de-ionized पानी (डि पानी) को जोड़ने और एक हस्तांतरण पिपेट या आकांक्षा डिवाइस का उपयोग लगभग 1 मिलीलीटर aspirating द्वारा चरणबद्ध। इस कदम के कम से कम 3 बार दोहराएँ।
- उनका कहना है और लगभग 1 मिलीलीटर aspirating द्वारा एक ही तरीके से पीबीएस बफर के साथ डि-पानी की जगह। इस चरण 3 बार दोहराएँ।
- उनका कहना है और लगभग के माध्यम से 1 मिलीलीटर aspirating द्वारा माध्यम के साथ पीबीएस बफर बदलें। इस चरण 3 बार दोहराएँ।
- प्रत्येक तैयार micropost सरणी के शीर्ष पर पिपेट 1 मिलीलीटर सेल समाधान (25,000 कोशिकाओं)। बहु अच्छी तरह से थाली बंद करें और एक मशीन को हस्तांतरण (सीओ 2 5%, 37 डिग्री सेल्सियस)। कोशिकाओं पालन और 6 -7 घंटे के लिए microposts के शीर्ष पर हो जाना।
- एक प्रकाश एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके कभी कभी आसंजन प्रक्रिया का निरीक्षण किया। कोशिकाओं के अधिकांश कई microposts भर में फैली दिखाई देते हैं कि जाँच करें।
2. फिक्सिंग और धुंधला प्रकोष्ठों
नोट: सभी कदम औरयहां दी गई मात्रा में एक 12 अच्छी तरह से थाली का एक भी अच्छी तरह से कर रहे हैं। यह microposts के एक पतन में परिणाम होगा जो किसी भी तरल, की आकांक्षा के बाद कुएं से बाहर एक सुखाने से बचने के लिए एक समय में अधिक नहीं बारह कुओं में से चार से संसाधित करने के लिए सिफारिश की है।
- अच्छी तरह से महाप्राण मध्यम और कोशिकाओं को धो लें 1 मिलीलीटर पीबीएस बफर के साथ 2x। गर्मी के दौरान micropost सरणी पर संचित कि सेल मलबे को हटाने और मृत कोशिकाओं को अलग करने के लिए पीबीएस के साथ धोने जबकि एक सज्जन बल लागू करना सुनिश्चित करें।
- 5 मिनट के लिए 0.5 मिलीलीटर 3.7% बफर formaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें।
- 1 मिलीलीटर बाँझ डि पानी के साथ micropost सरणी 2x धोने से formaldehyde समाधान बदलें।
- के बारे में 90 सेकंड के लिए (50% पानी, 40% इथेनॉल और 10% एसिटिक एसिड में 0.05% Coomassie खूब ब्लू) डाई के साथ कोशिकाओं दाग। 1 मिलीलीटर बाँझ डि पानी के साथ 2x से अतिरिक्त धुंधला समाधान धो लें। सरणी micropost 1 मिलीलीटर डि पानी जोड़ें।
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग धुंधला परिणाम की जाँच करें। दोहराएँ टीसेल शरीर देखे जा करने के लिए भी बेहोश है, अगर वह कदम धुंधला हो जाना।
- 4 डिग्री सेल्सियस पर एक फ्रिज में शीर्ष पर दाग कोशिकाओं के साथ स्टोर micropost सरणियों। हर समय पानी के नीचे रखने के लिए उन्हें सुनिश्चित करें।
3. सेल इमेजिंग
नोट: चरण 4 केवल इन्फिनिटी सुधारा प्रकाशिकी के बिना माइक्रोस्कोप के लिए लागू होता है।
- उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए एक पतली गिलास नीचे के साथ एक पेट्री डिश के लिए 2 मिलीलीटर डि-पानी जोड़ें।
- Microposts का सामना करना पड़ के साथ इमेजिंग डिश में चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग micropost सरणी स्थानांतरण।
- एक प्रकाश माइक्रोस्कोप की एक जंगम मंच पर इमेजिंग पेट्री डिश रखें।
- पैमाने पर नंबर कांच सब्सट्रेट, सिलिकॉन elastomer और शीर्ष पर तरल के अपवर्तक सूचकांक में बेमेल के लिए क्षतिपूर्ति करने के लिए ऑप्टिकल मार्ग के किनारे सभी सामग्री की कुल मोटाई का प्रतिनिधित्व करता है जब तक इमेजिंग के लिए इस्तेमाल किया लेंस का मुआवजा अंगूठी बारी। इस microposts की एक चमकदार उपस्थिति के लिए नेतृत्व चाहिएकोर।
- नीचे 50% करने के लिए रोशनी तरफ आईरिस बंद करो और एक साधारण उज्ज्वल क्षेत्र मोड को सक्रिय करने के लिए ऑप्टिकल पथ से किसी भी चरण विपरीत छल्ले को हटा दें।
- Microposts अवलोकन क्षेत्र भर में एक क्षैतिज रेखा के रूप में है कि micropost सरणी संरेखित करें। एक शुरुआत बिंदु (जैसे, ऊपर बाएं) को परिभाषित करने और कई चित्र ले रही है जबकि micropost सरणी स्कैनिंग मंच के पार पेट्री डिश चरणबद्ध चलते हैं।
- एक 20x या 40x उद्देश्य का उपयोग करते हुए कैमरे के लिए उच्चतम संकल्प की स्थापना के साथ सभी छवियों को ले लो। छवि के केंद्र में एक एकल कोशिका है करने के लिए निशाना लगाओ।
- Micropost युक्तियों को ध्यान में हैं जब तक सब्सट्रेट के माध्यम से Z अक्ष के साथ स्वीप। माइक्रोस्कोप के ठीक ट्यूनिंग फोकस पहिया का उपयोग करें और के बारे में 2-3 माइक्रोन के लिए micropost तल पर ध्यान केंद्रित करने की दिशा में बदल जाते हैं।
- (एक समय में इमेजिंग मानकों को एक के माध्यम से व्यापक एक सरणी खंड की परीक्षा छवियों की श्रृंखला लेने के द्वारा एक मानक इमेजिंग प्रक्रिया की स्थापना जैसे, जोखिम समय,आईरिस की स्थापना, दीपक सेटिंग्स आदि)। MechProfiler साथ छवियों का विश्लेषण और एक तेज और विश्वसनीय विश्लेषण के लिए एक उपयुक्त पैरामीटर सेट निर्धारित करते हैं।
ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर "MechProfiler" के साथ 4. छवि विश्लेषण
नोट: सभी सॉफ्टवेयर कार्यों बाईं माउस बटन का उपयोग कर एक संकेत डिवाइस के साथ सक्रिय हो सकते हैं। हालांकि, एक प्रशिक्षित ऑपरेटर एक कुशल दो हाथ इमेज प्रोसेसिंग सक्षम करने के लिए कीबोर्ड के बाईं आधे पर होने के लिए बनाया प्रलेखित शॉर्टकट कुंजी का उपयोग करेगा।
- छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर MechProfiler शुरू करें और "ओपन" पर क्लिक करके विश्लेषण करने की आवश्यकता है कि छवियों की एक श्रृंखला खुला।
- सॉफ्टवेयर डेवलपर द्वारा दिए गए "सेटिंग" अनुभाग में सभी मापदंडों डालें। कस्टम सॉफ्टवेयर का मार्गदर्शन द्वारा विस्तार से वर्णित प्रक्रिया के अनुसार (यानी, समोच्च सीमा और कम से कम दूरी) विन्यस्त किया जाना चाहिए कि मानकों का निर्धारण।
- छवि का विश्लेषणएस एक-एक करके "फसल" की मदद से ब्याज के क्षेत्र के लिए उन्हें फसल से (क्लिक करें और माउस बटन के साथ खींचें नीचे दबाया)। तैयार की आयत के अंदर डबल क्लिक करें इस कार्रवाई खत्म करने के लिए।
- "सेल रूपरेखा ड्रा" और सेल से जुड़ा हुआ है सब microposts सहित ड्राइंग के लिए पार बाल कर्सर का उपयोग पर क्लिक करके प्रत्येक दिखाई दे सेल रूपरेखा एक-एक करके चिह्नित।
- "त्यागें पोस्ट" पर क्लिक करके किसी भी अवांछित microposts त्यागें और ड्राइंग के लिए पार बाल कर्सर का उपयोग करें। छवि खंड के बाहर एक सेल के हैं या किसी भी अन्य कारण से नहीं बल्कि ब्याज की सेल द्वारा सीधे रास्ते से कर रहे हैं कि सभी microposts संलग्न करें।
- सॉफ्टवेयर उपनेमका माउस क्लिक करके "centroids खोजें" शुरू करो। ठीक बगल में उनके केंद्र में एक रेड क्रॉस से दिखाई दे रहा है, जो सभी microposts पंजीकृत हैं जब तक "centroids खोजें" बटन, के लिए सेटिंग फिल्टर समायोजित करें। फिल्टर सेटिंग भी है, तो यह बहुत अधिक म्यू है, तो कम microposts, नजरअंदाज कर दिया जाएगाएकाधिक पदों पर एक भी micropost के लिए चिह्नित किया जाएगा। एक विश्लेषण सत्र के दौरान लगातार सेटिंग फिल्टर रखें।
- एकाधिक या चूक micropost पदों के साथ centroids के लिए मैनुअल संपादन समारोह "मैनुअल संपादित करें" का प्रयोग करें। क्लिक करके और इसे भर में खींचकर प्रश्न में micropost का चयन करने के लिए माउस पार बाल का प्रयोग करें। आयत के अंदर डबल क्लिक करें और स्वचालित रूप से बंद कर देता है, जो बढ़े हुए छवि खंड में लापता लाल मार्कर जगह है। इसे तैयार सेल रूपरेखा बाहर है, तो इस तरह के एक micropost त्यागें आगे बढ़ने से पहले (4.5 कदम देखें)।
- एक माउस क्लिक के साथ "ग्रिड उत्पन्न" समारोह को सक्रिय द्वारा आदर्श micropost ग्रिड का पता लगाएं। स्थिति तैयार सेल रूपरेखा के अंदर एक नीले रंग की अंगूठी द्वारा दिखाए गए सच micropost सिर, के साथ मेल खाती है सुनिश्चित करें।
- एक माउस क्लिक के साथ इसी "मैनुएल संपादित करें" समारोह का उपयोग कर जहां जरूरी सेल क्षेत्र के अंदर किसी भी गलत ग्रिड निर्माता सही। Qu में micropost चयन करने के लिए पार बाल का उपयोग करेंक्लिक करके और इसे भर में खींचकर estion। प्रदर्शित होने के आयत के अंदर डबल क्लिक करें और स्वचालित रूप से बंद कर देता है, जो बढ़े हुए छवि खंड में लापता नीले मार्कर जगह है।
- एक micropost की छवि खंड के अंदर स्थिति और उत्पन्न आदर्श ग्रिड के बीच अंतर के आधार पर गणना की विक्षेपन मूल्यों का एक हिस्टोग्राम पाने के लिए माउस क्लिक करके बटन "गणना Deflections" का प्रयोग करें।
- "सहेजें" पर एक माउस क्लिक करके मूल्यों की टेबल सहित पूरा विश्लेषण बचाओ।
- "देखें रीसेट" और आसानी से सही कुंजीपटल curser कुंजी का उपयोग किया जा सकता है, जो "अगली छवि", पर एक और छवि अनुभाग या माउस क्लिक विश्लेषण पर क्लिक करके या तो छवि विश्लेषण जारी रखें।
5. डेटा विश्लेषण - Mechanoprofiling
- विश्लेषण किया छवियों के साथ फ़ोल्डर से एक कार्यालय स्प्रेडशीट प्रोग्राम के साथ फ़ाइल "results.xls" खोलें। यह अल साथ डेटा शामिलविश्लेषण किया सेल द्वारा सभी micropost होते थे और इस तरह के काम (यानी, सब्सट्रेट विरूपण ऊर्जा) के रूप में मानक व्युत्पन्न उपायों सहित एल मूल्यों की गणना।
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Representative Results
वर्णित तकनीक का मुख्य लाभ नियमित प्रयोगशाला काम में तेजी से और प्रभावी एकीकरण के लिए अपनी सादगी और क्षमता में निहित है। खुला स्रोत सॉफ्टवेयर के साथ जोड़ा उच्च गुणवत्ता वाणिज्यिक सेंसर सरणियों का संयोजन होगा अन्यथा छवि विश्लेषण और सॉफ्टवेयर विकास के ज्ञान cleanroom सुविधाओं को और गहराई में उपयोग की आवश्यकता है कि Mechano संवेदनशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करता है। 1 प्रस्तुत विधि के कार्यप्रवाह दिखाता चित्रा। यह micropost सरणी पर कोशिकाओं की तैयारी और बोने के साथ शुरू होता है। कोशिकाओं फिक्सिंग और धुंधला के बाद micropost सरणियों इमेजिंग के लिए तैयार कर रहे हैं। तकनीक के मध्य भाग MechProfiler सॉफ्टवेयर का उपयोग कर छवि विश्लेषण है। एक उपयोगकर्ता को तुरंत जीयूआई के "सेटिंग" में सभी प्रासंगिक मानकों को प्रवेश करने के बाद छवियों analyszng शुरू कर सकते हैं। इसी पिक्सेल आकार एक एकल पिक्सेल का प्रतिनिधित्व करती है और उपयोगकर्ता की स्थापना पर निर्भर करता है कि लंबाई है। इसकी जरूरत हैज्ञात आकार के साथ वस्तुओं के चित्र लेने के द्वारा प्रत्येक इस्तेमाल किया बढ़ाई के लिए अलग से स्थापित किया जाना है। एक उदाहरण अनुपूरक 9 चित्रा में दी गई है।
यह दृढ़ता से विश्लेषण की प्रक्रिया को प्रभावित करती है के रूप में छवि गुणवत्ता के एक महत्वपूर्ण कारक है। विशेष रूप से चित्रा 2 में दिखाया गया के रूप में एक एक स्थिर और नियमित रूप से सेवित इमेजिंग मंच है सुनिश्चित करना चाहिए कि उच्चतम गुणवत्ता प्राप्त करने के लिए, प्रकाश स्रोत के संरेखण का विश्लेषण करते समय समस्याग्रस्त किया जा सकता है कि अवांछित छाया कारण होगा misalignment के रूप में महत्वपूर्ण है इमेजिस। यह इमेजिंग के दौरान अतिरिक्त स्थिरता देता है इसके अलावा, एक विरोधी कंपन मेज या प्लेट के ऊपर प्रकाश माइक्रोस्कोप रखकर सबसे प्रयोगशालाओं में फायदेमंद है।
इमेजिंग के लिए एक पतली गिलास नीचे पेट्री डिश उपयोग कर के लाभ वृद्धि के प्रस्ताव के साथ उज्जवल छवियों तब्दील हो कि उच्च प्रभावी संख्यात्मक एपर्चर मूल्यों शामिल हैं।
जब takimicroposts सुझावों पर ध्यान केंद्रित की है के रूप में एक 50% बंद आईरिस की वजह से एक कुरकुरा अंधेरे की अंगूठी के रूप में प्रदर्शित परिधियों के लिए सिफारिश की है, उज्ज्वल क्षेत्र मोड में छवियों एनजी। खेतों में उद्देश्य के लिए एक मुआवजा अंगूठी है मामले में इसके अलावा, यह इसे सही ढंग से स्थापित करने के लिए सटीक बल readouts प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। कि सुविधा के प्रभाव चित्रा 3 ए और चित्रा 3 बी की तुलना करके देखा जा सकता है। जल्दी चित्रा -3 सी के रूप में दिखाया इष्टतम रोशनी के साथ मिलकर मुआवजे की अंगूठी की सही सेटिंग के संयोजन के द्वारा प्राप्त कर रहे हैं विश्लेषण किया जा सकता है कि छवियों। यह खोज एल्गोरिथ्म गति के रूप में एक micropost और उसके आसपास के बीच मजबूत विपरीत विश्लेषण समय कम कर देता है। उपयोगकर्ताओं को केवल कम से कम अनुभव आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है कि छवियों को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है कि मिल जाएगा।
महत्वपूर्ण बात है, ऊपर प्रोटोकॉल दिनचर्या में micropost सरणियों के तेजी से और प्रभावी एकीकरण के लिए एक महत्वपूर्ण और आम बाधा को दूरप्रयोगशाला का काम। केवल सेंसर reproducibility है, संवेदनशीलता और सटीकता की गहन और विस्तृत प्रयोगात्मक लक्षण वर्णन से प्राप्त है कि एक मांग - यह बाधा सरणी गुणवत्ता को नियंत्रित करने के लिए जरूरत से उपजा है। हालांकि, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध micropost सरणियों को बदल कर इस खासी बाधा पूरी तरह से। टाला आंकड़े -4 ए और 4 बी इस तरह के एक micropost सरणी की सटीकता को वर्णन किया गया है। microposts स्थिति का विचलन अच्छी तरह से 200 एनएम के तहत और इस्तेमाल की स्थापना के लिए 82 एनएम के एक पिक्सेल आकार में हुई है कि कैमरा / उद्देश्य संयोजन के साथ जुडा हुआ है कि एक "पिक्सेल त्रुटि" के साथ इस तरह तुलनीय रूप में है। microposts deflecting कोशिकाओं के साथ छवियों के विश्लेषण के लिए शोर अनुपात एक आरामदायक संकेत करने के लिए अग्रणी (चित्रा 4C और चित्रा 4D में दिखाया गया है) एक सेल लगाया विक्षेपन के लिए मूल्यों को काफी हद तक अधिक से अधिक 200 एनएम हैं कि यह दर्शाता है।
चित्रा 5 illustratतों एक छवि के भीतर microposts के लिए दिखावे के विभिन्न प्रकार यह हटाया हुआ है या नहीं निर्भर करता है। गैर-सीधे रास्ते microposts ऊपर उल्लेख किया है उन्हें चारों ओर एक अंधेरे की अंगूठी के साथ एक उज्ज्वल परिपत्र भूमिका है। उनकी स्थिति डिजिटल छवि विश्लेषण के लिए एक सुविधा निकासी तकनीक है जो एक Hough परिवर्तन, उपयोग निर्धारित किया जा सकता है।
इसके अलावा, यह एक औंधा माइक्रोस्कोप पर सीधे रास्ते microposts अंधेरे आधा चाँद आकार (चित्रा 5A देखें) का सामना करना पड़ दो बताते हैं कि पता चलता है। दूसरा एक का पता लगाने के लिए मुश्किल हो जाता है, जबकि एक ईमानदार माइक्रोस्कोप में micropost टिप और एक अंधेरे आधा चाँद आकार के किनारे ठीक से दिखाई दे रहे हैं। इन विशेषताओं के इस प्रोटोकॉल के लिए विकसित किया गया है और "कंटूर दृष्टिकोण" नाम दिया गया था, जो सीधे रास्ते microposts, से सुझावों के उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप छवियों के पदों की गणना के लिए आधार हैं।
चित्रा 5 ब एक HuO9 हड्डी के कैंसर का एक उदाहरण हैएक औंधा माइक्रोस्कोप (ऊपर) पर imaged microposts पर सेल। कि छवि का विश्लेषण किया संस्करण लागू किया समोच्च दृष्टिकोण (नीचे)। चित्रा 5C एक ईमानदार माइक्रोस्कोप (ऊपर) के साथ एक ही micropost सरणी का उपयोग कर लिया गया था से परिणामों से पता चलता है। फिर से विश्लेषण किया संस्करण समोच्च दृष्टिकोण का उपयोग करने से परिणाम से पता चलता है।
हर छवि विश्लेषण सत्र MechProfiler के "सेटिंग" खंड में मानकों का एक उपयोगकर्ता सत्यापन से शुरू होता है। कुछ micropost सरणी आयाम और लगातार वसंत की तरह micropost निर्माता द्वारा दिया जाता है। दूसरों ऐसे समोच्च सीमा और सॉफ्टवेयर के मैनुअल में विस्तृत प्रक्रिया के अनुसार एक न्यूनतम विक्षेपन सीमा के लिए मूल्यों के रूप में उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित कर रहे हैं। हालांकि, यह इन मूल्यों को ध्यान से चुना जाना चाहिए और तुलनीयता गारंटी करने के लिए छवियों का एक interrelated सेट के भीतर सभी छवियों के लिए निरंतर होना चाहिए कि यह नोट करना महत्वपूर्ण है। छवि का विश्लेषण करने के लिए पूर्व प्रसंस्करण कदम जबकिएस "फाइंडिंग centroids", जैसे सॉफ्टवेयर कार्यों "ग्रिड उत्पन्न" और "कंटूर दृष्टिकोण" और अधिक विस्तृत स्पष्टीकरण की जरूरत के लिए अंतर्निहित रणनीतियों आत्म-समझा, फसल की तरह कर रहे हैं।
डिफ़ॉल्ट micropost स्थिति की एल्गोरिथम का पता लगाने (निर्माता द्वारा दिया के रूप में) "ढूँढना centroids" सॉफ्टवेयर समारोह का उपयोग करके शुरू होता है। एल्गोरिथ्म पहले micropost के लिए खोज एक छवि के शीर्ष बाएं कोने में शुरू होता है। इसके बाद अन्य सभी microposts हेक्सागोनल ज्यामिति निम्नलिखित निर्माता द्वारा दिए गए ग्रिड और micropost आकार के लिए कि पहले micropost के निर्देशांक प्लस मूल्यों के आधार पर पाए जाते हैं। प्रत्येक पाया micropost के लिए केन्द्रक एक Hough परिवर्तन उपयोग कर की गणना की जाती है। जीयूआई का आदेश बटन के बगल में फिल्टर स्लाइडर इस बदलाव की संवेदनशीलता को एडजस्ट करने की अनुमति देता है। सभी पाया microposts एक रेड क्रॉस के साथ चिह्नित किया है और उनके पदों सु लिए विख्यात रहे हैंbsequent प्रक्रियाओं।
अगला, "ग्रिड उत्पन्न" समारोह सब microposts युक्तियों के निर्देशांक की ओर जाता है। वे एक बहु कदम प्रक्रिया से परिणाम हैं। सबसे पहले एक अनुकूलन समारोह आदर्श ग्रिड स्थापित करने से पहले मार डाला "centroids खोजें" एल्गोरिथ्म से प्रारंभिक पदों सहित हल है। दूसरा सेल क्षेत्र के अंदर microposts के पदों पर गणना कर रहे हैं। आदर्श ग्रिड से सेटिंग पैरामीटर "न्यूनतम विक्षेपन सीमा" के सापेक्ष में परिभाषित की तुलना में कम विक्षेपन साथ Microposts एक ह्यूग परिवर्तन के साथ कार्रवाई कर रहे हैं। अन्य सभी micropost टिप पदों हटाया हुआ microposts के लिए ऊपर वर्णित समोच्च दृष्टिकोण का उपयोग कर गणना कर रहे हैं। यहाँ सॉफ्टवेयर (चित्रा 5A देखें) दूर (अंधेरे को उज्ज्वल) एक परिपत्र बढ़त के लिए सेल के केंद्र से 15 डिग्री के कोण के भीतर प्रारंभिक केन्द्रक से खोज शुरू होता है। कि धार दी micropost व्यास के साथ एक चक्र पाया जाता है एक बार टी के लिए फिट हैजीयूआई में सेटिंग्स से समोच्च दहलीज मूल्य का उपयोग टोपी धार। यही कारण है कि पैरामीटर पिक्सेल ग्रे मूल्य फिटिंग प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है, जो निर्धारित करता है। उच्च मूल्य है कि फिटिंग उज्जवल micropost केंद्र की ओर leans अधिक है कम यह गहरा micropost रूपरेखा के उस चक्र से फिट बैठता है और अधिक महत्व देते हैं कि। एक बार जब सभी छवि कृत्रिम विक्षेपन जोड़ने या भी परंपरागत ढंग से विक्षेपण फोन से बचने के लिए दिए गए अध्ययन के भीतर विश्लेषण के लिए मूल्य स्थिर रहना चाहिए कि चुना।
उदाहरण के लिए, चित्रा 6 एक उपयुक्त समोच्च दहलीज मूल्य के लिए निर्णय लेने के महत्व को दिखाता है। सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ता सभी शारीरिक रूप से संभव रोशनी स्थितियों धरना एक विस्तृत श्रृंखला (0.1-0.9) के लिए चयन करने के लिए अनुमति देता है। दोनों चरम सीमाओं और बीच में एक और अधिक व्यावहारिक मूल्य के लिए दिए गए विक्षेपन दूरी में ऑप्टिकल जानकारी का अनुवाद चित्रा 6B में दिए गए हैं। हालांकि, प्रशिक्षित सॉफ्टवेयर उपयोगकर्ताओं को अक्सर convergई के लिए बहुत ही समोच्च दहलीज मूल्यों, चित्रा 6C में देखा जा सकता है के रूप में तुलनीय परिणाम के लिए अग्रणी। इसके अलावा, सेल धुंधला और इमेजिंग के लिए मानकीकृत प्रक्रियाओं का उपयोग आम तौर पर छवियों के परस्पर सेट के लिए भीतर लगातार रहना चाहिए जो अमान्य समोच्च दहलीज मूल्यों के जोखिम को कम करता है।
विधि की मजबूती को प्रदर्शित करने के लिए Mechano रूपरेखा परिणामों की एक चयन चित्रा 7 में संक्षेप हैं। चित्रा 7A दो हड्डी का कैंसर कोशिकाओं HuO9 से परिणाम और M132 से दोनों की तुलना कर रहे हैं। सभी चार सरणियों ही उत्पादन बैच से हैं और इसलिए समान यांत्रिक गुणों है। विश्लेषण न्यूनतम विक्षेपन (0.25 माइक्रोन) के लिए मानकों का एक निश्चित सेट के साथ और समोच्च सीमा (0.125) के लिए किया गया था। इसके अलावा, Saos 2 हड्डी के कैंसर से छवियों के दो समान सेट पैरामीटर सेटिंग्स (7 चित्रा को देखने के बारे में अधिक जानकारी के बिना दो विश्लेषकों को दिए गएबी)। विश्लेषण पर धुंधला के प्रभाव के बाद डाई हटा दिया गया था Coomassie ब्लू आर के साथ दाग हड्डी के कैंसर की कोशिकाओं की छवियों को लेने के द्वारा परीक्षण किया गया था। Coomassie ब्लू जी के साथ फिर से धुंधला के बाद छवियों का एक दूसरे सेट में लिया गया था। चित्रा 7C न्यूनतम विक्षेपन (0.25 माइक्रोन) के लिए समान मूल्यों के साथ ही उपयोगकर्ता द्वारा विश्लेषण किया गया है, जो दोनों श्रृंखला, से परिणाम और समोच्च दहलीज को दिखाता है (0.25) ।
लागू किया Mechano रूपरेखा का एक विशिष्ट उदाहरण संकलित आंकड़ों चार सरणियों में से प्रत्येक से जमा 151 कोशिकाओं का विश्लेषण करने के बाद हड्डी के कैंसर के सेल लाइनों HuO9 और M132 के लिए प्रस्तुत किया है जिसमें चित्रा 8A में प्रस्तुत किया है। M132 के लिए पहले से ही HuO9 कोशिकाओं M132 की तुलना में अधिक बल लागू यह दर्शाता है कि तुलना में इस अवलोकन में सभी सूचक मूल्यों HuO9 के लिए अधिक कर रहे हैं। हालांकि, छवि विश्लेषण से डेटा बेहतर Phen समझने के लिए खनन किया जा सकता है कि अतिरिक्त एकल कोशिका जानकारी की एक बड़ी मात्रा में होता हैएक दिया लाइन के भीतर otypic सेल लाइन व्यवहार और सेल करने वाली सेल परिवर्तनशीलता। एक बॉक्स साजिश में micropost प्रति बल के लिए परिणाम पेश करके एक समान न्यूनतम और Maxima के बावजूद, डेटा मूल्यों को अलग ढंग से वितरित कर रहे हैं और वास्तव में HuO9 कोशिकाओं अत्यधिक मेटास्टेटिक M132 लाइन की तुलना में अधिक बल लागू करने के लिए करते हैं कम मेटास्टेटिक सेल लाइन (आंकड़ा देख पाता है कि 8B)। इसके अलावा, सेल क्षेत्र के संबंध में बल मूल्यों के वर्गीकरण से एक सेल प्रति औसत बल केवल M132 के लिए बल्कि micropost बढ़ जाती है प्रति औसत बल कोशिकाओं का प्रसार के रूप में उस पद तक पहुँच प्रति औसत बल जब तक तुलना HuO9 कोशिकाओं के लिए ऊंचा नहीं है कि पाता है (के रूप में चित्रा 8 में देखा जा सकता है) एक अधिक स्थिर मूल्य। इसके अलावा सात microposts को कवर कोशिकाओं के लिए मूल्यों की वजह से वे आम तौर पर केंद्रीय एक साथ हेक्सागोनल आकार में दिखाई देते हैं कि इस तथ्य के कारण है, जो शायद लगभग समान हैं, गैर-सीधे रास्ते से अपने सेल लाइन की micropost स्वतंत्र। इसके अलावा अन्तर सेerences सिकुड़ना में, रूपात्मक मतभेद दिलचस्प परिणाम के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। अत्यधिक मेटास्टेटिक M132 कोशिकाओं के विपरीत उदाहरण के लिए केवल तीन microposts कवर किया है कि बहुत कुछ HuO9 कोशिकाओं रहे थे। सेल लाइनों के बीच अन्य रूपात्मक तुलना के कवर microposts की संख्या का प्रतिनिधित्व करती सेल क्षेत्र के वितरण सहित बनाया जा सकता है। 8D microposts के शीर्ष पर बढ़ रहा है जब दो सेल लाइनों को भी गतिशील प्रसार के व्यवहार में अलग दिखाता है कि चित्रा। संक्षेप में, माता पिता का सेल लाइन के लिए mechanoprofile HuO9 वे आम तौर पर विशेषता से कम microposts को शामिल किया गया है, और अधिक क्षेत्र को कवर किया और मेटास्टेटिक सेल लाइन M132, HuO9 से निकला है कि एक आक्रामक सेल जबकि microposts करने के लिए थोड़ा और अधिक बल लागू पता चलता है कि और micropost प्रति कम बल पर लागू होता है । इन परिणामों के भेदभावपूर्ण अनुप्रयोगों के लिए एक TFM आधारित दृष्टिकोण की क्षमता प्रदर्शित करता है।
चित्रा 2. इमेजिंग सेटअप। एक मानक औंधा माइक्रोस्कोप micropost सरणियों पर कोशिकाओं इमेजिंग के लिए प्रयोग किया जाता है। सेटअप भी भी डेटा भंडारण कार्य प्रदान कर सकते हैं, जो एक माइक्रोस्कोप कैमरा और उसके नियंत्रक, शामिल हैं। दिखाया बड़ी स्क्रीन आवश्यक नहीं है, लेकिन फिर भी बढ़ाया इमेजिंग के लिए सुविधाजनक हैसत्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Micropost इमेजिंग के लिए चित्रा 3. दिशानिर्देश। उज्ज्वल क्षेत्र मोड में एक 40x लेंस के साथ लिया एक micropost सरणी पर दाग कोशिकाओं (ए) छवि। Imaged जब गैर-सीधे रास्ते microposts के रूप में अंधेरे के छल्ले दिखाई देते हैं। सीधे रास्ते पदों गहरा और उज्जवल उप दोनों क्षेत्रों के साथ एक अण्डाकार आकार ग्रहण। Microposts कवर किया है कि दाग कोशिकाओं उन्हें micropost और सेल के बीच कोई विपरीत है कि बात करने के लिए भी गहरा दिखाई देता है। (बी) के समान छवियों लेंस मुआवजा अंगूठी को एडजस्ट करने और फिर से ध्यान केंद्रित करने के बाद लिया। यहाँ microposts की कोर काफी उज्जवल बन गए हैं और अधिक विपरीत दे। (सी) adjus के बाद फिर से imaged ही स्थितिटिंग कैमरा नियंत्रक के साथ सभी रोशनी मापदंडों। स्वतंत्र रूप से खड़े microposts एक अंधेरे की अंगूठी के साथ के रूप में उज्ज्वल हलकों दिखाई देते हैं। सीधे रास्ते से microposts खींच अक्ष के साथ खलीज कोर के आसपास एक अलग आधा चाँद "छाया" दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। >
चित्रा 4. विश्लेषण किया microposts की MechProfiler स्क्रीनशॉट। (ए) एक खाली का एक विशिष्ट उदाहरण micropost सरणी इस स्क्रीनशॉट में देखा जा सकता है। microposts एक निरंतर हेक्सागोनल पैटर्न में व्यवस्थित कर रहे हैं। (बी) इन microposts के लिए नीचे को झुकाव मूल्यों के साथ हिस्टोग्राम सभी मूल्यों 200 एनएम से नीचे हैं कि पता चलता है। एक HuO9 हड्डी के कैंसर के सेल को कवर करने के लिए (सी) विशिष्ट उदाहरणऔर कई microposts पर खींच रहा है। इसे खींच की राशि विषम है कि देखा जा सकता है। (डी) HuO9 सेल के लिए नीचे को झुकाव मूल्यों के साथ हिस्टोग्राम micropost सब्सट्रेट के साथ कोशिकाओं 'बातचीत से उठता है कि विक्षेपण का व्यापक स्पेक्ट्रम से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5. Micropost उज्ज्वल क्षेत्र रोशनी में दिखावे और एक छवि के भीतर अपनी स्थिति की गणना के लिए रणनीतियों। (ए) गैर-सीधे रास्ते microposts एक अंधेरे बाहरी रिंग के साथ एक उज्ज्वल परिपत्र क्षेत्र के रूप में प्रकट होता है। केन्द्रक एक Hough के परिवर्तन द्वारा गणना की जाती है। सीधे रास्ते से microposts अंधेरे आधा चाँद आकार दिखा। Microposts ligh का सामना करना पड़ता है, तो माइक्रोस्कोप सेटअप के आधार पर टी स्रोत (जैसे, उल्टे माइक्रोस्कोप) दो अच्छी तरह से दिखाई आधा चाँद आकार रहे हैं। Microposts लेंस सामना करना पड़ता है (उदाहरण के लिए, ईमानदार माइक्रोस्कोप) केवल एक आधा चाँद अच्छी तरह से दिखाई दे रहा है लेकिन यह भी टिप के बहुत किनारे है। दोनों ही मामलों में समोच्च दृष्टिकोण micropost टिप की गणना करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए। एक HuO9 हड्डी के कैंसर के सेल और समोच्च दृष्टिकोण का उपयोग कर अपने विश्लेषण किया संस्करण (नीचे) से एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग (बी) के एक मूल छवि (ऊपर)। (सी) एक ईमानदार माइक्रोस्कोप और फिर समोच्च दृष्टिकोण (नीचे) को लागू करने का विश्लेषण किया संस्करण का उपयोग कर एक ही micropost सरणी (ऊपर) से मूल छवि लेकिन अंधेरे अंगूठी के आकार बढ़त फोन करने के लिए अधिक उपयुक्त एक बहुत कम समोच्च दहलीज मूल्य। साथ कृपया यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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समोच्च दृष्टिकोण और उचित मूल्य सीमा को चुनने 6. चित्रा। (ए) तीन स्क्रीनशॉट तीन अलग-अलग समोच्च दहलीज मूल्यों का उपयोग कर एक ही विश्लेषण किया microposts वर्णन। मूल्य निर्धारित किया जाता है, तो या तो बहुत कम (बाएं) या (दाएं) सॉफ्टवेयर गलत तरीके से micropost सिर का प्रतिनिधित्व करता है कि नीले रंग की अंगूठी फिट बैठता है की तुलना में बहुत अधिक है। यह underestimates या micropost सिर की वास्तविक स्थिति overshoots। एक सही ढंग से चुना सीमा मूल्य नीचे को झुकाव के माध्यम से है कि रूपों micropost अंदर अंधेरे क्षेत्र आकार का आधा चाँद के लिए है कि नीले रंग की अंगूठी फिट करने के लिए सॉफ्टवेयर सक्षम बनाता है। (बी) के ग्राफ ऊपर में दिखाया गया microposts के लिए चुना समोच्च दहलीज पर निर्भर विक्षेपन की औसत राशि से पता चलता है। यह भी समोच्च फिटिंग वहाँ लागू नहीं है क्योंकि सेल रूपरेखा बाहर microposts के लिए मूल्यों को प्रभावित नहीं कर रहे हैं कि दिखाता है। (सी) ग्राफ चुनने दिखाता है किएक उदारवादी अंतराल के भीतर एक मूल्य सीमा खत्म या underestimating micropost विक्षेपण का खतरा minimalizes। अलग प्रशिक्षित उपयोगकर्ताओं द्वारा चुना मूल्यों के बीच अंतर औसत विक्षेपन मूल्यों में स्वीकार्य मतभेद में जो परिणाम 0.05, की तुलना में सामान्य रूप से कम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7. विभिन्न हड्डी के कैंसर के सेल लाइनों से Mechano-प्रोफाइल परिणामों के लिए मजबूती का परीक्षण; त्रुटि सलाखों के एक मानक विचलन का प्रतिनिधित्व (ए) Mechano रूपरेखा सरणी 3 पर सरणी 1 और M132 पर HuO9 कोशिकाओं बोने के बाद चार समान micropost सरणियों से परिणाम -। चार दिन बाद सरणी 4. (बी) पर सरणी 2 और M132 पर HuO9 बोने मीटर से परिणामों की तुलनादो स्वतंत्र विश्लेषकों द्वारा विश्लेषण के बाद छवियों के समान सेट पर आधारित echano-प्रोफाइलिंग। पहले एक Coomassie ब्लू आर और Coomassie ब्लू जी के साथ पूरा डाई को हटाने और फिर से धुंधला के बाद दूसरे के साथ धुंधला के बाद लिया अलग छवि श्रृंखला के दो से छवि विश्लेषण के परिणाम (सी) तुलना कृपया यहाँ क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए । >
8 चित्रा हड्डी कैंसर कोशिका लाइनों के Mechano-प्रोफाइलिंग। (ए) दो हड्डी कैंसर कोशिका लाइनों HuO9 के बीच तुलना (कम मेटास्टेटिक संभावित) और M132 (अत्यधिक मेटास्टैटिक) ग्राफ सब सूचक मान (HuO9 सेल लाइन के लिए अधिक कर रहे हैं कि पता चलता है कुल एन = 302; प्रयोगों के दो स्वतंत्र सेट, त्रुटि बार = मानक विचलन)। (बी trong>) बॉक्स साजिश micropost प्रति लागू बलों कम नैनो न्यूटन रेंज में हैं कि दिखाता है। हालांकि, HuO9 कोशिकाओं M132 कोशिकाओं (मूंछ डेटा न्यूनतम और अधिकतम प्रतिनिधित्व करते हैं) की तुलना में अधिक खींच। (सी) एक समान परिणाम microposts की एक ही नंबर कवर किया है कि कोशिकाओं की तुलना करके देखा जा सकता है। HuO9 सेल M132 कोशिकाओं की तुलना में अधिक बल लागू होते हैं। तीन microposts को कवर HuO9 कोशिकाओं की संख्या में प्रतिनिधि और केवल पूर्णता (त्रुटि बार = मानक विचलन) के लिए शामिल नहीं है। (डी) कवर microposts की संख्या भर में विभिन्न वितरण micropost सरणियों के साथ बातचीत के दौरान जब प्रत्येक हड्डी कैंसर कोशिका लाइन के लिए अपने स्वयं के प्रसार विशेषता है कि प्रदर्शित करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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पूरक चित्रा 9. एक माइक्रोस्कोप की स्थापना के लिए पिक्सेल आकार में आम तौर पर उस पर एक पैमाने पर पट्टी के साथ एक विशेष माइक्रोस्कोप स्लाइड का उपयोग निर्धारित किया जाता है; वैकल्पिक रूप से निर्माता द्वारा दिए गए micropost सरणी लेआउट, इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, (एक छवि प्रसंस्करण उपकरण के साथ स्थापित) 2375 पिक्सल से विभाजित 13 माइक्रोन (195 माइक्रोन की कुल लंबाई) के साथ 15 इकाइयों 0.082 करने के लिए सुराग माइक्रोन / PXL। कृपया यहां क्लिक करें यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।
पूरक चित्रा एक औंधा माइक्रोस्कोप पर दो रोशनी तकनीक का उपयोग कर एक ही स्थिति से ली गई एक HuO9 हड्डी के कैंसर के सेल की छवियों के 10 की तुलना; डियो दाग microposts हरी फ्लोरोसेंट कर रहे हैं। (ए उज्ज्वल क्षेत्र मोड। (ख) मैं हरी प्रतिदीप्ति चैनल के लिए स्विचन के बाद लिया दाना विश्लेषण refocusing बिना। (सी) बहुत micropost सुझावों के लिए ध्यान केंद्रित कर सही करने के बाद दूसरा प्रतिदीप्ति छवि। दोनों रोशनी चैनलों (डी) ओवरले इनका उद्देश्य केवल। (ई) तीन छवियों से परिणाम के रूप में संकेतक Mechano रूपरेखा। पूर्ण विक्षेपन प्रतिदीप्ति छवियों से अनुमान लगाया जा सकता फोकस सही करने के बावजूद। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
अनुपूरक फाईएक ईमानदार माइक्रोस्कोप पर DiI का उपयोग कर fluorescently दाग microposts की एक ही स्थिति का आंकड़ा 11. छवि अनुक्रम (ए) उज्ज्वल क्षेत्र छवि।; नोक पर एक दूसरे को छू तीन microposts देखते हैं। (बी) थोड़ा microposts 'सिर के ऊपर फ्लोरोसेंट चैनल को बदलने के बाद भी एक ही स्थिति। Microposts की बहुत टिप करने के लिए फोकल हवाई जहाज़ को कम करने (सी)। (डे) आगे microposts 'नीचे की ओर फोकल हवाई जहाज़ चरणबद्ध कम करने के बाद लगातार छवियों। (एफ) सिलिकॉन elastomer सब्सट्रेट अंदर फोकल हवाई जहाज़ कम करने के बाद microposts की छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पूरक चित्रा MechProfiler जीयूआई 12. स्क्रीनशॉट। एक HuO9 हड्डी के कैंसर के सेल की रूपरेखा से ठेठ विश्लेषण परिणाम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
यह काम काफी हद तक प्रवेश के लिए तकनीकी और व्यावहारिक बाधाओं को कम से कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी के क्षेत्र अग्रिम करने के लिए करना चाहता है। इन बाधाओं को दोनों पक्षों से आते हैं। और सबसे पहले reproducibly के निर्माण और प्रयोगात्मक एक micropost सरणी आयोग को दूर किया जाना चाहिए कि कई गैर तुच्छ तकनीकी चुनौतियां हैं। एक ठेठ प्रयोग सैकड़ों या कोशिकाओं के भी हजारों के विश्लेषण की आवश्यकता हो सकती है कि ध्यान में रखते हुए - दूसरा, इसी तरह से गैर तुच्छ एकल कक्ष बलों के एक विश्वसनीय अर्द्ध स्वचालित विश्लेषण के लिए की जरूरत है। ऊपर वर्णित तकनीकों निवासी इंजीनियरिंग विशेषज्ञता की जरूरत नहीं है कि कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशालाओं के भीतर micropost आधारित कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी सुलभ बनाने के लिए विकसित किए गए। इस लेख में प्रस्तुत सेंसर और विश्लेषण तकनीक गैर विशेषज्ञों को आसानी से और सही ढंग से एकल कक्षों द्वारा लगाए गए बलों का विश्लेषण करने की अनुमति होनी चाहिए।
इसके अलावा एक कोशिका जीव विज्ञान एल के लिए उपयोग सेकम से कम एक मध्य ग्रेड उज्ज्वल क्षेत्र माइक्रोस्कोप के साथ एबी, वर्णित विधि कुछ अतिरिक्त तकनीकी तत्वों की आवश्यकता होती है। यहां अधिकांश उपयोगकर्ताओं तकनीक की शक्ति और बहुमुखी प्रतिभा के बावजूद भी सीमित अनुभव के साथ वैध कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी प्रयोगों प्रदर्शन कर सकते हैं। फिर भी विचार किया जाना चाहिए कि प्रस्तुत प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण पहलू हैं। पहले यह micropost सरणियों हमेशा उनके पतन के कारण है कि केशिका बलों से बचने के लिए तरल के साथ कवर कर रहे हैं कि यह सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक है। दूसरा एक सबसे अच्छा समय जोखिम, आईरिस एपर्चर, और मुआवजे की अंगूठी स्थिति बदलती है, जबकि एक ही सरणी स्थिति की छवियों की श्रृंखला लेने के द्वारा किया जाता है, जो अधिग्रहण किया micropost छवियों, के लिए इमेजिंग मापदंडों का अनुकूलन की जरूरत है। यह micropost टिप के लिए सही फोकल विमान को खोजने के लिए महत्वपूर्ण है, और इस पहलू सेंसर सरणियों के छोटे आयामी गहराई को देखते हुए कुछ अनुभव ले करता है। खुले तौर पर सुलभ छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर MechProfiler discusse डाउनलोड करना होगा तीसरा एक, यहाँ घ, जिसके लिए एक विस्तृत मैनुअल और प्रशिक्षण उदाहरण डाउनलोड साइट पर उपलब्ध हैं। उपयुक्त माइक्रोस्कोप सेटिंग्स विन्यस्त करने के लिए इतनी के रूप में मैनुअल के साथ दिए गए उदाहरणों का विश्लेषण करने के लिए सॉफ्टवेयर का उपयोग कर कुछ अनुभव के बाद, उपयोगकर्ता इमेजिंग सेटअप पर परीक्षण छवियों इस्तेमाल किया जा करने के लिए ले जाना चाहिए। प्राप्त छवियों के आधार पर, समोच्च सीमा मूल्य इसी तरह अनुकूलित किया जाना चाहिए। एक एकल micropost छवि के कुछ ही घंटों के भीतर (कोशिकाओं के कई सैकड़ों के विश्लेषण) सांख्यिकीय प्रासंगिक परिणामों की पीढ़ी के लिए अनुमति देता है, भले ही यह एक या एक से अधिक सेल शामिल हैं कि क्या की ओपन-सोर्स MechProfiler सॉफ्टवेयर का उपयोग कर एक मिनट के भीतर एक प्रशिक्षित उपयोगकर्ता द्वारा विश्लेषण किया जा सकता ।
कुछ बदलाव की आवश्यकता है कि एक और पहलू किसी भी एप्लाइड सेल धुंधला प्रक्रिया के अनुकूलन है। कोशिकाओं पीढ़ी-दाग रहे हैं जब सॉफ्टवेयर सही micropost पदों पर रजिस्टर करने के लिए असफल हो सकता है। धुंधला भी बेहोश है, तो दूसरी ओर यह एक का पता लगाने के लिए उपयोगकर्ता के द्वारा और अधिक प्रयास की आवश्यकता हैपतली सेल उभार के रूप में "सच" सेल रूपरेखा याद किया जा सकता है।
हालांकि, सेल धुंधला और सरणी इमेजिंग प्रक्रिया का एक निश्चित प्रोटोकॉल को लागू करने से इस त्रुटि के लिए सीमा स्वीकार्य कम हो जाता है। इस काम के दौरान अलग अलग सेल धुंधला प्रक्रियाओं क्रिस्टल बैंगनी, बीच 20 या ट्राइटन एक्स, या Eosin जोड़कर रंगों के संयोजन की तरह surfactants की उपस्थिति के विभिन्न सांद्रता के आधार पर परीक्षण किया गया। बहरहाल, प्रयोग से काफी हद तक अलग-अलग धुंधला की तीव्रता के साथ ही इसकी स्थिरता प्रयोग करने के लिए। जैसा कि ऊपर वर्णित खूब ब्लू जी का ही उपयोग अभी भी पतली सेल रूपरेखा देखने के लिए पर्याप्त तीव्रता के साथ, लेकिन विकसित समोच्च दृष्टिकोण के साथ हस्तक्षेप किए बिना संयुक्त एक स्वीकार्य सेल धुंधला मजबूती देखी गई।
सामान्य तौर पर, प्रस्तुत तकनीक को संशोधित करने के लिए विकल्प हैं। प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी धुंधला अंगों के साथ यहां प्रस्तुत उज्ज्वल क्षेत्र तकनीकों के संयोजन से उदाहरण के लिएसेल यांत्रिकी के संदर्भ में अंतर्निहित सेल प्रक्रियाओं के बारे में अतिरिक्त जानकारी प्रदान कर सकते हैं, जो नाभिक या actin रेशा नेटवर्क है, की तरह। इसके अलावा, का उपयोग करते हुए लंबी श्रृंखला dialkyl carboxycyanines (DiI या डियो) microposts फ्लोरोसेंट हो जाते हैं। 14 बहरहाल, यह प्रस्तुत तकनीक से प्रत्येक विचलन को नियंत्रित करने के लिए महत्वपूर्ण है। पूरक आंकड़े 10 और 11 चित्रा संभावित नुकसान को दर्शाते हैं। उल्टे माइक्रोस्कोप का उपयोग हरे प्रतिदीप्ति चैनल (चित्रा 10B और 10 ग) में एक Coomassie ब्लू जी दाग एनआईएच 3T3 fibroblast सेल का लिया छवियाँ एक दोषपूर्ण स्थिति के विश्लेषण (चित्रा 10E) के लिए अग्रणी मुख्य micropost शव नहीं बल्कि उनके सुझावों प्रस्तुत करते हैं। सेल दाग द्वारा प्रतिदीप्ति संकेत के अवशोषण के कारण हो सकता है, जो उज्ज्वल क्षेत्र मोड micropost युक्तियों imaged नहीं किया जा सकता है (चित्रा 10A) से बदलने के बाद भी refocus करने के लिए सबसे अच्छा प्रयास के बावजूद। यह भारतीय सैन्य अकादमी के विपरीत हैएक ईमानदार माइक्रोस्कोप (चित्रा 11B-11F) के पीले प्रतिदीप्ति चैनल के साथ लिया GES जिसमें कई कुरकुरा छवियों Z अक्ष के साथ प्राप्त किया जा सकता है। यहाँ उपयोगकर्ता छवि दोषपूर्ण विक्षेपन मूल्यों फोन से बचने के लिए micropost नीचे करने के लिए कहीं न कहीं करीब बहुत टिप (चित्रा 11C) पर फोकल हवाई जहाज़ के साथ लिया जाता है और नहीं है कि यह सुनिश्चित करने की जरूरत है।
यह micropost assays के लिए तकनीकी सीमाओं को भी देखते हैं कि ध्यान दिया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, एक का पता चला विक्षेपन की सटीकता ऑप्टिकल सेटअप की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। सूक्ष्मदर्शी अक्सर जुड़ा कैमरा के प्रकाश के प्रति संवेदनशीलता पिक्सल की एक बड़ी संख्या की तुलना में एक उच्च प्राथमिकता है जिसमें प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए अनुकूलित कर रहे हैं। स्वाभाविक रूप से, यह एक बड़ा पिक्सेल आकार के साथ छवियों की ओर जाता है। इसके अलावा, यह सेल उभार सब्सट्रेट नीचे पहुंच यदि उज्ज्वल क्षेत्र छवियों निर्धारित नहीं कर सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। हालांकि, वाणिज्यिक micropost सरणियों कोंफोकल का उपयोग कर परीक्षण किया गयामाइक्रोस्कोपी। यह कोशिकाओं micropost सरणी के आराम के लिए micropost सुझावों पर केवल आसंजन को बढ़ावा देता है और नहीं है कि बाइनरी कोटिंग स्वीकार करने लगते हैं कि पाया गया था। एक और पहलू 0.2 माइक्रोन होना दिखाया गया है, जो micropost सरणी, स्थितीय त्रुटि से निकला है। साथ में 2.8 एनएन / माइक्रोन की दी लगातार वसंत के साथ इस 0.6 एन के बल पढ़ने के लिए बाहर में एक त्रुटि की ओर जाता है। Micropost assays के लिए एक और बाधा एकाधिक कोशिकाओं द्वारा साझा microposts से लागू बलों निर्धारित नहीं किया जा सकता है कि इस तथ्य से निकला है। इसलिए, केवल पृथक एकल कोशिकाओं का विश्लेषण किया जा सकता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल के लिए एक विशिष्ट सीमा विश्वसनीय परिणाम हासिल करने के क्रम में उपयोगकर्ता के लिए प्रशिक्षण की एक निश्चित राशि की आवश्यकता है जो संवेदनशील समोच्च दृष्टिकोण का सही आवेदन, से निकला है। Micropost सरणी एक क्षैतिज या अवलोकन क्षेत्र की बढ़त के साथ एक खड़ी रेखा के रूप में करने के लिए गठबंधन किया है जिसमें इसके अलावा, एक तेजी से विश्लेषण के लिए उपयोगकर्ता के चित्र लेना चाहिए। Despitई एक हेक्सागोनल ग्रिड ज्यामिति के भीतर microposts को खोजने के लिए सॉफ्टवेयर एल्गोरिथ्म अधिक से अधिक 5 ° बंद अक्ष एक रोटेशन कोण से microposts की इमेजिंग सीमित नहीं है कि अधूरा microposts, जो तब होता है, जिसमें बिना यह मुश्किल एक छवि खंड को फसल के लिए बनाने के तथ्य "ग्रिड उत्पन्न" समारोह की एक नाकाम रहने के लिए। इस तरह के एक मामले में उपयोगकर्ता micropost पदों का विश्लेषण करने के लिए शुरू करने से पहले एकीकृत रोटेशन समारोह का उपयोग कर सकते हैं।
वर्णित विधि में मुख्य रूप से दो हड्डी कैंसर कोशिका लाइनों, HuO9 नाम के एक माता पिता के सेल लाइन, और M132 denominated एक व्युत्पन्न अत्यधिक मेटास्टेटिक लाइन को चिह्नित करने के लिए लागू किया गया था। इस संदर्भ में छह सौ से अधिक एकल कोशिका छवियों उज्ज्वल क्षेत्र मोड में ले लिया है और MechProfiler सॉफ्टवेयर का उपयोग कर विश्लेषण किया गया। बाद में डेटा खनन पैतृक सेल लाइन HuO9 थोड़ा अधिक बल डाल रही है और आम तौर पर मेटास्टेटिक सेल लाइन M132 से कोशिकाओं की तुलना में सेल के प्रति अधिक microposts शामिल किया गया है कि पता चला। हालांकि कोशिकाओंसंभावना परिणामों के व्यापक श्रेणी के लिए योगदान दिया है जो निर्धारण के क्षण में, सेल चक्र के विभिन्न चरणों में है इसलिए सिंक्रनाइज़ और नहीं कर रहे थे। 24 घंटा तक की समय अवधि में रहते सेल छवियों लेने से, यह दूसरों, प्रसार, काट विस्थापित और अलग वेग (अनुपूरक वीडियो देखें) के साथ फिर से विस्थापित जबकि प्रसार के बाद कई कोशिकाओं को अपनी प्रारंभिक स्थिति में रहते हैं कि पाया गया था। यह एक सेल के यांत्रिक प्रोफ़ाइल अक्सर स्थिर नहीं है और एक सेल की आबादी के पार या यहां तक कि अपने वर्तमान गतिविधि के आधार पर एक एकल कोशिका के भीतर काफी भिन्न हो सकता है कि इंगित करता है। एक और योगदान कारक एक सेल कोशिकाओं फ्लैट सतहों का पालन करना और मिनट कदम के साथ पलायन कर सकते हैं जहां क्लासिक TFM, के विपरीत है, जो एक और micropost तक पहुँचने के लिए असतत पलायन चरणों को पूरा करने के लिए मजबूर किया जाता है एक micropost सरणी पर कि हो सकता है। हालांकि, इन छोटे कदम का विश्लेषण करने के लिए यह बहुत ही उन्नत मीटर के लिए उपयोग की आवश्यकता है जो, फोकल आसंजन अंक के फ्लोरोसेंट चित्र लेने के लिए आवश्यक हैicroscopes और अत्यधिक विस्तृत छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर। बहरहाल, बड़ी आबादी के भीतर यांत्रिक प्रोफाइल के वितरण अक्सर अभी भी एक सेल लाइन का एक परिभाषित विशेषता है। इस प्रकार की कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या के लक्षण वर्णन के लिए सक्षम बनाता है कि एक उच्च throughput विधि जरूरी है। यहाँ प्रस्तुत मैनुअल इमेजिंग प्रक्रिया और खुले उपयोग सॉफ्टवेयर पूरी तरह से स्वचालित माइक्रोस्कोप प्रणाली के लिए स्केलिंग के लिए काफी संभावना बंदरगाहों।
सारांश में एक मजबूत कर्षण शक्ति माइक्रोस्कोपी दृष्टिकोण एक मानक कोशिका जीव विज्ञान प्रयोगशाला में आसानी से ग्रहणीय है कि प्रस्तुत किया है। छवि विश्लेषण करने के लिए सेल बोने से पूरे कार्यप्रवाह सरल और प्रभावी है। यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल पूरी तरह से कार्य कर रहे हैं, सुधार भी जीवित कोशिका इमेजिंग से छवि दृश्यों का विश्लेषण आसान बनाने कि ओर्थोगोनल लेआउट और विकासशील प्रक्रियाओं के साथ micropost सरणियों को संभालने के लिए सक्षम होने के लिए विश्लेषण एल्गोरिदम अनुकूल करने के लिए चल रहे हैं। हड्डी के कैंसर के सेल ली के लिए परिणाम के साथ संदर्भ मेंएनईएस, यहाँ वर्णित दृष्टिकोण ऐसे assays हड्डी के कैंसर के रोगियों से biopsied कोशिकाओं के मेटास्टेटिक संभावित भविष्यवाणी करने के लिए चिकित्सकों को सक्षम करने, शकुन मूल्य पकड़ सकता है कि क्या स्थापित करने के क्रम में नैदानिक बायोप्सी से स्क्रीन कोशिकाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह की एक परख चिकित्सकीय रणनीति को प्रभावित करेगा। अन्य संभावित अनुप्रयोगों संभवतः एक दवा की प्रभावकारिता या विषाक्तता स्थापित करने में सहायता करने के लिए, चिकनी मांसपेशियों की कोशिकाओं या cardiomyocytes तरह यंत्रवत् सक्रिय कोशिकाओं पर परीक्षण pharmaceutically सक्रिय यौगिकों से संबंधित हैं।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm |
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
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