Introduction
Saggi cellulari meccano-sensibili permettono di indagare cellule aderenti, con una vasta gamma di applicazioni che riflettono il ruolo centrale che la meccanica possono giocare in biologia cellulare. Queste applicazioni spesso si concentrano sui meccanismi di base che guidano i processi subcellulare o comportamenti a cellule intere. Da un lato, i fattori ambientali esterni come composizione della matrice extracellulare o rigidità matrice possono influenzare notevolmente la risposta meccanica e biologica di una cella. 1 Lo stesso può essere osservato dopo l'uso di numerose classi di composti farmaceuticamente attivi, i cui effetti sono spesso caratterizzate usando modelli di coltura cellulare. 2 D'altro canto proprietà genotipici, come quelle causate da mutazioni genetiche spontanee o indotta sperimentalmente, può indurre forti variazioni fenotipo cellulare che sono associati ad alterazioni nella struttura e funzione del citoscheletro. 3 Questi esempi sono solo alcune delle molte possibiliArgomenti per i quali fenotipizzazione meccanica delle cellule è rilevante, e tutti questi sono stati utilmente studiati con gli array micropost.
Al momento in cui scriviamo, circa 200 articoli sono stati pubblicati descrivono l'interazione cellule-micropost. Queste opere discutono aspetti teorici della micropost principi di deflessione e le istruzioni pratiche su loro fabbricazione. Il primo articolo descrive l'interazione delle cellule e array micropost flessibili è stata pubblicata da Tan e colleghi nel 2003. 4 In contrasto classica microscopia a forza di trazione (TFM) dove substrati molli continui sono utilizzati per stimare contrattilità cellulare nanonewton scala, Tan et al. descritto un metodo che utilizza multipli travi verticali strettamente distanziati di elastomero siliconico. I principali vantaggi di questa tecnica emergono due caratteristiche principali. Prima, per cambiare il substrato rigidità cellulare apparente basti cambiare le dimensioni micropost mantenendola composizione del substrato altrimenti costante ed evitando differenze di topologia superficiale e chimica. Seconda microposts agiscono come singole sorgenti che possono essere analizzati in modo discreto con forza e risoluzioni spaziali dell'ordine di singole adesioni focali e in grado di ridurre le sfide analitiche che sono inerenti all'analisi analoga dalla norma TFM.
Oggi la gamma di applicazioni per le matrici micropost supera di gran lunga solo la mappatura delle forze per un paio di singole cellule. Ad esempio, Akiyama riporta l'uso di un isolato tessuto vaso dorsale da un bruco falena come attuatore per una matrice micropost, al fine di sviluppare un insetto propulsione muscolare autonoma micro-robot. 5
Tuttavia, le applicazioni più pubblicati di microposts sono concentrati su studi di condizioni mediche come infezioni o cancro. Ad esempio, gli array micropost sono stati utilizzati per studiare la costituzione della forza di tipo IV in bundle pili di Neisseria gonorrhcolonie OEA che è associato con cascate di segnale migliorando infezione. 6 Altri hanno utilizzato microposts studiare le cellule del cancro al seno trattate con composti farmaceutici rivolte al citoscheletro. 7
Flessione di un micropost viene spesso descritto con la teoria classica del fascio per un cantilever con un carico fine assumendo la cellula si attacca solo alla punta estrema della micropost. Qui la forza applicata F che causa una deviazione δ dipende k "rigidezza flessionale" del micropost ed è calcolato mediante:
(1)
con E, I e L essendo il modulo di Young, superficie momento di inerzia e fascio lunghezza rispettivamente. Tuttavia, i risultati di questa equazione solo dare un'approssimazione generale delle forze in gioco dal fascio tranciatura e piegatura e deformazione substrato non vengono presi in accontare. Considerando che microposts sono in genere realizzati con materiali morbidi come il polidimetilsilossano (PDMS) a base di gomma siliconica di questi fattori devono essere inclusi. . Schoen et al hanno dimostrato che vi è un tale fattore di correzione in base al rapporto di aspetto del micropost (L / D) e il rapporto di Poisson del polimero corrispondente v 8 Si è dato da.:
(2)
Con T inclinazione (v) essendo un coefficiente di inclinazione che include il parametro un raccordo = 1,3 come si possono trovare nello stesso articolo:
(3)
Ciò significa rigidità corretto del micropost k corr è il prodotto del puro curvatura rigidezza k = k bend e il fattore di correzione corrin:
(4)
Pertanto, i calcoli di forza delle cellule devono essere effettuate utilizzando la variazione più raffinata dell'equazione (1) ora di lettura:
(5)
L'impatto della correzione diventa più evidente non appena vengono utilizzati i valori tipici per le quote micropost. Ad esempio, una lunga micropost 15 micron con una sezione trasversale circolare e un diametro di 5 micron in gomma siliconica a base di PDMS porta ad un fattore di correzione di 0,77 e quindi un calcolo non corretta potrebbe sovrastimare le forze esercitate cellulari del 23%. Questo diventa ancora più grave per microposts con proporzioni minori.
Tradizionalmente, micropost analisi delle immagini si è basato anche sulla teoria flessione fascio idealizzato. Nel 2005 il gruppo che aperto la strada all'uso di MICRarray opost pubblicato un software di analisi delle immagini adatto per l'analisi micropost 9 Il software richiede una licenza software e l'utente deve prendere tre immagini per ogni posizione.; uno ciascuno da piani superiore e inferiore del micropost in trasmissione e un altro in modalità fluorescenza con la cellula colorata. Dopo aver confrontato le posizioni superiore e inferiore per ogni micropost il software determina un campo di forza vettoriale e calcola i parametri correlati come forza per posta. Esistono altri pacchetti software e loro principi di analisi sono brevemente menzionati negli articoli corrispondenti che li descrivono, ma questi pacchetti software di analisi non sono generalmente disponibili al pubblico. 10,11
Gli array micropost progettati per forze cellulari mappatura possono essere classificati come essendo in un layout micropost ortogonali o uno esagonale, l'ultima delle quali hanno il vantaggio di lacune equidistanti tra tutti microposts vicini. Microposts tipici ettarive una sezione trasversale circolare e le loro dimensioni variano da 1,0 micron a 10 micron di diametro e 2 a 50 micron di lunghezza. 4 Tuttavia, sono stati riportati anche microposts a sezione ellittica o quadrata. 12,13
L'uso di miscele a base di silicone-PDMS come materiale micropost permette di aggiungere nanoparticelle nella miscela. Per esempio l'aggiunta di cobalto nano-barre consente un'attivazione magnetico della micropost e quindi dà un grado di libertà per i potenziali progetti sperimentali. 14 maggior parte dei gruppi producono i loro allineamenti micropost su substrati rigidi piatti come copertura in vetro o all'interno di una capsula di Petri. Tuttavia, Mann e collaboratori recentemente riportato una matrice micropost formata su una membrana elastica. 15 Ciò consente l'applicazione di cellule che si estende forze di cellule aderenti durante gli studi live-cell subcellulare risposte dinamiche in termini di contrattilità delle cellule.
L'e più isti largamente impiegatoprocesso tuito per rendere gli array micropost è basato su litografia soft, come descritto nei protocolli penetranti di Sniadecki e colleghi. 16-18 Nei processi standard, camere bianche brevi sono usati per generare le microstrutture sulla cima di un wafer di silicio con photoresist SU8. Questa è seguita da un processo di copia in cui la gomma di silicone è gettato sulle strutture che li trasferiscono in stampi. In una seconda fase questi stampi sono utilizzati per replicare la microstruttura iniziale utilizzando gomma siliconica su di un substrato scelto. Tuttavia, nonostante il grande e crescente numero di pubblicazioni relative alla loro applicazione, stabilendo un processo di fabbricazione per microposts richiede una notevole quantità di tempo anche per gli esperti di micro-ingegneria; ci sono molte fasi di processo che richiedono ottimizzazione e adattamento all'ambiente specifico laboratorio e la layout micropost per produrre un livello di qualità accettabile.
Array micropost commerciali sono ora disponibili in un ready-tformato o-uso ("off-the-shelf") con una qualità elevata e costante. Come tali sono un'alternativa al lungo e complesso processo di produzione necessarie per la produzione in loco. In questo lavoro un allineamento micropost disponibile in commercio è stato utilizzato per la mappatura delle forze cellulari utilizzando una singola immagine al microscopio un campo chiaro. Ancora più importante questo articolo descrive e documenta un software open-source pienamente funzionale denominato MechProfiler, che è disponibile per il download come materiale supplementare di questo manoscritto. Una versione attivamente mantenuto del software si possono trovare anche in http://www.orthobiomech.ethz.ch.
La combinazione di un saggio "off-the-shelf" e una compatibile con software di analisi open source riduce notevolmente l'ostacolo ingresso per raggiungere esperimenti TFM accurate. I ricercatori non hanno accesso a entrambi i servizi in camera puliti o esperienza di sviluppo di software in grado di analizzare le forze cellulari con successo. Esso consente all'utente di concentrarsi sulle mechanosensitivity uscita test piuttosto che la tecnologia stessa, e fa misure di forza di trazione disponibili a una comunità più ampia. Inoltre, questo è un passo importante per spianare la strada verso lo screening completamente automatica di array micropost.
Il software di analisi MechProfiler elabora le immagini in file di formato tiff, png, bmp e jpg. Le immagini possono essere scattate con la fluorescenza, contrasto di fase o in campo chiaro microscopia ottica. Il programma standalone funziona insieme con la libera Matlab compilatore runtime (disponibile presso: Figura 12) e gli algoritmi sottostanti consentire l'elaborazione delle immagini semplificata, che permette all'utente di elaborare immagini con cellule singole o multiple in circa 1 min. Inoltre, queste cellule possono essere o vivere o "fissi".
Il software MechProfiler è in grado di aumentare notevolmente la velocità di analisi dei dati basandosi su riproducibilità di array micropost qualità commerciale, più specificamente, il default e #8220, non deviato "posizione di ogni post nella matrice si può presumere contro una griglia ideale (tolleranze di fabbricazione per la griglia in matrici utilizzate per questo studio sono stati inferiori a 100 nm).
In breve si apre una selezione di file di immagine per l'analisi, le colture per la regione di interesse, definisce i posti coperti dalle cellule o che devono essere scartati, determina le posizioni postali, calcola le deformazioni / forze contro la griglia ideale, e, infine, salva tutti i dati specifici delle cellule con la possibilità per l'esportazione, tra cui a un ufficio foglio elettronico standard.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. coltura di cellule su micropost Array
Nota: Tutte le operazioni devono essere eseguite in un armadio biosicurezza per garantire la sterilità. I volumi qui indicate sono per T25 fiasche di coltura cellulare. La coltura cellulare medio ricetta e la semina delle cellule densità sono ottimizzati per le linee di cellule di cancro osseo HuO9 e M132.
- Preparare una coltura cellulare per la semina su una matrice micropost.
- Controllare la qualità coltura cellulare posizionando il pallone di coltura su un microscopio ottico standard. Assicurarsi che le cellule mostrano una crescita e morfologia tipica stimando quanto del fondo pallone di coltura è coperto. Una copertura del 70% -80% riflette un tasso di crescita sana. Prestare attenzione alla quantità di cellule galleggiante in quanto rappresentano le cellule morte e / o una cultura troppo cresciuto.
- Trypsinize cellule rimuovendo medie e lavaggio con 4 ml 1x tampone fosfato (PBS). Aggiungere 0,8 ml 1x tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubare a RT finché la cellas sloggiare, che dura circa 2-4 minuti. Controllare il processo con il microscopio e di tanto in tanto toccare il pallone con delicatezza per sostenere il sloggiare.
- Aggiungere 5 ml di mezzo di coltura cellulare (Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) / F12 con 10% di siero bovino fetale (FBS), 1% di penicillina / streptavidina (Pen / Strep)) per arrestare la reazione e per lavare le cellule residue che ancora siedono sul fondo della beuta. Successivamente pipetta questa sospensione su e giù più volte per ottenere una miscela omogenea. Assicurati di pipetta tutte le soluzioni in tutta l'area di crescita originale del pallone per ottenere un efficace sloggiare.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare utilizzando una centrifuga da tavolo a 0,5 xg per 3 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 5 ml di mezzo pipettando su e giù 5 volte. Assicurati di evitare la generazione di bolle, mentre farlo.
- Determinare densità cellulare utilizzando una camera di conteggio cellulare e un microsco lucepe. Controllare la sospensione cellulare in camera di conteggio delle cellule per aggregati di cellule e garantire avere solo singole cellule per il successivo esperimento. Pipetta di nuovo su e giù parecchie volte se le cellule tendono a formare aggregati per separarli.
- Diluire la sospensione cellulare con il mezzo sufficiente per ottenere una soluzione di cellule di 25.000 cellule / ml. Mescolare bene invertendo la provetta chiusa più volte.
- Preparare una matrice micropost per la semina delle cellule.
NOTA CRITICA: Non pipetta sulla matrice micropost direttamente in quanto ciò potrebbe potenzialmente danneggiare le microposts, soprattutto quando vengono introdotti bolle indesiderate. Inoltre, assicurarsi che la matrice micropost non si asciuga come si verificano forze capillari portano al collasso delle microposts.- Posizionare il substrato di vetro con l'array micropost affrontare in un pozzetto di una piastra 12 pozzetti utilizzando un paio di pinzette e bagnare con l'aggiunta di 1 ml di etanolo (99%). Incubare a temperatura ambiente per 20-30 secondi.
- Diluire l'etanolograduale con l'aggiunta di circa 1 ml di acqua deionizzata sterile (acqua DI) sul lato pozzo ed aspirando circa 1 ml utilizzando una pipetta di trasferimento o di dispositivo di aspirazione. Ripetere questa operazione almeno 3 volte.
- Sostituire l'acqua demineralizzata con PBS-buffer nella stessa maniera aggiungendo ed aspirando circa 1 ml. Ripetere questa operazione per 3 volte.
- Sostituire la PBS-buffer con media aggiungendo e aspirando circa 1 ml di terreno. Ripetere questa operazione per 3 volte.
- Pipettare 1 ml di soluzione di cellule (25.000 celle) sulla parte superiore di ciascun array micropost preparati. Chiudi piastra multi-pozzo e trasferirlo in un incubatore (5% CO 2, 37 ° C). Lasciate che le cellule aderiscono e crescono in cima microposts per 6 -7 ore.
- Controllare il processo di adesione di tanto in tanto, utilizzando una luce microscopio. Controllare che la maggior parte delle cellule appaiono sparsi su più microposts.
2. fissaggio e colorazione delle cellule
Nota: Tutti i passi evolumi qui indicate sono per un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti. Si raccomanda di processo non più di quattro dei dodici pozzetti alla volta per evitare un prosciugamento dei pozzi dopo l'aspirazione di qualsiasi liquido, che si tradurrà in un collasso delle microposts.
- Aspirare il terreno dal pozzo e lavare le cellule 2x con 1 ml di PBS-buffer. Assicurarsi di applicare una forza gentile durante il lavaggio con PBS per rimuovere i detriti cellulari che si sono accumulati sulla matrice micropost durante l'incubazione e di staccare le cellule morte.
- Fissare le cellule con 0,5 ml di 3,7% soluzione di formaldeide tamponata per 5 min.
- Sostituire la soluzione di formaldeide lavando i 2x matrice micropost con 1 ml di acqua deionizzata sterile.
- Macchiare le cellule con colorante (0,05% Coomassie Brilliant Blue a 50% di acqua, 40% di etanolo e 10% di acido acetico) per circa 90 sec. Lavare soluzione colorante in eccesso 2x con 1 ml di acqua deionizzata sterile. Aggiungere acqua deionizzata 1 ml di micropost array.
- Controllare risultato colorazione utilizzando un microscopio ottico. Ripetere tegli la colorazione passo, se il corpo cellulare è troppo debole per essere visualizzato.
- Array Conservare micropost con le cellule colorate sulla parte superiore in un frigorifero a 4 ° C. Assicurarsi di tenerli sotto l'acqua in ogni momento.
Imaging 3. cellulare
Nota: Passo 4 si applica solo ai microscopi senza corretto all'infinito ottica.
- Aggiungere 2 ml di acqua demineralizzata per una capsula di Petri con un fondo di vetro sottile per immagini ad alta risoluzione.
- Trasferire matrice micropost con un paio di pinzette nel piatto di imaging con le microposts rivolto verso l'alto.
- Porre la capsula Petri di imaging su una fase mobile di un microscopio ottico.
- Ruotare l'anello di compensazione della lente utilizzata per l'imaging finché il numero sulla scala rappresenta lo spessore totale di tutti i materiali lungo il percorso ottico per compensare la mancata corrispondenza indici di rifrazione del substrato di vetro, l'elastomero di silicone e il liquido sulla parte superiore. Ciò dovrebbe portare ad un aspetto brillante dei micropostscore.
- Chiudere il diaframma sul lato illuminazione fino al 50% e rimuovere eventuali anelli contrasto di fase dal percorso ottico consente un'innovativa modalità campo chiaro ordinario.
- Allineare la matrice micropost che i microposts formano una linea orizzontale attraverso il campo di osservazione. Definire un punto di partenza (ad esempio, in alto a sinistra) e spostare il piatto graduale Petri sul palco la scansione dell'array micropost durante l'assunzione di numerose immagini.
- Prendete tutte le immagini con l'impostazione di massima risoluzione per la telecamera con un obiettivo 20X o 40X. Lo scopo di avere una singola cella nel centro dell'immagine.
- Sweep lungo l'asse z attraverso il substrato fino a che le punte micropost sono a fuoco. Usare la multa volante fuoco sintonizzazione del microscopio e girarlo verso concentrandosi sul fondo micropost per circa 2-3 micron.
- Stabilire una procedura di imaging normale prendendo serie di immagini di prova di una sezione matrice spazzare attraverso i parametri di imaging uno alla volta (ad esempio, il tempo di esposizione,impostazione del diaframma, Impostazioni lampada ecc). Analizzare le immagini con MechProfiler e determinare un set di parametri adatto per un'analisi veloce e affidabile.
Analisi 4. Immagine con Software Open Source "MechProfiler"
Nota: tutte le funzioni del software possono essere attivate con un dispositivo di puntamento con il tasto sinistro del mouse. Tuttavia, un operatore esperto userà la scorciatoia documentate progettati per essere nella metà sinistra della tastiera per consentire una efficiente elaborazione delle immagini a due mani.
- Avviare l'analisi delle immagini software MechProfiler e aprire una serie di immagini che devono essere analizzati facendo clic su "Apri".
- Inserire tutti i parametri nella sezione "Impostazioni" proposta dal sviluppatore di software. Determinare i parametri che devono essere configurati personalizzati (cioè, la soglia di contorno e distanza minima) secondo le modalità descritte in dettaglio nel manuale del software.
- Analizzare immagines uno per uno per loro ritaglio per l'area di interesse usando "Crop" (fare clic e trascinare con il pulsante del mouse premuto). Fare doppio clic all'interno del rettangolo disegnato per completare questa azione.
- Marcatura ogni profilo cellulare visibile uno per uno cliccando su "Pareggio contorni cellulari" e utilizzare il cursore cross hair per il disegno comprese tutte microposts la cella è collegata.
- Eliminare le microposts indesiderate facendo clic su "Scartare Messaggi" e utilizzare il cursore cross hair per disegnare. Racchiudere tutti microposts che appartengono a una cella di fuori della sezione dell'immagine o che vengono deviati per qualsiasi altro motivo, ma non dalla cella di interesse.
- Avviare il sottoprogramma software "Trova Centroidi" con un clic del mouse. Regolare l'impostazione proprio accanto al pulsante "Cerca Centroidi" fino a quando vengono registrati tutti i microposts, che è visibile da una croce rossa nel loro centro filtro. Se l'impostazione del filtro è troppo basso microposts verranno ignorati, se è troppo alto muposizioni ltiple saranno contrassegnati per un singolo micropost. Mantenere l'impostazione costante nel corso di una sessione di analisi del filtro.
- Utilizzare la funzione di editing manuale "Modifica manuale" per i baricentri con più o mancati posizioni micropost. Utilizzare i capelli del mouse croce per selezionare la micropost in questione facendo clic e trascinandola attraverso. Fare doppio clic all'interno del rettangolo e posizionare l'indicatore rosso mancante nella sezione ingrandita, che si chiude automaticamente. Scarta una tale micropost se è al di fuori della struttura di cella disegnato (vedi punto 4.5) prima di procedere.
- Trova la griglia micropost ideale attivando la funzione "Crea Grid" con un clic del mouse. Assicurarsi che la posizione corrisponde con il vero capo micropost, dimostrato da un anello blu, all'interno della struttura di cella disegnato.
- Correggere qualsiasi produttore di griglia fuori luogo all'interno della cella dove necessario utilizzando la funzione corrispondente "Manuel Edit" con un clic del mouse. Utilizzare il mirino per selezionare il micropost in question cliccando e trascinando trasversalmente. Fare doppio clic all'interno del rettangolo che appare e posizionare il mancante indicatore blu nella sezione ingrandita, che si chiude automaticamente.
- Utilizzare il pulsante "Calcola flessioni" di clic del mouse per ottenere un istogramma dei valori di deflessione calcolati in base alla differenza tra la posizione di un micropost all'interno della sezione delle immagini e la griglia ideale generato.
- Salvare l'analisi completa comprese le tabelle di valori da un clic del mouse su "Salva".
- Continuare l'analisi delle immagini facendo clic su "Reset View" e analizzare un'altra sezione immagine o click del mouse su "Avanti Immagine", che comodamente può essere fatto con il tasto cursore della tastiera destra.
5. Analisi dei dati - Mechanoprofiling
- Aprire il file "Results.xls" con un programma di Office foglio dalla cartella con le immagini analizzate. Esso contiene i dati con altril valori calcolati tra cui tutte le deviazioni micropost e misure standard derivati quali il lavoro (ad esempio, energia substrato deformazione) da parte della cellula analizzata.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Il vantaggio principale della tecnica descritto risiede nella sua semplicità e potenziale di integrazione rapida ed efficace nel lavoro di laboratorio di routine. La combinazione di array di sensori commerciali di alta qualità abbinati a software open source fornisce informazioni sulla sensibilità meccano che altrimenti richiede l'accesso ai servizi camera bianca e una conoscenza approfondita di analisi di immagine e di sviluppo del software. La Figura 1 illustra il flusso di lavoro del metodo presentato. Si inizia con la preparazione e la semina cellule su matrice micropost. Dopo aver sistemato e colorazione delle cellule gli array micropost sono pronti per l'imaging. La parte centrale della tecnica è l'analisi dell'immagine utilizzando il software MechProfiler. Un utente può avviare analyszng immagini subito dopo aver inserito tutti i parametri rilevanti nelle "Impostazioni" dell'interfaccia grafica. La dimensione del pixel corrispondente è la lunghezza che è rappresentata da un singolo pixel e dipende configurazione dell'utente. Ha bisognoda stabilire separatamente per ogni ingrandimento utilizzato prendendo immagini di oggetti con dimensioni note. Un esempio è dato in figura complementare 9.
La qualità delle immagini è un fattore chiave in quanto influenza fortemente il processo di analisi. Al fine di ottenere la massima qualità bisogna assicurarsi di avere una piattaforma stabile e ordinariamente assistito immagini come mostrato in Figura 2. In particolare, l'allineamento della sorgente luminosa è importante come disallineamento provoca ombre indesiderabili che possono essere problematico quando si analizza il immagini. Inoltre, posizionando il microscopio ottico in cima ad un tavolo antivibrante o piastra è vantaggiosa nella maggior parte dei laboratori in quanto dà stabilità durante l'imaging.
I vantaggi di utilizzare un fondo capsula di Petri di vetro sottile per l'imaging sono superiori efficaci valori di apertura numerici che si traduce in immagini più brillanti con una maggiore risoluzione.
Quando taking le immagini in modalità campo chiaro un 50% di diaframma chiuso si raccomanda, come concentrandosi sulle punte microposts è facilitato a causa delle circonferenze che appaiono come un anello scuro croccante. Inoltre, nel caso l'obiettivo utilizzato ha un anello di compensazione, è essenziale impostare correttamente per ottenere letture precise forza. L'impatto di tale caratteristica può essere visto confrontando Figure 3A e 3B Figura. Immagini che può essere rapidamente analizzati vengono raggiunti combinando la corretta impostazione dell'anello di compensazione unitamente illuminazione ottimale come mostrato in Figura 3C. Forte contrasto tra un micropost ei suoi dintorni riduce il tempo di analisi in quanto accelera l'algoritmo di ricerca. Gli utenti scopriranno che solo l'esperienza minima è necessaria per ottenere immagini che possono essere analizzati con facilità.
È importante sottolineare che i protocolli di cui sopra a superare un ostacolo importante e comune a rapida ed efficace integrazione degli array micropost nella routinelavoro di laboratorio. Questo ostacolo deriva dalla necessità di controllare la qualità array - una richiesta che è realizzabile solo caratterizzazione completa e dettagliata del sensore riproducibilità, sensibilità e precisione. Tuttavia, ruotando ad array micropost disponibili commercialmente questo ostacolo considerevole è completamente evitata. Figure 4A e 4B illustrano la precisione di tale matrice micropost. La deviazione della posizione microposts è ben al di sotto di 200 nm e come tale paragonabile a un "errore di pixel" che accompagna la fotocamera / obiettivo combinazione che ha portato in una dimensione di pixel di 82 nm per la configurazione utilizzata. L'analisi delle immagini con le cellule deviatori microposts dimostra che i valori per una deflessione cellule imposto sono sostanzialmente superiori a 200 nm (come mostrato nella Figura 4C e 4D Figura) che conduce a un segnale comodo da rumore.
Figura 5 illustrates i diversi tipi di presenze microposts all'interno di un'immagine a seconda se è deviata o no. Come accennato in precedenza microposts non deviato avere un aspetto luminoso circolare con un anello scuro intorno a loro. La loro posizione può essere determinata utilizzando una trasformazione di Hough, che è una tecnica estrazione di caratteristiche per l'analisi di immagine digitale.
Inoltre, dimostra che microposts deviati su un microscopio invertito mostrano due di fronte a forme di mezzaluna scuro (vedi figura 5A). In un microscopio verticale del bordo della punta micropost ed una mezzaluna scura sono correttamente visibili mentre il secondo diventa difficile da rilevare. Queste caratteristiche sono la base per il calcolo delle posizioni delle immagini al microscopio in campo chiaro delle punte da microposts deviati, che è stato sviluppato per questo protocollo ed è stato nominato "Contorno Approach".
Figura 5B è un esempio di un tumore osseo HuO9cellule su microposts impressi su un microscopio invertito (in alto). La versione analizzato di che immagine mostra i risultati del metodo contorno applicato (in basso). Figura 5C è stata presa utilizzando la stessa matrice micropost con un microscopio in posizione verticale (in alto). Anche la versione analizzato mostra i risultati di utilizzare il metodo contorno.
Ogni sessione di analisi delle immagini inizia con una verifica dell'utente dei parametri nella sezione "Impostazioni" del MechProfiler. Alcuni sono dati dal costruttore micropost come micropost dimensioni di matrice e costante della molla. Altri sono definiti dall'utente, come i valori per la soglia di contorno e una minima soglia di deviazione secondo le procedure descritte nel manuale del software. Tuttavia, è importante notare che questi valori dovrebbero essere scelti con attenzione e devono essere costanti per tutte le immagini all'interno di una serie di immagini interconnessi per garantire la comparabilità. Considerando che le fasi di pre-elaborazione per la analysi immagines, come il ritaglio, sono auto-spiegando le strategie sottostanti per le funzioni software come "trovare Centroidi", "Genera Grid" e il "profilo di accostamento" bisogno di spiegazioni più dettagliate.
Rilevamento algoritmico di posizione micropost default (come consegnato dal costruttore) inizia utilizzando la funzione software "Trovare centroidi". L'algoritmo inizia nell'angolo in alto a sinistra di un'immagine ricerca della prima micropost. Successivamente tutti gli altri microposts si trovano sulla base delle coordinate di tale primo micropost più i valori per la dimensione della griglia e micropost proposta dal costruttore seguendo la geometria esagonale. Il baricentro per ogni micropost trovato è calcolato utilizzando una trasformazione Hough. Il cursore del filtro accanto al pulsante di comando della GUI consente di regolare la sensibilità di questa trasformazione. Tutti microposts trovati sono contrassegnati da una croce rossa e le loro posizioni noti per la doprocessi bsequent.
Successivamente, la funzione "Genera Griglia" porta a le coordinate di tutti i suggerimenti microposts. Sono i risultati di un processo multi-step. In primo luogo una funzione di ottimizzazione è risolto comprese le posizioni iniziali dell'algoritmo prima eseguito "Trova centroidi" per stabilire la griglia ideale. Secondo le posizioni dei microposts all'interno della cella sono calcolati. Microposts con meno di deflessione definito nel parametro impostazione "Soglia minima deviazione" rispetto alla griglia ideale sono trattati con una trasformazione Hugh. Tutte le altre posizioni di punta micropost sono calcolati secondo il metodo sopra descritto per contorno microposts deviati. Qui il software inizia la ricerca dal centroide iniziale dal centro cella per un bordo circolare (chiaro a scuro) entro un angolo di 15 ° (vedi figura 5A). Una volta che il bordo si trova un cerchio con il dato diametro micropost è montato a tbordo cappello con il valore di soglia contorno dalle impostazioni nella GUI. Questo parametro determina quale valore di grigio del pixel viene utilizzato per il processo di montaggio. Più alto è questo valore è più il raccordo si appoggia verso il centro micropost brillante è il più basso che il valore più si adatta quel cerchio alla più scura micropost contorno. Una volta scelto questo valore deve rimanere costante per tutte le analisi di immagini all'interno di un dato studio per evitare di aggiungere deviazione artificiale o chiamando deviazioni troppo conservativo.
Ad esempio, la Figura 6 illustra l'importanza di decidere un valore di soglia di contorno appropriato. Il software permette all'utente di scegliere per una vasta gamma (da 0,1 a 0,9) per comprendere tutti fisicamente possibili situazioni di illuminazione. La traduzione della informazioni ottiche in distanze deflessione fornite per entrambi gli estremi e un valore più pratico nel mezzo sono indicate nella figura 6B. Tuttavia, gli utenti di software addestrati spesso convergendoe per valori di soglia di contorno molto simili, portando a risultati comparabili come si può vedere nella Figura 6C. Inoltre, utilizzando procedure standardizzate per la colorazione delle cellule e l'imaging riduce al minimo il rischio di valori di soglia di contorno non validi, che in genere dovrebbe rimanere costante all'interno di insiemi correlati delle immagini.
Al fine di dimostrare la robustezza del metodo una selezione di risultati-meccano profiling sono riassunti nella figura 7. Nella figura 7A due risultati da cellule tumorali dell'osso HuO9 e due da M132 sono confrontati. Tutti e quattro gli array sono dallo stesso lotto di produzione e quindi hanno identiche caratteristiche meccaniche. L'analisi è stata eseguita con un insieme fisso di parametri per la deviazione minima (0,25 micron) e per la soglia di contorno (0,125). Inoltre, due serie identiche di immagini da SaOS cancro 2 ossa sono stati dati a due analisti, senza ulteriori informazioni sulle impostazioni dei parametri (vedi Figura 7B). L'influenza della colorazione sull'analisi stato testato prendendo immagini di cellule tumorali colorate con Coomassie osso blu R. Successivamente il colorante è stato rimosso. Dopo ri-colorazione con Coomassie Blu G una seconda serie di immagini è stata presa. Figura 7C illustra i risultati di entrambe le serie, che sono state analizzate dallo stesso utente con valori identici per la deflessione minima (0,25 micron) e la soglia di contorno (0,25) .
Un tipico esempio di applicazione meccano-profiling è presentato in Figura 8A, in cui i dati compilati è presentato per le linee di cellule di cancro osseo HuO9 e M132 dopo aver analizzato 151 cellule raccolti da ciascuno dei quattro array. In questa panoramica tutti i valori degli indicatori sono più alti per HuO9 che per M132 già indicare che le cellule HuO9 applicano più forza del M132. Tuttavia, i dati dall'analisi immagine contiene una grande quantità di informazioni supplementari singola cellula che può essere estratto per comprendere meglio phenotypic comportamento linea cellulare e la variabilità cellula-cellula all'interno di una data linea. Presentando i risultati per la forza per micropost in diagramma a riquadri si scopre che, nonostante minimi e massimi simile, i valori dei dati sono diversamente distribuiti e in effetti la linea di basso di cellule metastatico delle cellule HuO9 tendono ad applicare più forza che la linea M132 altamente metastatico (vedi Figura 8B). Inoltre, qualificando i valori di forza rispetto all'area della cella si trova che la forza media per cella non solo è elevata per le cellule HuO9 rispetto al M132, ma anche che la forza media aumenta micropost come le cellule si diffuse fino a forza Media per messaggio raggiunge un valore più stabile (come si può vedere nella Figura 8C). Inoltre per le cellule che coprono sette microposts i valori sono quasi identiche, che è probabilmente dovuto al fatto che in genere appaiono in forma esagonale con una centrale non deviato micropost indipendentemente dalla linea cellulare. Oltre al differenze della contrattilità, differenze morfologiche possono essere quantificati con risultato interessante. Per esempio, in contrasto con le cellule M132 altamente metastatiche c'erano poche cellule HuO9 che coprivano solo tre microposts. Altri confronti morfologiche tra le linee cellulari possono essere effettuati, compresa la distribuzione di area di cella rappresentata dal numero di microposts coperti. Figura 8D mostra che le due linee di cellule differiscono anche comportamento dinamico diffusione quando cresce in cima microposts. In breve, il mechanoprofile per la linea cellulare parentale HuO9 rivela che in genere coprono zona e applicare un po 'più forza per microposts mentre la linea cellulare metastatica M132, una cellula aggressivo che deriva da HuO9, copre tipicamente meno microposts e vale meno forza per micropost . Questi risultati dimostrano il potenziale di un approccio basato TFM per applicazioni discriminatorie.
Figura 2. Impostazione Imaging. Un microscopio invertito standard è utilizzato per l'imaging delle celle sugli array micropost. L'installazione contiene anche una fotocamera microscopio e il suo controllore, che può anche fornire funzioni di archiviazione dei dati. L'ampio schermo mostrata non è essenziale, ma comunque è comodo per l'imaging estesasessioni. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Linee guida per l'imaging micropost. (A) Immagine di cellule colorate su un array di micropost scattata con un obiettivo 40X in modalità campo chiaro. Microposts non deviati appaiono anelli scuri quando immaginata. Messaggi deviato assumono una forma ellittica con entrambe le sub regioni più scure e più luminose. Cellule colorate che coprono microposts li fa apparire ancora più scuro, al punto che non vi è alcun contrasto tra micropost e la cella. (B) immagini identiche scattate dopo aver regolato l'anello di compensazione obiettivo e ri-messa a fuoco. Qui le anime dei microposts diventano sostanzialmente più luminoso e dare più contrasto. (C) La stessa posizione ripreso dopo adjusting tutti i parametri di illuminazione con il controller della fotocamera. I microposts liberamente in piedi sono visualizzati come cerchi luminosi con un anello scuro. Microposts deviato mostrano una "ombra" luna mezzo distinto intorno al nucleo ansa lungo l'asse di trazione. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.>
Figura 4. MechProfiler screenshot per microposts analizzati. (A) Un tipico esempio di un vuoto matrice micropost si può vedere in questo screenshot. Le microposts sono disposti in una struttura esagonale costante. (B) L'istogramma con le deformazioni per questi microposts mostra che tutti i valori sono al di sotto di 200 nm. (C) Esempio tipico per una copertura di cellule cancro alle ossa HuO9e tirando su più microposts. Si può notare che la quantità di trazione è eterogenea. (D) L'istogramma con i valori di deflessione per la cella HuO9 mostra l'ampio spettro di deviazioni che nasce dalla interazione delle cellule con il substrato micropost. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 5. micropost apparizioni in illuminazione campo chiaro e le strategie per il calcolo della loro posizione all'interno di un'immagine. (A) microposts per non deviato appare come un'area circolare luminosa con un anello esterno scuro. Il baricentro è calcolato da una trasformazione Hough. Microposts deviati mostrano forme a mezzaluna scure. A seconda della configurazione del microscopio se i microposts affacciano sul ligh fonte t (ad esempio, microscopio invertito) ci sono due forme ben visibili mezzaluna. Se i microposts affrontano la lente (ad esempio, microscopio verticale) solo una mezza luna è ben visibile, ma anche al limite della punta. In entrambi i casi l'approccio contorno dovrebbe essere utilizzato per calcolare la punta micropost. (B) Un'immagine originale (in alto) con un microscopio invertito da una cellula tumorale ossea HuO9 e la sua versione analizzato (basso) utilizzando l'approccio contorno. (C) l'immagine originale dalla stessa matrice micropost (top) utilizzando un microscopio verticale e la versione analizzato, ancora applicando l'approccio contorno (inferiore) ma con un valore molto più basso profilo soglia più adatto per chiamare il bordo a forma di anello scuro. Favore clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
caricare / 53350 / 53350fig6.jpg "/>
Figura 6. L'approccio contorno e scegliendo il valore di soglia appropriata. (A) I tre screenshot illustrano le stesse microposts analizzati utilizzando tre diversi valori di soglia contorno. Se il valore è impostato troppo basso (a sinistra) o troppo alto (a destra) che il software si adatta l'anello blu che rappresenta la testa micropost in modo non corretto. Si sottovaluta o overshoot la vera posizione della testa micropost. Un valore di soglia scelto correttamente consente al software di adattarsi l'anello blu per la forma di zona scura all'interno del micropost che si forma attraverso la deflessione mezza luna. (B) Il grafico mostra la quantità media di deformazione dipende dalla soglia di contorno scelto per le microposts mostrate sopra. Esso illustra anche che i valori per i microposts fuori della struttura di cella non vengono influenzati dal raccordo contorno non viene applicato alcun. (C) Il grafico illustra che la sceltaun valore di soglia all'interno di un intervallo moderata minimalizes il rischio di sovra o sottovalutare le deformazioni micropost. La differenza tra i valori scelti da diversi utenti qualificati è normalmente inferiore a 0,05, che si traduce in differenze accettabili dei valori medi di deflessione. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 7. Test Robustezza per meccano profilo i risultati di diverse linee di cellule di cancro delle ossa; le barre di errore rappresentano una deviazione standard (A) meccano-profiling risultati di quattro matrici micropost identici dopo la semina cellule HuO9 su array 1 e M132 su array di 3 -. Quattro giorni dopo la semina HuO9 su array 2 e M132 su array 4. (B) Il confronto dei risultati delle mEchano-profiling basata su serie identiche di immagini dopo analisi da due analisti indipendenti. (C) Confronto dei risultati di analisi di immagine da due diverse serie di immagini prima presa dopo colorazione con Coomassie blu R e la seconda dopo la completa rimozione di colorante e ri-colorazione con Coomassie blu G. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura .>
Figura 8. meccano-profiling di linee cellulari di cancro osseo. (A) Il confronto tra la linee cellulari di cancro di due ossa HuO9 (basso potenziale metastatico) e M132 (altamente metastatico) grafico indica che tutti i valori degli indicatori sono più elevati per la linea cellulare HuO9 ( totale N = 302; due serie indipendenti di esperimenti, errori bar = deviazione standard). (B Trong>) La trama riquadro illustra che le forze applicate per micropost sono nella gamma nano-Newton inferiore. Tuttavia, le cellule HuO9 tirano più di cellule M132 (Whiskers rappresentino il minimo dei dati e massima). (C) Un risultato simile può essere visto confrontando cellule che rivestono lo stesso numero di microposts. Cella HuO9 applicare più forza rispetto alle cellule M132. Il numero di cellule HuO9 coprono tre microposts non è rappresentativo e incluso solo per completezza (barra di errore = deviazione standard). (D) Le varie distribuzioni attraverso il numero di coperti microposts dimostrare che ogni linea di cellule di cancro osseo ha una propria caratteristica di diffusione quando si interagisce con gli array micropost. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
ppfig9.jpg "/>
Figura supplementare 9. La dimensione dei pixel per una messa a punto microscopio è in genere determinato utilizzando uno speciale vetrino da microscopio con una barra di scala su di esso; in alternativa, il layout matrice micropost, proposta dal costruttore può essere utilizzato. Ad esempio, 15 unità con 13 micron (195 micron di lunghezza totale) diviso per 2.375 pixel (stabiliti con uno strumento di elaborazione delle immagini) porta a 0,082 micron / pxl. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 10. Confronto tra le immagini di una cellula tumorale osso HuO9 preso dalla stessa posizione utilizzando due tecniche di illuminazione su un microscopio invertito; DIO macchiato microposts sono verde fluorescente. (A modalità campo chiaro. (B) ha analizzato i Mage preso dopo il passaggio al canale fluorescenza verde senza rifocalizzazione. (C) immagine di fluorescenza secondo dopo aver corretto la messa a fuoco per le punte molto micropost. (D) Sovrapposizione di entrambi i canali di illuminazione per fini illustrativi. (E) meccano-profiling indicatori come risulta dalle tre immagini. Nonostante la correzione del fuoco il valore di fondo non può essere stimata dalle immagini a fluorescenza. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Fi supplementarifigura 11. Sequenza Immagine della stessa posizione di microposts macchiati fluorescenza utilizzando DII su un microscopio in posizione verticale (A) Immagine chiara campo.; ci sono tre microposts toccano alla punta. (B) stessa posizione dopo il passaggio al canale fluorescente leggermente sopra le teste dei microposts. (C) Abbassamento del piano focale fino alla punta delle microposts. (DE) immagini consecutive dopo abbassando ulteriormente il piano graduale focale verso il basso le microposts. (F) L'immagine delle microposts dopo l'abbassamento del piano focale all'interno del substrato elastomero siliconico. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura complementare 12. Schermata della MechProfiler GUI. Risultato dell'analisi tipica dalla profilazione una cellula tumorale ossea HuO9. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Questo lavoro si propone di avanzare il campo della microscopia a forza di trazione da una consistente riduzione delle barriere tecniche e pratiche all'ingresso. Queste barriere provengono da due lati. In primo luogo sono le numerose sfide tecniche non banali che devono essere superati per la produzione riproducibile e commissionare una matrice micropost sperimentalmente. In secondo luogo, è similmente non banale necessità di una affidabile analisi semiautomatico delle forze monocellulari - tenendo presente che un tipico esperimento può richiedere l'analisi di centinaia o migliaia di cellule. Le tecniche sopra descritte sono state sviluppate per rendere micropost basato microscopia a forza di trazione accessibile nei laboratori di biologia cellulare che non hanno competenze di ingegneria residente. I sensori e le tecniche di analisi presentate in questo articolo dovrebbero permettere ai non esperti di analizzare rapidamente e con precisione le forze esercitate da singole cellule.
A parte l'accesso a un biologia cellulare lab con almeno un microscopio campo chiaro mid-grade, i metodi descritti richiede pochi elementi tecnici aggiuntivi. Qui la maggior parte degli utenti possono eseguire esperimenti di forza di trazione di microscopia valide anche con limitata esperienza, nonostante la potenza e la versatilità della tecnica. Tuttavia vi sono tre aspetti critici nel protocollo presentato che deve essere considerato. In primo luogo è necessario garantire che gli array micropost siano sempre coperti con liquido per evitare il collasso a causa di forze capillari. In secondo luogo si ha la necessità di ottimizzare i parametri di imaging per le immagini acquisite micropost, che è meglio farlo prendendo una serie di immagini della stessa posizione di matrice pur variando il tempo di esposizione, apertura del diaframma, e la posizione dell'anello di compensazione. È importante trovare il piano focale corretto per la punta micropost, e questo aspetto vuole qualche esperienza data la piccola profondità dimensionale dei array di sensori. Terzo uno deve scaricare il software di analisi di immagine MechProfiler discusse apertamente accessibiled qui, per il quale un dettagliato manuale d'uso e di formazione esempi sono disponibili nel sito di download. Dopo qualche esperienza con il software per analizzare esempi forniti con il manuale, l'utente dovrebbe prendere immagini di test sulla configurazione di imaging da utilizzare in modo da configurare le impostazioni microscopio adeguate. Sulla base delle immagini ottenute, il valore di soglia di contorno dovrebbe essere ottimizzato in modo simile. Una singola immagine micropost può essere analizzato da un utente esperto in un minuto utilizzando il software MechProfiler open-source indipendentemente dal fatto che contiene una o più celle, consentendo la generazione di risultati statisticamente rilevanti (analisi di diverse centinaia di cellule) entro poche ore .
Un altro aspetto che richiede una certa sintonia è l'ottimizzazione di qualsiasi procedura di colorazione delle cellule applicata. Quando le cellule sono eccessivamente macchiati il software può non registrare le posizioni micropost corrette. D'altra parte se la colorazione è troppo debole richiede più sforzo da parte dell'utente per rilevare un"True" struttura di cella come protrusioni cellulari sottili può essere mancato.
Tuttavia, applicando un protocollo fisso di colorazione della cellula e di imaging matrice procedura nell'intervallo per questo errore diventa accettabilmente basso. Durante questo lavoro diverse procedure di colorazione delle cellule sono stati testati, basata su varie concentrazioni di cristalvioletto, presenza di tensioattivi come Tween 20 o Triton-X, o una combinazione di coloranti aggiungendo eosina. Tuttavia, l'intensità della colorazione e la sua stabilità varia sostanzialmente da esperimento per esperimento. Solo l'uso di Brilliant Blue G come descritto sopra mostrato un robustezza colorazione della cellula accettabile combinato con intensità sufficiente per vedere ancora la struttura di cella sottile ma senza interferire con l'approccio sviluppato contorno.
In generale, ci sono opzioni per modificare la tecnica presentata. Per esempio combinando le tecniche in campo chiaro qui presentati con microscopia a fluorescenza organelli colorazionecome il nucleo o la rete actina filamento, che può fornire ulteriori informazioni sui processi cellulari sottostanti nel contesto della meccanica delle cellule. Inoltre, utilizzando carboxycyanines dialchilici a catena lunga (DII o DIO) i microposts diventano fluorescenti. 14 Tuttavia, è importante controllare ogni deviazione dalla tecnica presentata. Le figure complementari 10 e Figura 11 mostrano potenziali insidie. Le immagini scattate di un cellulare di fibroblasti NIH 3T3 Coomassie Blu G macchiato nel canale di fluorescenza verde (Figura 10B e 10C) utilizzando il microscopio invertito presentano i principali organi micropost ma non le loro punte che portano a una difettosa analisi della posizione (Figura 10E). Nonostante il massimo sforzo per rimettere a fuoco dopo il passaggio dalla modalità in campo chiaro (Figura 10A) le punte micropost non possono essere esposte, che potrebbe essere dovuto all'assorbimento del segnale di fluorescenza dalla macchia cellulare. Questo è in contrasto con imaGES scattate con il canale di fluorescenza gialla di un microscopio verticale (Figura 11B-11F) in cui più immagini nitide possono essere ottenere lungo l'asse z. Qui l'utente deve garantire che l'immagine è presa con il piano focale sulla punta (Figura 11C) e non un posto più vicino alla parte inferiore micropost di evitare di chiamare deformazioni difettosi.
Va notato che esistono anche limitazioni tecniche per saggi micropost. Per esempio, la precisione di una deviazione rilevata dipende dalla qualità della configurazione ottica. Microscopi sono spesso ottimizzati per l'imaging di fluorescenza in cui la sensibilità alla luce della telecamera collegata ha una priorità maggiore di un gran numero di pixel. Naturalmente, questo porta a immagini con una dimensione del pixel più grande. Inoltre, va notato che le immagini in campo chiaro non può determinare se protrusioni cellulari raggiungono il fondo substrato. Tuttavia, le matrici micropost commerciali sono stati testati utilizzando confocalemicroscopia. Si è constatato che le cellule sembrano accettare il rivestimento binario che promuove l'adesione solo sulle punte micropost e non per il resto della matrice micropost. Un altro fattore deriva dall'errore posizionale dell'array micropost, che ha dimostrato di essere di 0,2 micron. Insieme con il dato costante della molla di 2,8 nN / micron questo porta ad un errore in vigore lettura di 0,6 nN. Un altro vincolo per saggi micropost deriva dal fatto che le forze applicate dalla microposts condivisi da più celle non possono essere determinati. Pertanto, solo isolate cellule singole possono essere analizzati. Una limitazione specifica per il protocollo presentato deriva dalla corretta applicazione dell'approccio contorno sensibile, che richiede una certa quantità di formazione per l'utente al fine di ottenere risultati affidabili. Inoltre, per un'analisi più veloce l'utente dovrebbe prendere immagini in cui l'array micropost è allineato in modo da formare un orizzontale o una linea verticale lungo il bordo del campo di osservazione. Despite il fatto che l'algoritmo software per la ricerca microposts entro una geometria griglia esagonale non è limitato da un angolo di rotazione l'imaging del microposts più di 5 ° fuori asse rendono difficile ritagliare ad una sezione di immagine senza contenente microposts incomplete, che poi porta a un difetto della funzione "Generate Grid". In tal caso, l'utente può utilizzare la funzione di rotazione integrato prima di iniziare ad analizzare le posizioni micropost.
Il metodo descritto è stato applicato principalmente per caratterizzare due linee di cellule di cancro delle ossa, una linea cellulare parentale chiamato HuO9, e un derivato della linea altamente metastatico denominato M132. In questo contesto sono state scattate più di seicento immagini unicellulari in modalità campo chiaro e analizzati utilizzando il software MechProfiler. I dati successivi mining ha rivelato che la linea cellulare parentale HuO9 esercita un po 'più forza e copre in genere più microposts per cella rispetto alle cellule della linea cellulare metastatica M132. Tuttavia le cellulenon sono stati sincronizzati e quindi in diverse fasi del ciclo cellulare al momento del fissaggio, che probabilmente contribuito alla vasta gamma di risultati. Prendendo immagini cellule vive per periodi di tempo fino a 24 ore, si è constatato che dopo la diffusione molte cellule rimangono al loro posizione iniziale, mentre altri emigrano, diffusione, scollegare e migrano di nuovo con diverse velocità (vedi video supplementari). Ciò indica che il profilo meccanico di una cella non è spesso costante e può variare notevolmente in una popolazione di cellule o anche all'interno di una singola cella a seconda della sua attività corrente. Un altro fattore che potrebbe essere su un array micropost una cella è costretto ad eseguire i passaggi di migrazione discreti per raggiungere un altro micropost, che è in contrasto con classico TFM, dove le cellule aderiscono a superfici piane e possono migrare con gradini minute. Tuttavia, al fine di analizzare questi piccoli passi è necessario prendere immagini fluorescenti di punti di adesione focale, che richiede l'accesso a m molto avanzatoicroscopes e molto elaborata software di analisi dell'immagine. Tuttavia, la distribuzione di profili meccanici all'interno popolazioni più spesso è ancora una caratteristica di una linea cellulare. Così un metodo ad alta produttività che consente la caratterizzazione di un gran numero di cellule è essenziale. Il processo di imaging manuale e software open-access qui presentata porti un grande potenziale per la scalatura a sistemi completamente automatici microscopio.
In sintesi un approccio forza di trazione microscopia robusto è presentato che è prontamente adottabile in un laboratorio standard di biologia cellulare. L'intero flusso di lavoro dalla semina cellulare per l'analisi delle immagini è semplice ed efficace. Mentre i protocolli descritti qui sono perfettamente funzionanti, i miglioramenti sono in corso per adeguare gli algoritmi di analisi per essere in grado di gestire anche le matrici micropost con layout ortogonali e procedure in via di sviluppo che semplificano l'analisi di sequenze di immagini dal vivo imaging cellulare. In un contesto con i risultati li cellule cancro alle ossanes, gli approcci descritti possono essere utilizzati per le cellule dello schermo da biopsie clinici al fine di stabilire se tali test possono tenere valore prognostico, consentendo ai medici di predire il potenziale metastatico delle cellule biopsiati da pazienti di cancro osseo. Tale prova potrebbe influenzare le strategie terapeutiche. Altre potenziali applicazioni riguardano i composti farmacologicamente attivi test su cellule meccanicamente attive come le cellule muscolari lisce o cardiomiociti, potenzialmente per aiutare a stabilire l'efficacia o la tossicità di un farmaco.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm |
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
- Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
- Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
- Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
- Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
- Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
- Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
- Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
- Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
- Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
- Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
- Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311 (2007).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
- Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).
