Introduction
メカノ敏感な細胞ベースのアッセイは、メカニックが細胞生物学でプレーすることができます中心的な役割を反映して、幅広いアプリケーションで、接着細胞を調査することを可能にします。これらのアプリケーションは、多くの場合、細胞内プロセスまたは全細胞の挙動を駆動機序に焦点を当てています。一方、このような細胞外マトリックス組成物またはマトリックスの剛性などの外部環境要因が劇的に細胞の機械的および生物学的応答に影響を与えることができる。1同様の薬学的に活性な化合物の多くのクラスの使用後に観察することが可能である効果がそれらの多くの場合、細胞培養モデルを用いて特徴づけ、そのような自発的または実験的に誘導され、遺伝子の突然変異によって引き起こされるもののような一方の遺伝子型の性質上2を 、細胞骨格の構造および機能の変化と関連している細胞の表現型の著しい変化を誘導することができる。3これらの実施例は、あります多くの可能なのほんの一部トピックれる細胞の機械的な表現型が関連しており、これらの全てが有用マイクロポストのアレイで検討されています。
この記事の執筆時点では、約200の記事は、細胞マイクロポストの相互作用を記述する公開されています。これらの作品は、マイクロポスト偏向原則の理論的側面だけでなく、その製造上の実際的な手順について説明します。細胞や柔軟なマイクロポストアレイの相互作用を記述した最初の記事は、連続する軟質基板はnanonewton規模細胞収縮、タンらを推定するために使用されている古典的な牽引力顕微鏡（TFM）とは対照的に、2003年4タンらによって発表されました。シリコーンエラストマー製の複数の近接した垂直方向のビームを使用する方法を記載しています。この技術の主な利点は、2つの主要な特徴から出てきます。維持しつつ、第1セル見かけ基板の剛性を変更するために、1つは、マイクロポストの寸法を変更する必要がありますそれ以外の場合は一定のため、表面トポロジーと化学の違いを回避基質組成物。第二マイクロポストは、離散的に個々の焦点接着のために力と空間分解能で分析することができ、標準的なTFMにより類似の分析に固有の分析の課題を減らすことができ、個々のバネのように作用します。
今日マイクロポストアレイの適用範囲が大幅にいくつかの単一細胞のための力のほんのマッピングを超えています。たとえば、秋山は、昆虫の筋肉のパワーで動く自律マイクロロボットを開発するために、マイクロポストアレイ用アクチュエータとして蛾の毛虫から分離された背側の血管組織の使用を報告している。5
しかし、マイクロポストのほとんど公開された出願は、感染症や癌のような医学的状態の研究に焦点を当てています。例えば、マイクロポストアレイは、ナイセリアgonorrhのバンドルIV型線毛の力発生を研究するために使用されています感染を増強するシグナルカスケードに関連しているOEAコロニー6その他の細胞骨格を標的とする医薬化合物で処理された乳癌細胞を研究するためにマイクロポストを使用している。7
マイクロポストのたわみは、多くの場合、細胞のみをマイクロポストの非常に先端に取り付けられていると仮定すると、エンド負荷のカンチレバーのための古典的なビーム理論を用いて説明します。たわみδが発生する 。ここで適用される力 F は、マイクロポストの「曲げ剛性」Kに依存して計算され：
（1）
Eと、I、およびLは、ヤング率が、それぞれ慣性ビーム長の面積モーメントです。ビームは剪断および曲げだけでなく、基板の反りがACに入れないので、この式の結果は、仕事だけで力の一般的な近似を与えますカウント。マイクロポストは、典型的には、ポリジメチルシロキサン（PDMS）のような軟質材料から作られていることを考慮すると、シリコーンゴムをベースこれらの要因が含まれる必要があります。 。シェーンらは、マイクロポストのアスペクト比（L / D）と、対応するポリマーのポアソン比 Vに基づいて、そのような補正係数があることを実証した8これは、で与えられます。
（2）
T チルト（v）は 、同じ記事で見つけることができるようにフィッティングパラメータa = 1.3が含まれて傾斜係数であることで：
（3）
それがマイクロポストの補正後の剛性 k CORRは、純粋な曲げ剛性 k = k個の曲がり補正係数CORRの製品であることを意味しますで与えられます：
（4）
したがって、細胞力の計算は、現在読んで、式（1）の、より洗練された変化を使用して実行されるべきです。
（5）
補正の影響はすぐにマイクロポストの大きさの標準値が使用されているように、より明白になります。例えば、円形の断面とPDMSベースのシリコーンゴム製の5ミクロンの直径15ミクロン、長マイクロポストは、0.77の補正係数をもたらし、したがって、未補正の計算は、23％によって及ぼされる細胞力を過大評価するであろう。これは、より小さなアスペクト比を有するマイクロポストのためにさらに深刻になります。
伝統的には、マイクロポストの画像分析は、理想的なビーム曲げ理論に基づいています。 2005年にMICRの使用を開拓グループOPOSTアレイは、マイクロポスト解析に適した画像解析ソフトウェアを発表した9ソフトウェアは、ソフトウェアライセンスを必要とし、ユーザーはそれぞれの位置のための3つの画像を取る必要があります。送信モードと染色された細胞で蛍光モードで別の1でマイクロポストの上部と下部の平面から一つずつ。それぞれに上部と下部の位置を比較した後、ソフトウェアが力のベクトル場を決定し、ポストあたりの力のような関連パラメータを計算するマイクロポスト。他のソフトウェア・パッケージが存在し、彼らの分析の原則を簡単にそれらを記述し、対応する記事に記載されているが、これらの解析ソフトウェアパッケージは、一般公開されていません。10,11
マッピングセル力のために設計されマイクロポストのアレイは、全ての隣接マイクロポストの間に等距離ギャップの利点を有する後者の直交マイクロポストのレイアウトや六角形一つであることのいずれかに分類することができます。典型的なマイクロポストヘクタール円形断面をまし、それらの寸法は、長さ50μmの直径及び2に1.0ミクロンから10ミクロンの範囲にある。4しかし、楕円形または正方形の断面を有するマイクロポストも報告されている。12,13
マイクロポスト材料としてPDMSベースのシリコーン混合物の使用は、混合物中にナノ粒子を添加することが可能になります。例えばコバルトナノロッドを追加すると、マイクロポストの磁気活性化を可能にし、したがって、潜在的な実験デザインに別の自由度を与える。14ほとんどのグループは、カバーガラスのような、またはペトリ皿の内側のフラットリジッド基板上でのマイクロポストアレイを生成します。しかし、マンと共同研究者は最近、伸縮性膜上に形成されたマイクロポストの配列を報告した。15これは、細胞収縮性の点で生細胞の細胞内の動的応答を勉強しながら、セルのアプリケーションは接着細胞に力を伸ばしことができます。
広く使用されている最もESTABSU8フォトレジストを用いてシリコンウエハの上に微細構造を生成するために使用される短い標準クリーンルーム工程においてシニァデツキら。16-18の洞察に満ちたプロトコールに記載されているようにマイクロポストのアレイを作製するためのプロセスがlishedソフトリソグラフィーに基づくものです。これは、シリコーンゴムを金型にそれらを移送構造体上にキャストされたコピー処理が続きます。第二段階では、これらの型は、選択された基板の上にシリコンゴムを使用して初期の微細構造を複製するために使用されます。しかし、彼らのアプリケーションに関連する出版物の大規模で増えているにもかかわらず、マイクロポストの製造プロセスを確立することはあっても、マイクロエンジニアリングの専門家のためにかなりの時間がかかります。許容可能な品質レベルを得るために、特定のラボ環境とマイクロポストレイアウトに最適化と適応を必要とする多くの処理工程があります。
市販のマイクロポストアレイは準備ができて-Tで使用できるようになりました一貫して高品質のO-使用（「既製」）形式。そのため彼らは、オンサイト生産に必要な複雑かつ長時間の製造プロセスに代わるもの。この論文では、市販のマイクロポストのアレイは、単一の明視野顕微鏡画像を用いて、細胞の力をマッピングするために使用しました。さらに重要なのは、この資料では、この原稿の副教材としてダウンロードすることができますMechProfilerという名前のフル機能のオープンソース・ソフトウェアを、説明し、文書化します。ソフトウェアの活発にメンテナンスバージョンもhttp://www.orthobiomech.ethz.chで見つけることができます。
「既製」アッセイと互換性のあるオープンソースの解析ソフトウェアの組み合わせは、著しく正確なTFM実験を達成するために、エントリハードルを下げます。クリーンルーム施設やソフトウェア開発の専門知識のいずれかを利用できない研究者が成功した細胞の力を分析することができます。これはmechanosに注力することを可能にensitivityアッセイ出力ではなく、技術そのもの、およびより広範な地域社会への牽引力の測定値を利用できるようになります。さらに、これはマイクロポストアレイの完全自動スクリーニングへの道を切り開くための重要なステップです。
MechProfiler解析ソフトウェアは、ファイル形式、TIFF、PNG、BMPおよびJPGの画像を処理します。画像は、蛍光、位相差または明視野光学顕微鏡を用いて撮影することができます。スタンドアロンのプログラムは、（で入手できます： 図12）は、フリーのMatlabのコンパイラのランタイムと一緒に実行され、基礎となるアルゴリズムは、約1分で、単一または複数のセルで画像を処理することを可能にする、合理化された画像処理を可能にします。さらに、これらの細胞を、生きてもよいし、「固定」。
MechProfilerソフトウェアが大きく品質の商用マイクロポストのアレイの再現性に依存することにより、データ分析のスループットを増加させることができ、より具体的には、デフォルト・＃8220;配列内の各ポストの非偏向」位置が理想的なグリッドに対して推定することができる（この研究のために使用される配列内のグリッドの製造偏差は100nm未満でした）。
短いものでは、関心領域にそれらの作物、分析のための画像ファイルの選択を開き、細胞で覆われたポストを定義するか、廃棄する必要がある、ポスト位置を決定し、偏向/理想格子に対する力を計算し、最終的に標準的なオフィスのスプレッドシートに含め、輸出の可能性を持つすべてのセル固有のデータを保存します。
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Protocol
マイクロポストアレイ上の1細胞を培養します
注：すべての手順は、無菌性を確保するために、バイオセーフティキャビネット内で実行する必要があります。ここで指定したボリュームは、T25細胞培養フラスコのためのものです。細胞培養培地レシピ及び細胞播種密度は、骨癌細胞株HuO9およびM132のために最適化されます。
- マイクロポストアレイ上に播種するための細胞培養を準備します。
- 標準光顕微鏡で培養フラスコを配置することによって、細胞培養の品質を検査します。細胞がカバーされているどのくらいの培養フラスコの底部の推定し、典型的な成長と形態を示していることを確認してください。 70％-80％のカバレッジが健全な成長率を反映しています。彼らは死んだ細胞および/または過成長文化を表すとして、浮遊細胞の量に注意してください。
- 4ミリリットル1×リン酸を含む培地と洗浄を除去することにより、トリプシン処理細胞を、生理食塩水（PBS）のバッファをバッファリング。 0.8ミリリットル1×トリプシン/エチレンジアミン四酢酸（EDTA）を追加し、セルまで室温でインキュベートSは約2〜4分をとる、取り除きます。顕微鏡でプロセスを確認し、時折脱落をサポートするために、静かにフラスコをタップします。
- 5 mlの細胞培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、10％ウシ胎児血清（FBSと/ F12）、1％ペニシリン/ストレプトアビジン（ペニシリン/ストレプトマイシン））反応を停止し、じっと座って残留細胞を洗浄するための追加フラスコの底に。その後、均一な混合物を得るために上下に数回この懸濁液をピペット。効果的な脱落を得るために、フラスコの元の成長分野全体のすべてのソリューションをピペッティングすることを確認します。
- 15mlチューブに細胞懸濁液を移し、3分間0.5×gでテーブルトップ遠心分離器を使用して遠心します。
- 上清を除去し、ピペッティングによって、および5回上下5 mlの培地中で細胞ペレットを再懸濁。そうすることながら、気泡の発生を回避することを確認します。
- 細胞計数チャンバと光microscoを使用して、細胞密度を決定しますPE。細胞集合体のための細胞計数チャンバー内の細胞懸濁液を確認し、その後の実験のために、単一の細胞を持っていることを確認します。ピペット再び数回上下細胞は、それらを分離するために凝集体を形成する傾向がある場合。
- 25,000細胞/ mlの細胞溶液を得るために十分な培地で細胞懸濁液を希釈します。閉じたチューブを数回反転させてそれをよく混ぜます。
- 細胞播種のためのマイクロポストの配列を準備します。
クリティカル注：これは、潜在的に不要な気泡が導入されている場合は特に、マイクロポストに害を及ぼす可能性があるので、直接マイクロポストアレイ上にピペットしないでください。また、発生する毛管力はマイクロポストの崩壊につながるとして、マイクロポストの配列が乾燥することはありませんことを確認してください。- ピンセットを用いて、12ウェルプレートのウェルに表向きにし、1 mlのエタノール（99％）を加えることにより、それを湿らマイクロポストのアレイを有するガラス基板を配置します。 20〜30秒間、室温でインキュベートします。
- 希エタノールウェル側に約1 mlの滅菌脱イオン水（DI水）を添加し、トランスファーピペットまたは吸引装置を用いて、およそ1 mlで吸引することにより、段階的。このステップを少なくとも3回繰り返します。
- 約1mlを添加し、吸引することにより、同様にPBS緩衝液で脱イオン水を交換してください。このステップを3回繰り返します。
- 追加し、約1mlの培地を吸引することにより、媒体とPBS緩衝液を交換してください。このステップを3回繰り返します。
- 各準備マイクロポストの配列の上にピペット1ミリリットルの細胞溶液（25,000細胞）。クローズマルチウェルプレートインキュベーター（5％CO 2、37℃）に移します。細胞が付着し、6 -7時間、マイクロポストの上に成長しましょう。
- 光学顕微鏡を用いて、時折接着プロセスを検査します。細胞のほとんどは、複数のマイクロポストにまたがって表示されていることを確認してください。
2.細胞を固定＆染色
注：すべてのステップとここで指定したボリュームは、12ウェルプレートの1ウェルのためのものです。これは、マイクロポストの崩壊につながるであろう、任意の液体を吸引した後、ウェルの乾燥を避けるために、一度に12のウェルの4以上ないを処理することをお勧めします。
- ウェルから培地を吸引し、洗浄細胞を1 mlのPBSバッファーで2倍。インキュベーション中にマイクロポストアレイ上に蓄積された細胞破片を除去し、死細胞を分離するために、PBSで洗浄しながら緩やかな力を適用することを確認します。
- 5分間0.5ミリリットル3.7％緩衝ホルムアルデヒド溶液で細胞を固定してください。
- 1ミリリットルの滅菌DI水でマイクロポストアレイ2回洗浄することにより、ホルムアルデヒド溶液を交換してください。
- 約90秒間（50％水、40％エタノールおよび10％酢酸中0.05％クマシーブリリアントブルー）染料で細胞を染色します。 1ミリリットルの滅菌脱イオン水で2回オフ余分な染色液を洗います。配列をマイクロポストする1ミリリットルのDI水を追加します。
- 光顕微鏡を用いて染色結果を確認してください。繰り返しトン細胞体を可視化するにはあまりにもかすかであるならば、彼は、ステップを染色します。
- 4℃の冷蔵庫内で上に染色された細胞を用いた店舗マイクロポストアレイ。すべての回で水の下でそれらを保つために確認してください。
3.細胞イメージング
注：ステップ4は、無限遠補正された光学顕微鏡なしに適用されます。
- 高分解能イメージングのための薄いガラス底部を有するペトリ皿に2ミリリットルの脱イオン水を追加します。
- マイクロポストを上に向けてイメージング皿にピンセットを使用して、マイクロポストのアレイを転送します。
- 光学顕微鏡の可動ステージ上の画像ペトリ皿を置きます。
- スケールの数は、ガラス基板、シリコーンエラストマーと上に液体の屈折率の不整合を補償するための光路に沿ってすべての材料の厚さの合計を表しまで、イメージングのために使用されるレンズの補正リングを回します。これは、マイクロポストの明るい外観につながるはずコア。
- ダウン50％への照明側の絞りを閉じ、通常の明視野モードを有効光路から任意の位相差リングを取り外します。
- マイクロポストは、観察視野を横切って水平線を形成するマイクロポストの配列の位置を合わせます。開始点（例えば、左上）を定義し、多数の画像を撮影しながら、マイクロポストの配列を走査し、ステージ全体でペトリ皿を段階的に移動します。
- 20Xや40X対物レンズを使用してカメラの最高解像度が設定されたすべての画像を取ります。画像の中央に1つのセルを持つことを目指しています。
- マイクロポストの先端が焦点になるまで基板を介してz軸に沿ってスイープ。顕微鏡の微調整フォーカスホイールを使用し、約2〜3ミクロンのためのマイクロポストの底に焦点を当てた方にそれを回します。
- 露光時間、例えば、（一度に一つのパラメータの撮像を掃引する1つの配列セクションのテスト一連の画像を撮影することにより、標準的なイメージング手順を確立し、）、ランプ等の設定を設定するアイリス。 MechProfilerで画像を分析し、高速で信頼性の高い分析に適したパラメータセットを決定します。
オープンソースソフトウェア「MechProfiler「4.画像解析
注：すべてのソフトウェア機能は、マウスの左ボタンを使用して、ポインティングデバイスを用いて活性化することができます。しかし、訓練を受けたオペレータは、効率的な両手の画像処理を可能にするために、キーボードの左半分になるように設計、文書化のショートカットキーを使用します。
- 画像解析ソフトウェアMechProfilerを起動し、「開く」をクリックして分析する必要がある画像の範囲を開きます。
- ソフトウェア開発者によって与えられた「設定」セクションにすべてのパラメータを挿入します。カスタムソフトウェアのマニュアルにより詳細に記載された手順に従って（ すなわち、輪郭しきい値と最小距離）に設定する必要があるパラメータを決定します。
- 画像を分析一つ一つ「クロップ」を使用して関心領域にそれらをトリミングすることによって（マウスボタンをクリックしてドラッグを押下）です。このアクションを完了するために描かれた長方形の内側をダブルクリックします。
- 「セルの枠線の描画」とセルが接続されているすべてのマイクロポストを含む描画に十字カーソルを使用をクリックすることで、それぞれの可視セルのアウトライン一つ一つをマーク。
- 「廃棄投稿」をクリックすることにより、不要なマイクロポストを破棄し、描画するための十字カーソルを使用しています。画像セクションの外のセルに属しているか、それは他の理由ではなく、目的の細胞によって偏向されているすべてのマイクロポストを囲みます。
- マウスクリックにより「重心を探す「ソフトウェアサブルーチンを起動します。右横に中央に赤い×印で表示されているすべてのマイクロポストが登録されるまで、「重心を検索」ボタンへのフィルタ設定を調整します。フィルタ設定が低すぎると、それは高すぎるムーであればマイクロポストは、無視されますltiple位置は、単一のマイクロポストのためにマークされます。分析セッションの間に一定のフィルタ設定をしてください。
- 複数または逃したマイクロポストの位置に重心のマニュアル編集機能「手動編集」を使用してください。クリックして、それを越えてドラッグすることで、問題のマイクロポストを選択するために、マウスの十字線を使用してください。長方形の内側をダブルクリックして、自動的に閉じ拡大画像]セクションに不足している赤いマーカーを配置します。それが描かれたセルの輪郭の外側にある場合は先に進む前に、（ステップ4.5を参照）、このようなマイクロポストを捨てます。
- マウスクリックで「グリッドの生成」機能を活性化することにより、理想的なマイクロポストのグリッドを検索します。位置が描かれたセルアウトラインの内側、青いリングによって示される、真のマイクロポストのヘッドに対応することを確認してください。
- マウスクリックで対応する「マヌエル編集」機能を使用して、必要に応じ、セル領域内の任意の見当違いのグリッドメーカーを修正してください。クにマイクロポストを選択するために十字を使用して、クリックして、それを越えてドラッグしestion。登場する四角形の内側をダブルクリックして、自動的に閉じ拡大画像]セクションに不足している青色のマーカーを配置します。
- 画像部と、生成された理想的なグリッド内部のマイクロポストの位置との差に基づいて算出された偏差値のヒストグラムを取得するためにクリックしマウスでボタン「計算たわみ "を使用してください。
- 「保存」をマウスでクリックすることにより、値のテーブルを含む完全な分析を保存します。
- 「表示をリセット」と「次の画像」上の他の画像部分やマウスのクリックを分析し、便利な右のキーボードのカーソルキーを使用して行うことができるをクリックすることで、どちらかの画像解析を続行します。
5.データ分析 - Mechanoprofiling
- 分析画像をフォルダからオフィススプレッドシートプログラムでファイル "results.xls」を開きます。それはアルとのデータが含まれていますlは分析された細胞によってすべてのマイクロポストのたわみや、仕事などの標準的な微分措置を含む値（ すなわち、基板の変形エネルギー）を算出しました。
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Representative Results
記載された技術の主な利点は、通常の実験室の作業に迅速かつ効果的な統合のためのシンプルさと可能性にあります。オープンソースソフトウェアと対になって高品質の商用センサアレイの組み合わせは、そうでなければ、クリーンルーム施設や画像解析やソフトウェア開発についての深い知識へのアクセスを必要とするであろう。 図1は、提示された方法のワークフローを示してメカノ感度に関する情報を提供します。これは、マイクロポストアレイ上に細胞を調製し、播種から始まります。細胞を固定し、染色した後、マイクロポストアレイは、イメージングのための準備ができています。技術の中心部はMechProfilerソフトウェアを用いた画像解析です。ユーザーがすぐにGUIの「設定」に関連するすべてのパラメータを入力した後に画像をanalyszng開始することができます。対応する画素のサイズは単一のピクセルによって表される、ユーザの設定に依存されている長さです。それは必要既知のサイズの対象物の画像を撮影して、各使用拡大のために別々に確立することができます。例は補足図9に示されています。
それは強く分析プロセスに影響を与えるように画質が重要な要因です。具体的には、図2に示すように、1つは安定しており、日常的にサービスイメージングプラットフォームを持っていることを確認する必要があり、最高品質を達成するために、光源の位置合わせは、分析するときに問題となる可能性が不要な影が発生しますミスアライメントとして重要です画像。それは撮像中にさらなる安定性を与えるようさらに、除振台や板の上に光学顕微鏡を配置することは、ほとんどの実験室で有益です。
イメージングのために薄いガラスボトムシャーレを使用することの利点は、高解像度で明るい画像に変換され、より高い実効開口数の値が含まれています。
ときに滝マイクロポストのヒントに焦点を当てが原因でパリッとした暗いリングとして現れる周囲に促進されるように明視野モードで画像を50％に閉じアイリスngをすることは、推奨されます。使用される目的は、補正環を有する場合にはまた、正確な力の読み出しを実現するためにそれを正しく設定することが不可欠です。その特徴の影響は、 図3Aと図3Bを比較することによって理解することができる。迅速に分析することができる画像は、図3Cに示すように、最適な照明と共に補償リングの正確な設定を組み合わせることにより達成されます。それは検索アルゴリズムを高速化するようマイクロポストとその周囲との間に強いコントラストが、分析時間が短縮されます。ユーザーは、最小限の経験を容易に分析することができる画像を達成するために必要とされることがわかります。
重要なことは、上記のプロトコルはルーチンにマイクロポストアレイの迅速かつ効果的に統合するために重要と共通の障害を克服実験室の仕事。唯一のセンサー再現性、感度、および精度の徹底的かつ詳細な実験的特性評価によって達成可能であるオンデマンド - この障害は、アレイの品質を制御する必要性から生じます。しかし、このかなりハードルが完全に回避されている市販のマイクロポストアレイに回して。 図4Aおよび図4Bは、このようなマイクロポストの配列の精度を示しています。マイクロポストの位置のずれが十分に200 nmの下で使用されたセットアップのための82ナノメートルのピクセルサイズをもたらしカメラ/目的の組み合わせに付随する「画素エラー」と比較可能なようです。細胞がマイクロポスト偏向の画像の分析は雑音比に快適なシグナルをもたらす（ 図4C及び図4Dに示すように）細胞課さ偏向の値が200nmよりも実質的に高いことを示しています。
図5 illustratES画像内のマイクロポストのための出現の異なる種類のは、それが偏向されているかどうかによって異なります。非偏向マイクロポスト上述したように、彼らの周りの暗いリングと明るい円形の外観を持っています。それらの位置は、デジタル画像解析のための特徴抽出法であるハフ変換を用いて決定することができます。
また、倒立顕微鏡に偏向マイクロポストは（ 図5Aを参照）は、2つの向い暗い半月形状を示すことを示しています。第1の検出が困難になる一方、正立顕微鏡でマイクロポストの先端と1暗い半月形状のエッジが正しく表示されます。これらの特性は、このプロトコルのために開発されており、「輪郭のアプローチ」と命名された偏向マイクロポストから先端の明視野顕微鏡画像の位置を計算するための基礎となります。
図5Bは、HuO9骨癌の一例であり、倒立顕微鏡（上）上に結像マイクロポストのセル。その画像の分析バージョンが適用され、輪郭アプローチ（下）の結果を示す。 図5Cは、正立顕微鏡（上）と同じマイクロポストのアレイを用いて撮影されました。再度分析バージョンは、輪郭のアプローチを使用しての結果を示します。
すべての画像解析セッションはMechProfilerの「設定」セクションのパラメータのユーザ認証によって開始されます。いくつかは、マイクロポスト配列の次元とバネ定数のようなマイクロポストのメーカーによって与えられています。他のものは、このような輪郭のしきい値とソフトウェアのマニュアルに詳述される手順に従って、最小限の撓みしきい値の値として、ユーザーによって定義されます。しかし、これらの値は、注意深く選択されるべきであり、比較可能性を保証するために、画像の相互関係のセット内の全ての画像について一定でなければならないことに留意することが重要です。画像analysiための前処理工程、一方Sは、トリミングのように、自己説明する「検索重心」のようなソフトウェア機能の基盤となる戦略は、「グリッドの生成」と「輪郭アプローチ」は、より詳細な説明が必要です。
デフォルトのマイクロポストの位置の検出アルゴリズムは、（メーカーによって配信されるように）「検索重心」のソフトウェア機能を使用して開始します。このアルゴリズムは、最初のマイクロポストを検索する画像の左上隅に開始されます。その後、他のすべてのマイクロポストは、最初のマイクロポストの座標プラス六角形の幾何学以下の製造業者によって与えられたグリッドとマイクロポストの大きさの値に基づいて発見されました。各見つかったマイクロポストのための重心は、ハフ変換を用いて計算されます。 GUIのコマンドボタンに次のフィルタスライダはこの変換の感度を調整することができます。すべての見つかったマイクロポストが赤い十字でマークされ、その位置は、SUのために注意bsequentプロセス。
次に、「グリッドを生成」機能は、すべてのマイクロポストの先端の座標につながります。これらは、多段階プロセスの結果です。第1の最適化機能は、理想的なグリッドを確立する前に実行される「重心を探す」のアルゴリズムからの初期位置を含む解決されます。第二のセル領域内のマイクロポストの位置が算出されます。理想的なグリッドを基準に設定パラメータ「最小偏向しきい値」で定義されたよりも少ない撓みとマイクロポストは、ヒューの変換で処理されます。他のすべてのマイクロポストの先端位置は、偏向マイクロポストのための上述の輪郭のアプローチを使用して計算されます。ここで、ソフトウェアは、（ 図5Aを参照）離れて（暗い明るい）の円形エッジのためのセル中心から15°の角度以内の初期重 心から検索を開始します。そのエッジが検出されると、所定のマイクロポスト径の円をtに取り付けられていますGUIでの設定から輪郭閾値を用いハットエッジ。そのパラメータは、ピクセルのグレー値はフィッティングプロセスのために使用するかを決定します。高いほど値がよりあるフィッティングは、それが暗くマイクロポスト輪郭にその円に合った、よりを大切にし、その下の明るいマイクロポストの中心に向かって傾いています。一旦、全ての画像は、人工的なたわみを追加したり、あまりにも保守的偏向を呼び出す避けるために与えられた研究の中に分析するための値が一定のままであるべきであることを選択しました。
例えば、 図6は、適切な輪郭閾値を決定するための重要性を示しています。ソフトウェアは、ユーザーがすべての物理的に可能な照明の状況を包含するように広い範囲（0.9から0.1）のために選択することができます。両極端と途中で、より実用的な価値のために与えられた偏向距離に光情報の翻訳は、図6Bに示されています。しかし、訓練を受けたソフトウェアのユーザーは、多くの場合、converg非常に類似した輪郭しきい値E、 図6Cに見られるように匹敵する結果をもたらします。また、細胞染色および画像化のための標準化された手順を使用して、一般的に画像の相互にセットに対して内一定のままでなければならない無効な輪郭閾値の危険性を最小限に抑えます。
この方法のロバスト性をメカノプロファイリング結果の選択を示すために、図7に要約されている。 図7Aに M132から骨癌細胞HuO9二つの二つの結果を比較します。すべての4つの配列は、同じ製造バッチからのものであるので、同一の機械的特性を有します。分析は、最小限のたわみ（0.25μm）のための輪郭のしきい値（0.125）のパラメータの固定セットを用いて行きました。また、SAOS 2骨がんからの画像の2つの同一のセットは、パラメータの設定の詳細についてずに、2つのアナリストに与えられた（ 図7を参照してくださいB）。分析上の染色の影響が続いて色素を除去し、クーマシーブルーで染色されたR.骨がん細胞の画像を撮影することにより試験しました。クマシーブルーGで再染色した後の画像の第二のセットを撮影した。 図7（c）は、両方のシリーズからの結果を示し、最小限のたわみ（0.25ミクロン）と輪郭閾値（0.25）のために同じ値を持つ同じユーザによって分析しました。
適用メカノプロファイリングの典型的な例は、コンパイルされたデータは、4つのアレイのそれぞれからプールした151細胞を分析した後、骨の癌細胞株HuO9およびM132のために提示され、図8（a）に示されています。この概要では、すべての指標値は、M132がすでにHuO9細胞がM132よりもより多くの力を適用することを示すためのよりHuO9の方が高いです。しかしながら、画像解析からのデータは、より良いフェンを理解するために採掘され得る付加的な単一セル大量の情報が含まれてい指定された行の中otypic細胞株の行動と細胞間の変動。 1は、同様の最小値と最大値にもかかわらず、データ値が異なって分布し、実際に低転移性細胞株HuO9細胞が高転移M132ライン以上の力を付与する傾向がある（ 図を参照してくださいことを発見ボックスプロットでマイクロポストあたりの力の結果を提示することにより、 8B）。また、セル面積に対する力の値を分類することにより1セル当たりの平均力がM132に比べHuO9細胞のために上昇しているだけでなく、検出されたが、細胞は、ポストに達するあたりの平均の力まで広がるようマイクロポストが増加あたりの平均力こと（ 図8Cに見られるように）、より安定した値。また7マイクロポストの値をカバーする細胞について、おそらく、彼らは典型的には、1つの中央の彼らの細胞系のマイクロポスト独立非偏向を六角形に現れるという事実によるものである、ほとんど同じです。別に差分から収縮性のerencesは、形態学的な違いは興味深い結果と定量することができます。高転移性M132細胞とは対照的に、例えば3つだけのマイクロポストをカバーし、非常に少数のHuO9細胞がありました。細胞株との間の他の形態学的比較は、被覆されたマイクロポストの数で表されるセル面積の分布を含む、とすることができる。 図8Dは、マイクロポストの上に成長したときに2つの細胞株はまた、動的な拡散挙動が異なることを示しています。要するに、mechanoprofileは、親細胞株についてHuO9は、彼らは通常、より多くの領域をカバーし、転移性細胞株M132、HuO9から派生攻撃的な細胞は、特徴的に少ないマイクロポストをカバーし、マイクロポストあたりの少ない力を付与する一方、マイクロポストにもう少し力を適用することが明らかになりました。これらの結果は、差別的なアプリケーションのためのTFMベースのアプローチの可能性を示します。
図2画像機構標準倒立顕微鏡は、マイクロポストのアレイ上の細胞を画像化するために使用されます。セットアップはまた、データストレージ機能を提供することができ、顕微鏡カメラとそのコントローラが含まれています。示す大画面は必須ではないが、それにもかかわらず、拡張イメージングのための便利ですセッション。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
マイクロポストイメージング図3.ガイドライン。明視野モードで40倍レンズで撮影したマイクロポストアレイ上の染色された細胞の（A）の画像。画像化されたときに非偏向マイクロポストは、暗いリングに表示されます。偏向ポストは暗いと明るいの両方のサブ領域を有する楕円形状をとります。マイクロポストをカバーする染色された細胞を、それらがマイクロポストとセルの間にはコントラストが存在しないことをポイントにしても暗く見えます。 （B）同じ画像がレンズ補正環を調整し、再集束後に採取しました。ここでマイクロポストのコアは、実質的に明るくなり、よりコントラストを与えます。 （C）adjus後、再び同じ位置に結像ティンカメラコントローラを持つすべての照明パラメータ。自由に立っマイクロポストは、ダークリングのように明るい円を表示されます。偏向マイクロポストは、引き上げ軸に沿って湾曲部のコアの周りに明確なハーフムーン"影"を示す。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。>
図4.分析マイクロポストのMechProfilerのスクリーンショット。（A）は、空の典型的な例 マイクロポストのアレイは、このスクリーンショットで見ることができます。マイクロポストは、一定の六角形のパターンに配置されています。 （B）これらのマイクロポストのために偏向値のヒストグラムは、すべての値が200nm以下であることを示しています。 HuO9骨癌細胞被覆用（C）の典型的な例複数のマイクロポストを引っ張ります。これは、引っ張り量が不均一であることが分かります。 HuO9セル用の偏向値で（D）ヒストグラムは、マイクロポスト基質と細胞の相互作用から生じるたわみの広いスペクトルを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図5.マイクロポストの明視野照明で出演し、画像内での位置を計算するための戦略。（A）非偏向マイクロポストは暗い外輪と明るい円形の領域として表示されます。重心は、ハフ変換により算出されます。偏向マイクロポストは暗い半月形状を示します。マイクロポストは、ガーゼに直面している場合は、顕微鏡の設定によってトンの源 （例えば、倒立顕微鏡）2つのよく見える半月形状があります。マイクロポストは、レンズに直面している場合（例えば、正立顕微鏡）のみ半分の月が良く見えるだけでなく、先端の非常にエッジです。いずれの場合においても輪郭アプローチは、マイクロポストの先端を計算するために使用されるべきです。 HuO9骨癌細胞輪郭のアプローチを使用して分析したバージョン（下）からの倒立顕微鏡を使用して、（B）は、元の画像（上）。 （C）再び輪郭アプローチ（下）を適用することが、暗いリング状のエッジを呼び出すためのより適切なはるかに低い輪郭閾値と、正立顕微鏡や分析バージョンを使用して、同じマイクロポストの配列（上）からのオリジナル画像。 してくださいこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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輪郭アプローチと適切な閾値を選択し、図6（A）は、3つのスクリーンショットは、3つの異なる輪郭の閾値を使用して同じ分析マイクロポストを示しています。値が設定されている場合のいずれかが低すぎる（左）または（右）ソフトウェアが誤ってマイクロポストヘッドを表す青色のリングに合ったよりも高すぎます。それは過小評価またはマイクロポストヘッドの実際の位置をオーバーシュートします。正しく選択しきい値は、偏向を通じて形成マイクロポストの内側半月形の暗い領域にその青いリングに合わせてソフトウェアを有効にします。 （B）のグラフは、上記に示したマイクロポストのために選択された輪郭のしきい値に依存たわみの平均量を示しています。また、輪郭フィッティングが適用されないため、セルの輪郭外のマイクロポストの値に影響を与えないことを示しています。 （C）のグラフは、選択することを示しています適度な間隔内のしきい値が過剰またはマイクロポストの偏向を過小評価する危険性をminimalizes。別の訓練を受けたユーザーが選択した値の差は、平均偏差値の許容可能な差異が生じる0.05、より通常は小さい。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図7.異なる骨癌細胞株からのメカノプロファイル結果の頑健性試験;エラーバーは1標準偏差を表す（A）メカノプロファイリングアレイ3にアレイ1とM132にHuO9細胞を播種した後、4つの同一のマイクロポストアレイからの結果を- 。4日後アレイ4（B）にアレイ2とM132にHuO9を播種Mからの結果の比較二つの独立したアナリストによる分析後の画像の同一のセットに基づいてechanoプロファイリング。 （C）クマシーブルーRで染色し、染料を完全に除去した後の第2、クマシーブルーG.で染色を再後に撮影した二つの異なる画像のシリーズ第1から画像解析結果の比較この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。>
図8の骨癌細胞株のメカノプロファイリング。（A）は、2つの骨の癌細胞株HuO9との比較（低転移能）およびM132（高転移性）のグラフは、すべての指標値が（HuO9細胞株に対してより高いことを示しています合計N = 302;実験の2つの独立したセット、エラーバー=標準偏差）。 （B trong>）ボックスプロットは、マイクロポストごとに加わる力が低いナノニュートンの範囲内にあることを示しています。しかし、HuO9細胞は、M132細胞（ウィスカは、データの最小値と最大値を表す）より引っ張ります。 （C）同様の結果は、マイクロポストの同じ数をカバーするセルを比較することによって理解することができます。 HuO9細胞は、M132細胞よりも多くの力を適用します。 3マイクロポストをカバーするHuO9細胞の数は、代表的なものではなく、唯一の完全性（エラーバー=標準偏差）が含まれています。 （D）覆われたマイクロポストの数間で異なる分布はマイクロポストアレイと相互作用する場合、それぞれの骨癌細胞株は、独自の拡散特性を有していることを示している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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補足図9は、顕微鏡のセットアップのためのピクセルサイズは、通常、その上にスケールバーとの特別な顕微鏡スライドを使用して決定されます。代わりに、製造業者によって与えられたマイクロポストのアレイレイアウトを使用することができる。例えば、13ミクロン（195ミクロン全長）で15単位が2,375ピクセルで割った（画像処理ツールで設立）0.082ミクロン/ PXLにつながる。 こちらをクリックしてくださいこの図の拡大版を表示します。
倒立顕微鏡に2つの照明技術を使用して、同じ位置から撮影したHuO9骨癌細胞の画像の補足図10の比較。 DIOは、マイクロポストが緑色蛍光性である染色しました。（ 明視野モード。 （B）は、iは緑色蛍光チャネルに切り替えた後に撮影したMAGE分析しました リフォーカスなし。 非常にマイクロポスト先端に焦点を補正した後、（C）第2の蛍光画像。両方の照明チャンネルの（D）オーバーレイ 例示のみを目的としました。 三つの画像から得られた結果として、（E）メカノプロファイリング指標 は。完全な偏向は蛍光画像から推定することはできませんフォーカスを修正するにもかかわらず。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
補足Fiの正立顕微鏡でのDiIを用いて、蛍光染色されたマイクロポストの同じ位置のグレ11 画像シーケンス（A）明視野像。先端で互いに接触3マイクロポストがあります。 （B）少しマイクロポストの頭の上に蛍光チャネルに切り替えた後、同じ位置。マイクロポストの先端に非常に焦点面を下げる（C）。 （DE）、さらにマイクロポスト「ボトムに向けて焦点面を段階的に下げた後、連続した画像。 （F）シリコーンエラストマー基板の内部に焦点面を下げた後、マイクロポストのイメージ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
HuO9骨がん細胞をプロファイリングからMechProfiler GUI。典型的な分析結果の補足図12のスクリーンショット 。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
この作品は、実質的にエントリへの技術的、実用的な障壁を下げることによって牽引力顕微鏡の分野を進めることを目指しています。これらの障壁は、二つの側面から来ます。まず第一に再現可能に製造し、実験的にマイクロポストの配列を委託するために克服しなければならない多数の非自明な技術的課題があります。典型的な実験は、細胞の数百または数千もの分析を必要とするかもしれないことを念頭において - 第二に、単一細胞の力の信頼性の半自動分析のため、同様に非自明な必要性です。上記の技術は、常駐エンジニアリングの専門知識を持っていない細胞生物学研究所内のマイクロポストベースの牽引力顕微鏡にアクセスできるように開発されました。この記事で紹介したセンサーや分析技術は、非専門家が容易にかつ正確に、単一細胞によって及ぼされる力を分析できるようにする必要があります。
別に細胞生物学のLへのアクセスから少なくとも半ばグレード明視野顕微鏡でABは、記載の方法は、いくつかの追加の技術要素を必要とします。ここでは、ほとんどのユーザーは、技術のパワーと汎用性にもかかわらず、あっても限られた経験を持つ有効な牽引力顕微鏡実験を行うことができます。それにもかかわらず考慮されなければならない発表のプロトコルにおける3つの重要な側面があります。最初に、マイクロポストのアレイは常に崩壊その毛細管力を避けるために液体で覆われていることを保証する必要があります。二つ目は、最良の露光時間、絞りの開口部、及び補償リング位置を変化させながら同じ配列位置の一連の画像を撮影することによって行われ、取得したマイクロポスト画像用撮像パラメータを最適化する必要があります。これは、マイクロポストの先端の正しい焦点面を見つけることが重要であり、この側面は、センサアレイの小さな次元の奥行きを与えられたいくつかの経験がかかります。第1は、公然とアクセス可能な画像解析ソフトウェアMechProfiler discusseをダウンロードする必要がありますDここでは、詳細なユーザーマニュアルとトレーニング例は、ダウンロードサイトで入手可能であるため。手動で提供する実施例を分析するためのソフトウェアを使用して経験した後、ユーザは、適切な顕微鏡の設定を構成するように使用される画像化設定にテスト画像を取るべきです。得られた画像に基づいて、輪郭閾値も同様に最適化されるべきです。単一のマイクロポストの画像は、数時間以内（セルの数百の分析）統計的に関連する結果の生成を可能にかかわらず、それは、1つ以上の細胞を含むかどうかのオープンソースMechProfilerソフトウェアを使用して分以内に訓練を受けたユーザによって分析することができます。
いくつかの調整を必要とする別の態様は、任意の適用された細胞染色手順の最適化です。細胞が過度に染色されている場合、ソフトウェアは、正しいマイクロポストの位置を登録するために失敗することがあります。染色があまりにかすかである一方、それを検出するためにユーザが多くの労力を必要とします"真の"セルのアウトラインのような薄い細胞突起が見逃すことができます。
しかし、細胞染色およびアレイ撮像手順の一定のプロトコルを適用することによって、このエラーの範囲が許容可能に低くなります。この作業中に異なる細胞染色手順は、クリスタルバイオレット、ツイーン20またはトリトンX、またはエオシンを添加することにより色素の組み合わせのような界面活性剤の存在下で種々の濃度に基づいて、試験されました。それにもかかわらず、染色の強度だけでなく、その安定性は、実験の実験に、実質的に変化しました。上記のようにブリリアントブルーGのみの使用はまだ薄いセルのアウトラインを参照するのに十分な強さではなく、先進輪郭アプローチに干渉することなく組み合わせた許容可能な細胞染色堅牢性を示しました。
一般的には、提示された技術を変更するためのオプションがあります。蛍光顕微鏡染色オルガネラとここで提示明視野技術を組み合わせることにより、例えば核または細胞力学の文脈における根本的な細胞プロセスに関する追加情報を提供することができるアクチンフィラメントネットワーク、等です。また、使用して長鎖ジアルキルcarboxycyanines（DIIまたはDIO）マイクロポストは、蛍光になる。14はそれにもかかわらず、それが提示された技術からの各偏差を制御することが重要です。補足図10および図11は、潜在的な落とし穴を説明します。倒立顕微鏡を用いて緑色蛍光チャネル（ 図10Bおよび10C）にクマシーブルーG染色したNIH 3T3線維芽細胞を撮影した画像は、障害のある位置解析（ 図10E）に続く主要マイクロポストの体ではなく、彼らのヒントを提示します。細胞染色による蛍光シグナルの吸収が原因である可能性があり、明視野モードマイクロポストのヒントを撮像することができない（ 図10A）から切り替えた後、再び焦点を合わせるための最善の努力にもかかわらず。これはIMAとは対照的です。正立顕微鏡（ 図11B-11F）の黄色の蛍光チャネルで撮影されたGESは、前記複数の鮮明な画像は、z軸に沿って取得することができます。ここでユーザは、画像が不良偏向値を呼び出す避けるために、マイクロポストの底にどこかに近い非常に先端（ 図11C）での焦点面で採取していないことを確認する必要があります。
これは、マイクロポストのアッセイのための技術的な限界もあることに留意すべきです。例えば、検出された振れの精度は、光学セットアップの品質に依存します。顕微鏡は、多くの場合、接続されたカメラの光感度は多数の画素よりも高い優先度を有する蛍光イメージングのために最適化されます。当然のことながら、これは、より大きな画素サイズを有する画像をもたらします。さらに、細胞突起は、基板下部に達した場合、明視野画像を決定することができないことに留意すべきです。しかし、商用マイクロポストのアレイは、共焦点を用いて試験しました。顕微鏡。それは、細胞がマイクロポストのアレイの残りのマイクロポストの先端にのみ付着を促進しないバイナリコーティングを受け入れるように見えることが見出されました。もう一つの要因は、0.2μmであることが示されているマイクロポストのアレイの位置誤差に由来します。一緒に2.8 NN /μmでの一定のバネ定数と、これは0.6 NNの力読み出しでエラーが発生します。マイクロポストアッセイのための別の制限は、複数のセルで共有マイクロポストから加わる力を決定することができないという事実に由来します。したがって、唯一の単離された単一細胞を分析することができます。提示されたプロトコルのための具体的な制限は、信頼性の高い結果を得るためにユーザーのための訓練の一定量を必要とする敏感な輪郭アプローチの正しい適用から派生。マイクロポストアレイは、水平方向または観察視野の縁に沿って垂直線を形成するように整列されているまた、より高速な分析のために、ユーザは、画像を取る必要があります。 Despit電子六角形グリッドジオメトリ内のマイクロポストを見つけるためのソフトウェア・アルゴリズムが5°以上のオフ軸が回転角度によってマイクロポストのイメージングを限定されないことが不完全なマイクロポスト、その後リードを含まないことが難しく、画像のセクションをトリミングすることを可能にするという事実「グリッドを生成」機能の失敗に。このような場合、ユーザは、マイクロポストの位置を分析するために開始する前に、統合された回転機能を使用することができます。
記載された方法は、主に2つの骨の癌細胞株、HuO9名前親細胞株、およびM132と命名由来の高度に転移性の線を特徴づけるために適用されました。この文脈では百6上に単一細胞の画像は明視野モードで撮影し、MechProfilerソフトウェアを用いて分析しました。その後のデータマイニングは、親細胞株HuO9が少しより多くの力を発揮し、通常は転移性細胞株M132から細胞よりも細胞あたりのマイクロポストをカバーすることを明らかにしました。しかし、細胞おそらく結果、広範囲のに貢献した固定の瞬間、で同期され、細胞周期の異なる段階でされていませんでした。 24時間までの期間にわたって生細胞画像を撮影することで、それは他の人が、広がり、切断を移行し、異なる速度（補足動画を参照）で再度移行し、一方拡散した後に、多くの細胞がその初期位置に残ることが判明しました。これは、細胞の機械的なプロファイルは、多くの場合、一定ではなく、細胞集団を横切って、あるいは、現在の活動に応じて、単一セル内で大きく変化し得ることを示しています。もう一つの要因は、それが細胞は、細胞が平らな表面に付着し、微小なステップに移行することができます古典的なTFM、とは対照的に、別のマイクロポストに到達するために個別の移行手順を実行することを余儀なくされたマイクロポストアレイ上にある可能性があります。しかし、これらの小さなステップを分析するためには非常に高度なMへのアクセスを必要とする接着斑点の蛍光画像を撮ることが必要ですicroscopesと非常に精巧な画像解析ソフトウェア。それにもかかわらず、より大きな集団内の機械的プロファイルの分布は、多くの場合、依然として細胞株の決定的な特徴です。したがって多数の細胞の特徴付けを可能にするハイスループット法が不可欠です。ここで紹介するマニュアルイメージングプロセスとオープンアクセスソフトウェアは、完全に自動顕微鏡システムにスケーリングするための大きな可能性を秘め。
要約すると強固な牽引力顕微鏡のアプローチは、標準的な細胞生物学の研究室で容易に採用可能であるが提示されます。細胞播種から画像解析のワークフロー全体は、シンプルで効果的です。ここで説明するプロトコルは、完全に機能的であるが、改良がまた直交レイアウトのマイクロポストのアレイを扱うことができるように、解析アルゴリズムを適応させるために進行中であり、生細胞イメージングの画像シーケンスの分析を単純化する手順を開発します。骨癌細胞のLiの結果に関連してNEの、ここに記載されるアプローチは、このようなアッセイは、骨癌患者からの生検細胞の転移の可能性を予測するために臨床医を可能にする、予後値を保持することができるかどうかを確立するために、臨床生検からの細胞をスクリーニングすることができます。そのようなアッセイは、治療戦略に影響を与えるであろう。他の潜在的な用途は、薬物の有効性または毒性を確立するのを助けるために、潜在的に、平滑筋細胞または心筋細胞のような機械的に活性な細胞に薬学的に活性な化合物を試験することに関する。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm |
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
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