Enkel og nøyaktig Mekano-profilering på Micropost Arrays

Introduction

Mekano-sensitive cellebasert analyse tillater undersøke heftende celler, med et bredt spekter av programmer som gjenspeiler den sentrale rollen som mekanikere kan spille i cellebiologi. Disse programmene ofte fokus på de underliggende mekanismene som driver subcellulære prosesser eller hel-celle atferd. På den ene side kan ytre miljøfaktorer som ekstra cellulær matrix sammensetning eller matrise stivhet dramatisk påvirke mekanisk og biologisk respons i en celle. ^1. Det samme kan observeres etter anvendelse av mange klasser av farmasøytisk aktive forbindelser, hvis effekter er kjennetegnes ofte ved hjelp av cellekulturmodeller. ^2. På den annen side genotypiske egenskaper, for eksempel de som forårsakes av spontane eller eksperimentelt indusert genetiske mutasjoner, kan indusere markerte endringer i celle-fenotype som er forbundet med endringer i cytoskjelettet struktur og funksjon. ^3. Disse eksemplene er bare noen få av de mange muligeemner som mekanisk fenotyping av celler er relevant, og alle disse har vært hensiktsmessig undersøkt med micropost arrays.

På skrivende stund, har ca 200 artikler er publisert beskriver celle-micropost interaksjon. Disse verkene diskutere teoretiske aspekter av micropost nedbøyning prinsipper samt praktiske instruksjoner om produksjonen. Den første artikkel som beskriver interaksjonen av celler og fleksible micropost matriser ble publisert av Tan og medarbeidere i 2003 ⁴ I motsetning til klassiske trekkraft mikroskopi (TFM) hvor kontinuerlige myke substrater benyttes for å estimere nanonewton-skala celle kontraktilitet, Tan et al. beskrives en fremgangsmåte ved hjelp av flere tett adskilte vertikale bjelker laget av silikon-elastomer. De viktigste fordelene med denne teknikken oppstår fra to viktige funksjoner. Først for å endre celle tilsynelatende underlaget stivhet man kun trenger å endre micropost dimensjoner samtidigsubstratblandingen ellers konstant, og således unngå forskjeller i overflate topologi og kjemi. Second microposts opptre som individuelle fjærer som kan diskret analysert med kraft og romlig oppløsning på rekkefølgen av enkelt fokale sammenvoksninger og kan redusere de analytiske utfordringer som er iboende til analog analyse av standard TFM.

I dag er utvalget av applikasjoner for micropost arrays stor grad overstiger bare kartlegging av krefter for noen enkeltceller. For eksempel rapporterer Akiyama bruk av en isolert ryggbeholder vev fra en møll larve som en aktivator for et micropost array, for å utvikle et insekt muskeldrevet autonome mikro-robot. ⁵

Imidlertid har de fleste publiserte anvendelser av microposts fokusert på studier av medisinske tilstander som infeksjon eller kreft. For eksempel har micropost arrays blitt brukt til å studere styrkegenerering av buntet type IV pili av Neisseria gonorrhOEA kolonier som er forbundet med signal kaskader styrke infeksjon. ⁶ Andre har brukt microposts å studere brystkreft celler behandlet med farmasøytiske forbindelser rettet cytoskjelettet. ⁷

Avbøyning av en micropost blir ofte beskrevet ved hjelp av klassisk teori stråle for en cantilever med en slutt belastning forutsatt cellen legger bare til helt i spissen av micropost. Her den påførte kraften F som fører til en bøyning δ avhenger av micropost er "bøyestivhet" k og beregnes ved:

(1)

med E, I og L er en Youngs modulus, område treghetsmoment og strålelengde hhv. Men resultatene fra denne ligningen bare gi en generell tilnærming av krefter på jobb siden strålen skjæring og bøying samt underlaget fordreining ikke er tatt i actelle. Tatt i betraktning at microposts er vanligvis laget av myke materialer som polydimethylsiloxane (PDMS) -baserte silikongummi disse faktorene må tas med. . Schoen et al viste at det er en slik en korreksjonsfaktor basert på størrelsesforholdet av micropost (L / D) og den tilsvarende polymer er Poisson ratio v ⁸ Det er gitt ved.:

(2)

Med t _vippe (v) er en koeffisient vippe som inneholder passende parameter a = 1,3 som kan bli funnet i den samme artikkel:

(3)

Det betyr at en micropost er korrigert stivhet k _corr er produktet av den rene bøyestivhet k = k _{bøye og} korreksjonsfaktoren korrgitt av:

(4)

Derfor bør celle styrkeberegninger utføres ved hjelp av mer raffinert variant av ligning (1) nå leser:

(5)

Virkningen av korreksjons blir mer åpenbar så snart som typiske verdier for micropost dimensjoner er brukt. For eksempel kan en 15-mikron lange micropost med et sirkulært tverrsnitt og en diameter på 5 um fremstilt av PDMS-baserte silikongummi fører til en korreksjonsfaktor på 0,77, og derfor en ikke-korrigert beregning ville overvurdere utøves cellekreftene med 23%. Dette blir enda mer alvorlig for microposts med mindre størrelsesforhold.

Tradisjonelt har micropost bildeanalyse også vært basert på idealiserte bjelke bøying teori. I 2005 gruppen som pioner i bruk av micropost arrays publisert en bildeanalyse programvare egnet for micropost analyse ⁹ Programvaren krever en programvarelisens, og brukeren må ta tre bilder for hver stilling.; ett hver fra micropost topp og bunn flyene i sendemodus og en annen i fluorescens modus med farget celle. Etter sammen de øvre og nedre stillinger for hver micropost programvaren bestemmer en kraftvektor-feltet, og beregner relaterte parametere som kraft pr stolpe. Andre programvarepakker finnes og deres analytiske prinsipper er kort nevnt i de tilsvarende artikler som beskriver dem, men disse analytiske programvarepakker er generelt ikke er offentlig tilgjengelig. ^10,11

De micropost matriser beregnet for kartlegging cellekrefter kan bli klassifisert som enten å være i en ortogonal micropost layout eller en sekskantet en, den sistnevnte har fordelen av ekvidistante gapene mellom alle nabo microposts. Typiske microposts hahar et sirkulært tverrsnitt, og deres dimensjoner i området fra 1,0 um til 10 um i diameter og 2 til 50 pm i lengde. ⁴ er imidlertid microposts med elliptisk eller kvadratisk tverrsnitt, er også rapportert. ^12,13

Bruken av PDMS-baserte silikonblandinger som micropost materiale gir mulighet for å legge til nanopartikler i blandingen. For eksempel legge kobolt nanostaver gjør en magnetisk aktivering av micropost og dermed gir en annen grad av frihet til potensielle eksperimentelle design. ¹⁴ De fleste grupper produsere sine micropost arrays på flate stive underlag som cover glass eller inne i en petriskål. Men Mann og medarbeidere har nylig rapportert en micropost matrise dannet på en elastisk membran. ¹⁵ Dette tillater bruk av celle strekker styrker til adherente celler mens du studerer levende celle subcellulær dynamisk respons i form av celle kontraktilitet.

Den mye brukt og mest estabblert fremgangsmåte for fremstilling av micropost matriser er basert på myklitografi som beskrevet i de innsikts protokoller Sniadecki og kolleger. ^16-18 I korte standard renrom prosesser blir brukt til å generere mikrostrukturene på toppen av en silisiumskive ved hjelp av SU8 fotoresist. Dette etterfølges av en kopieringsprosess, karakterisert ved at silikongummien er støpt over strukturene overføre dem i formene. I et annet trinn i disse formene blir brukt til å gjenskape den opprinnelige mikrostrukturen ved hjelp av silikongummi på toppen av et valgt substrat. Men til tross for den store og økende antall publikasjoner knyttet til deres søknad, etablere en produksjonsprosess for microposts tar mye tid selv for micro-engineering eksperter; Det er mange prosesstrinn som krever optimalisering og tilpasning til den spesifikke laboratoriemiljø og micropost oppsett for å gi et akseptabelt kvalitetsnivå.

Kommersielle micropost arrays er nå tilgjengelig i en ready-tformat o-bruk ("off-the-sokkel") med en gjennomgående høy kvalitet. Slik de er et alternativ til det komplekse og lange produksjonsprosessen som kreves for produksjon på stedet. I dette papiret et kommersielt tilgjengelig micropost rekke ble brukt for å kartlegge celle krefter ved hjelp av en enkelt lys-felt mikroskopi bilde. Enda viktigere denne artikkelen beskriver og dokumenterer en fullt funksjonell åpen kildekode programvare kalt MechProfiler, som er tilgjengelig for nedlasting som supplerende materiale til dette manuskriptet. Et aktivt opprettholdt versjon av programvaren kan også bli funnet på http://www.orthobiomech.ethz.ch.

Kombinasjonen av en "off-the-sokkel" analysen og en kompatibel open-source analyse programvare markert senker inngangs hinder for å oppnå nøyaktige TFM eksperimenter. Forskere uten tilgang til enten rene romfasiliteter eller programvare utviklingskompetanse kan analysere cellulære krefter vellykket. Det gjør det mulig for en bruker å fokusere på mechanosensitivity analysen utgang snarere enn teknologien i seg selv, og gjør trekkraft målinger tilgjengelig for et bredere fellesskap. Videre er dette et viktig skritt for å bane vei mot helautomatiske screening av micropost arrays.

Den MechProfiler analyse programvare behandler bilder i filformatet TIFF, PNG, BMP og jpg. Bildene kan tas med fluoresens, fase kontrast eller lyse-feltet lysmikroskopi. Den frittstående program kjøres sammen med den frie Matlab Compiler Runtime (tilgjengelig på: Figur 12) og underliggende algoritmer tillate for strømlinjeformet bildebehandling, som gjør det mulig å behandle bilder med én eller flere celler i ca 1 min. Videre kan disse cellene enten levende eller "fast".

Den MechProfiler programvaren er i stand til å øke gjennomstrømningen av data-analyse ved å stole på reproduserbarheten av kommersiell kvalitet micropost matriser, mer spesifikt, standard & #8220, som ikke er forandret retning "posisjonen til hvert innlegg i matrisen kan antas mot en ideell grid (produksjonsavvik for rutenettet i arrays brukes for denne studien var mindre enn 100 nm).

Kort sagt en åpner et utvalg av bildefiler for analyse, beskjærer dem til regionen av interesse, definerer de innleggene som omfattes av celler eller som må kastes, bestemmer legg posisjoner, beregner nedbøyninger / krefter mot den ideelle rutenett, og til slutt lagrer alle cellespesifikke data med en mulighet for eksport, blant annet til en standard office regneark.

Protocol

1. Dyrknings Cells om Micropost Arrays

Merk: Alle trinn må utføres i en biosikkerhet skap for å sikre sterilitet. De oppgitte volumer er for T25 cellekulturflasker. Cellekulturmediet oppskrift og celletettheten poding er optimalisert for ben kreftcellelinjer HuO9 og M132.

1. Forberede en cellekultur for seeding på en micropost array.
   1. Inspisere kvaliteten cellekulturen ved å plassere kulturflaske på et standard lysmikroskop. Sørg for at cellene viser en typisk vekst og morfologi ved å estimere hvor mye av kulturen kolben bunnen er dekket. En dekning på 70% -80% reflekterer en sunn vekst. Ta hensyn til mengden av flytende celler som representerer de døde celler, og / eller en overgrodde kultur.
   2. Cellene trypsineres ved fjerning av medium og vasking med 4 ml 1 x fosfatbufret saltvann (PBS) buffer. Legg 0,8 ml 1 x Trypsin / Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA) og inkuber ved romtemperatur inntil cellens dislodge, som tar ca 2-4 min. Sjekk prosessen med mikroskopet og tidvis trykk på flasken forsiktig for å støtte den løsner.
   3. Tilsett 5 ml cellekulturmedium (Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) / F12 med 10% føtalt bovint serum (FBS), 1% penicillin / streptavidin (Pen / Strep)) for å stanse reaksjonen og for å vaske ut gjenværende celler som fortsatt sitter på kolben bunnen. Deretter ble denne suspensjon pipettere opp og ned flere ganger for å oppnå en homogen blanding. Sørg for å pipettere alle løsninger på tvers av den opprinnelige vekstområde av kolben for å få en effektiv løsner.
   4. Overfør cellesuspensjonen i et 15 ml rør og sentrifuger den ved hjelp av en bordsentrifuge ved 0,5 xg i 3 min.
   5. Fjern supernatanten og re-suspen cellepelleten i 5 ml medium ved å pipettere opp og ned 5 ganger. Sørg for å unngå dannelse av bobler mens du gjør det.
   6. Bestemme celletetthet ved å benytte en celletellekammer og en lett mikroskop,pe. Kontroller cellesuspensjonen i cellen tellekammer for celleaggregater og sørge for å ha bare enkeltceller for den etterfølgende forsøk. Pipetter en gang opp og ned flere ganger hvis celler har en tendens til å danne aggregater for å skille dem fra hverandre.
   7. Fortynn cellesuspensjon med tilstrekkelig medium til å få en celleløsning på 25.000 celler / ml. Bland godt ved å snu den lukkede røret flere ganger.
2. Forbered en micropost matrise for celle seeding.
   Kritisk Merk: Ikke pipetter på micropost rekke direkte som dette kan potensielt skade microposts, spesielt når uønskede bobler er innført. Videre sørge for at micropost matrisen aldri tørker ut som oppstår kapillarkreftene føre til kollaps av microposts.
   1. Plasser glassubstratet med micropost matrisen vender opp i en brønn av en 12-brønns plate ved anvendelse av en pinsett og våt det ved tilsetning av 1 ml etanol (99%). Inkuber ved RT i 20-30 sek.
   2. Fortynne etanoltrinnvis ved å tilsette ca. 1 ml sterilt deionisert vann (DI vann) på brønnsiden og aspirering omtrent 1 ml ved å bruke en overførings pipette eller aspirasjon enhet. Gjenta dette trinnet minst 3 ganger.
   3. Sett på DI-vann med PBS-buffer på samme måte ved tilsetning av aspirering og ca 1 ml. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
   4. Sett på PBS-buffer med medium ved å legge til og aspirere ca 1 ml medium. Gjenta dette trinnet 3 ganger.
3. Pipette 1 ml celleløsning (25.000 celler) på toppen av hver forberedt micropost array. Close multi-brønn plate og overføre den til en inkubator (5% _CO2, 37 ° C). La cellene holder seg og vokse på toppen av microposts for 6 -7 hr.
4. Inspiser vedheft prosessen tidvis ved hjelp av et lys et mikroskop. Sjekk at de fleste av cellene vises spredt ut over flere microposts.

2. Feste & Farging Cells

Merk: Alle trinn ogvolum som er oppgitt her er for en enkelt brønn av en 12-brønns plate. Det anbefales å behandle ikke mer enn fire av de tolv brønner i en tid for å unngå uttørking av brønnene etter aspirasjon av en hvilken som helst væske, noe som vil resultere i en kollaps av microposts.

1. Aspirer medium fra brønnen og vaske cellene 2x med 1 ml PBS-buffer. Sørg for å bruke en mild kraft mens vaske med PBS for å fjerne cellerester som samlet seg på micropost matrise under inkubasjon og å løsne døde celler.
2. Fiksere cellene med 0,5 ml 3,7% bufret formaldehyd-oppløsning i 5 min.
3. Sett på formaldehyd løsning ved å vaske micropost array-2x med 1 ml sterilt DI vann.
4. Flekk cellene med fargestoffet (0,05% Coomassie Brilliant Blue i 50% vann, 40% etanol og 10% eddiksyre) i omtrent 90 sek. Vask overskudd fargeløsning av 2 ganger med 1 ml sterilt avionisert vann. Tilsett 1 ml DI vann til micropost array.
5. Sjekk farging resultat ved hjelp av et lysmikroskop. Gjenta tHan flekker skritt, hvis celle kroppen er for svak til å bli visualisert.
6. Butikken micropost arrays med de fargede celler på toppen i kjøleskap ved 4 ° C. Sørg for å holde dem under vann til alle tider.

3. Cell Imaging

Merk: Trinn 4 gjelder bare for mikroskoper uten uendelig korrigert optikk.

1. Tilsett 2 ml DI-vann til en petriskål med et tynt glassbunn for avbildning med høy oppløsning.
2. Overfør micropost array ved hjelp av en pinsett inn i bilde fatet med microposts vendt opp.
3. Plasser bildepetriskål på en bevegelig fase av et lysmikroskop.
4. Vri kompensasjonsringen av linsen som brukes for avbildning til nummeret på skalaen representerer den totale tykkelse av alle materialer langs den optiske banen for å kompensere for mistilpasning i brytningsindeksene for glasset underlaget, silikon elastomer og væsken på toppen. Dette bør føre til et lyst utseende på micropostskjerner.
5. Lukke iris på belysning side ned til 50% og fjerne eventuelle ringer fase kontrast fra den optiske banen slik at en vanlig lyse-feltet modus.
6. Juster micropost matrise som de microposts danne en horisontal linje over observasjonsfeltet. Definere et startpunkt (f.eks øverst til venstre) og flytte petriskål trinnvis over scenen skanne micropost matrise mens du tar mange bilder.
7. Ta alle bilder med den høyeste innstillingen for oppløsning for kameraet med en 20X eller 40X objektiv. Sikte på å ha en eneste celle i midten av bildet.
8. Feie langs z-aksen gjennom underlaget inntil micropost tipsene er i fokus. Bruk finjustering fokushjulet av mikroskopet og slå den mot å fokusere på micropost bunnen for ca 2-3 mikrometer.
9. Etablere en standard bilde prosedyre ved å ta rekke testbilder av ett array seksjon feiing gjennom bildeparametere ett om gangen (f.eks, eksponeringstid,iris innstilling, lampe innstillinger etc.). Analysere bilder med MechProfiler og finne en passende parametersettet for en rask og pålitelig analyse.

4. Bildeanalyse med Open Source Software "MechProfiler"

Merk: Alle programvarefunksjoner kan aktiveres med en pekeenhet med venstre museknapp. Imidlertid vil en trent operatør bruke de dokument hurtigtaster designet for å være på den venstre halvdelen av tastaturet for å muliggjøre en effektiv to-hånds bildebehandling.

1. Starte bildeanalyse programvare MechProfiler og åpne en rekke bilder som må analyseres ved å klikke "Open".
2. Sett alle parametere i "Innstillinger" -delen gitt av programvareutvikleren. Bestemme parametrene som må tilpasses etter (dvs. kontur terskel og minimal avstand) i henhold til prosedyrene beskrevet i detalj av programvaren manuell.
3. Analyser bildes én etter én ved å beskjære dem til området av interesse ved å bruke "Crop" (klikk og dra med museknappen trykkes ned). Dobbelklikk inni trukket rektangel for å fullføre denne handlingen.
4. Merking hver synlig celle omrisset én etter én ved å klikke på "Tegn celle skisserer" og bruke den korset markøren for tegning inkludert alle microposts cellen er festet til.
5. Kast eventuelle uønskede microposts ved å klikke på "Kast innlegg" og bruke korset markøren for å tegne. Legg ved alle microposts som tilhører en celle utsiden av bildeseksjonen eller som avbøyes av andre grunner, men ikke av cellen av interesse.
6. Start programmet subrutine "Finn centroids" ved museklikk. Juster filter sitter rett ved siden av "Finn centroids" -knappen til alle microposts er registrert, noe som er synlig ved et rødt kors i sitt sentrum. Hvis filteret er for lav microposts vil bli ignorert, hvis den er for høy multiple stillinger vil bli merket for en enkelt micropost. Hold filteret sette konstant under en analyse økt.
7. Bruk manuell redigering funksjon "Manual Edit" for centroids med flere eller savnet micropost stillinger. Bruk musen kors å velge micropost i spørsmålet ved å klikke og dra den over. Dobbelklikk inne i rektangelet og plassere den manglende rød markør i forstørret utsnitt bildet, som automatisk stenger. Forkaste en slik micropost hvis det er utenfor trukket cellen omrisset (se trinn 4.5) før du fortsetter.
8. Finn den perfekte micropost rutenettet ved å aktivere "Generer Grid" -funksjonen med et museklikk. Sikre posisjonen korresponderer med den sanne micropost hodet, vist med en blå ring inne i cellen trekkes omriss.
9. Korrigere eventuelle feilplassert grid maker inne i celleområdet der det er nødvendig å bruke den tilsvarende "Manuel Edit" -funksjonen med et museklikk. Bruk korset for å velge micropost i question ved å klikke og dra den over. Dobbelklikk inni vises rektangel og plasser den savnede blå markøren i forstørret utsnitt bildet, som automatisk stenger.
10. Bruk knappen "Beregn nedbøyninger" ved museklikk for å få et histogram av de beregnede nedbøyning verdier basert på forskjellen mellom en micropost posisjon inne i bildet delen og den genererte ideelle rutenettet.
11. Redd fullstendig analyse inkludert bordene av verdier ved et museklikk på "Lagre".
12. Bildeanalyse fortsette enten ved å klikke på "Reset View" og analysere et annet bilde seksjon eller museklikk på "Neste bilde", som beleilig kan gjøres ved hjelp av høyre tastaturet curser tast.

5. Data Analysis - Mechanoprofiling

1. Åpne filen "results.xls" med et kontor regnearkprogram fra mappen med de analyserte bildene. Den inneholder data med all beregnede verdiene inkludert alle micropost nedbøyninger og standard avledede tiltak som arbeid (dvs. underlaget deformasjon energi) av analysert cellen.

Representative Results

Den største fordelen med den beskrevne teknikk ligger i dens enkelhet og potensialet for rask og effektiv integrering i rutinelaboratoriearbeid. Kombinasjonen av høy kvalitet kommersielle sensor arrays forbundet med åpen kildekode gir informasjon om mekanisk-følsomhet som ellers ville krever tilgang til renrom fasiliteter og inngående kjennskap til bildeanalyse og programvareutvikling. Figur 1 viser arbeidsflyten i fremlagt metoden. Det starter med å utarbeide og såing celler på micropost array. Etter festing og farging av celler micropost arrays er klare for bildebehandling. Den sentrale delen av teknikken er den bildeanalyse ved hjelp av MechProfiler programvaren. En bruker kan starte analyszng bilder umiddelbart etter inn alle relevante parametere i "Innstillinger" av GUI. Den tilsvarende pikselstørrelse er lengden som er representert ved en enkelt piksel og avhenger av brukerens oppsett. Den trengerskal etableres separat for hver brukte forstørrelse ved å ta bilder av objekter med kjent størrelse. Et eksempel er gitt i den supplerende figur 9.

Bildekvalitet er en viktig faktor som det sterkt påvirker analyseprosessen. For å oppnå den høyeste kvalitet bør man sørge for å ha en stabil og rutinemessig betjent bildeplattform som vist i figur 2. Spesielt, er justeringen av lyskilden viktig som forskyvning vil føre til uønskede skygger som kan være problematisk når analysere bilder. Videre plasserer lysmikroskop på toppen av en anti-vibrasjonsbord eller plate er fordelaktig i de fleste laboratorier som det gir ytterligere stabilitet under avbildning.

Fordelene med å bruke en tynn glassbunn petriskål for bildebehandling inkluderer høyere effektive numeriske blenderverdier som oversettes til lysere bilder med økt oppløsning.

Når taking bildene i lyse-feltet modus en 50% lukkede iris anbefales, da med fokus på microposts tips lettes på grunn av omkretsen som fremstår som en skarp mørk ring. Videre, i tilfelle brukt objektiv har en kompensasjon ring, er det viktig å sette den på riktig måte for å oppnå nøyaktige styrkeavlesninger. Virkningen av dette trekk kan sees ved å sammenlikne Figur 3A og figur 3B. Bilder som kan analyseres raskt oppnås ved å kombinere den riktige innstilling av kompensasjonsringen sammen med optimal belysning som vist i figur 3C. Sterk kontrast mellom en micropost og dens omkringliggende reduserer analyse tid som det hastigheter søkingen algoritmen. Brukerne vil finne at bare minimal erfaring er nødvendig for å oppnå bilder som kan analyseres med letthet.

Viktigere, protokollene ovenfor vinne en kritisk og felles hinder for rask og effektiv integrasjon av micropost arrays inn rutinelaboratoriearbeid. Denne hindring stammer fra behovet for å kontrollere matrise kvalitet - et krav som er oppnåelig bare ved grundig og detaljert eksperimentell karakterisering av sensor reproduserbarhet, følsomhet og nøyaktighet. Men ved å slå til kommersielt tilgjengelige micropost arrays dette betydelig hinder er helt unngås. 4A og 4B illustrerer nøyaktigheten av en slik micropost array. Avviket på microposts posisjon er godt under 200 nm og som sådan kan sammenlignes med en "pixel-feil" som følger med kamera / objektiv kombinasjon som resulterte i en pikselstørrelse på 82 nm for brukt oppsett. Analysen av bilder med celler avbøyende de microposts viser at verdiene for en celle pålagt nedbøyning er vesentlig høyere enn 200 nm (som vist i figur 4C og 4D figur) som fører til et passende signal til støyforhold.

Figur 5 anskueliggjøreses de forskjellige typer kamper for microposts innenfor et bilde avhengig av om det er forandret retning eller ikke. Som nevnt ovenfor er ikke-avbøyd microposts har en lys sirkulært utseende med en mørk ring rundt dem. Deres posisjon kan bestemmes ved hjelp av en Hough transformasjon, som er en funksjon ekstraksjon teknikk for digital bildeanalyse.

Videre viser det at avviks microposts på en invertert mikroskop viser to motstå mørke halvmåne former (se Figur 5A). I oppreist mikroskop kanten av micropost tips og en mørk halvmåne form er skikkelig synlig mens den andre blir vanskelig å oppdage. Disse egenskapene er grunnlaget for beregning av posisjonene til lyse feltet mikroskop bilder av tipsene fra avbøyde microposts, som har blitt utviklet for denne protokollen, og ble kåret til "Contour Approach".

Figur 5B er et eksempel på en HuO9 benkreftcelle på microposts fotografert på en invertert mikroskop (øverst). Den analyserte versjon av det bildet viser resultatene fra den anvendte kontur tilnærming (nederst). Figur 5C ble tatt ved hjelp av samme micropost array med en oppreist mikroskop (øverst). Igjen analyserte versjonen viser resultatene fra bruk av konturen tilnærming.

Hver bildeanalyse session starter med en bruker verifisering av parametrene i "Innstillinger" -delen av MechProfiler. Noen er gitt av micropost produsent som micropost array-dimensjoner og våren konstant. Andre er definert av brukeren for eksempel verdiene for konturen terskel og en minimal nedbøyning terskel i henhold til prosedyrene som er beskrevet i programvarehåndboken. Det er imidlertid viktig å merke seg at disse verdiene bør velges nøye og må være konstant for alle bildene i et innbyrdes forbundet sett av bilder for å sikre sammenlignbarhet. Mens de pre-behandlingstrinn for bildet analyseverktøs, som beskjæring, er selvforklarende underliggende strategier for programvaren fungerer som "Finne centroids", "generere Grid" og "Contour Approach" trenger mer detaljerte forklaringer.

Algoritmer for avdekking av standard micropost stilling (som leveres av produsenten) begynner ved å bruke "Finne centroids" software funksjon. Algoritmen starter i øverste venstre hjørne av et bilde som søker etter den første micropost. Deretter ble alle andre microposts blir funnet basert på koordinatene for det første micropost pluss verdiene for risten og micropost størrelse oppgitt av produsenten å følge den sekskantede geometri. Tyngdepunktet for hver fant micropost beregnes ved hjelp av en Hough transformasjon. Filteret glidebryteren ved siden av kommandoknappen av GUI tillater å justere følsomheten av denne transformasjonen. Alle funnet microposts er merket med et rødt kors og deres posisjoner kjent for subsequent prosesser.

Deretter fører "Generer Grid" -funksjonen til koordinatene for alle microposts tips. De er resultatene fra en flertrinnsprosess. Først en optimaliseringsfunksjonen er løst blant de første posisjonene fra den tidligere utført "Finn centroids" algoritme for å etablere den ideelle rutenettet. For det andre posisjonene av microposts inne i celleområdet beregnes. Microposts med mindre utslag enn definert i innstillingen parameter "Minimum deflection terskel" i forhold til den ideelle rutenettet blir behandlet med en Hugh transformasjon. Alle andre micropost tippe posisjoner er beregnet ved hjelp av den ovenfor beskrevne kontur tilnærming for avvik microposts. Her programmet begynner å søke fra den første geometriske tyngdepunkt bort fra cellen sentrum for en sirkulær kant (lys til mørk) i en vinkel på 15 ° (se figur 5A). Når den kanten er funnet en sirkel med den gitte micropost diameter er montert til that kanten med konturen terskelverdien fra innstillingene i GUI. Det parameter som bestemmer piksel grå verdi blir benyttet for tilpasningsprosessen. Jo høyere denne verdien er mer tilpasnings lener seg mot den lysere micropost midt lavere som verdsetter mer det passer at sirkelen til mørkere micropost disposisjon. Når du har valgt at verdien skal være konstant for alle bildeanalyser innenfor en gitt studie for å unngå å legge kunstig nedbøyning eller ringe nedbøyninger for konservativt.

For eksempel viser figur 6 illustrerer viktigheten av å bestemme for en passende kontur terskelverdi. Programvaren lar brukeren velge for et bredt spekter (0,1 til 0,9) til å omfatte alle fysisk mulige situasjoner belysning. Oversettelsen av den optiske informasjon i nedbøyning avstandene for begge ytterpunkter og en mer praktisk verdi i midten er vist i figur 6B. Men trente programvare brukere ofte konvergerendee til tilnærmet samme kontur terskelverdier, som fører til sammenlignbare resultater som kan sees i figur 6C. Videre bruker standardiserte prosedyrer for cellefarging og bildebehandling minimerer risikoen for ugyldige kontur terskelverdier, som generelt bør holde konstant innenfor for innbyrdes sett av bilder.

For å demonstrere robustheten av fremgangsmåten et utvalg av mekanisk-profilerings Resultatene er oppsummert i figur 7. I figur 7A to resultater fra benet kreftceller HuO9 og to fra M132 sammenlignes. Alle fire arrays er fra samme produksjonsparti, og derfor har identiske mekaniske egenskaper. Analysen ble utført med et fast sett med parametere for minimal nedbøyning (0,25 um), og etter konturen terskel (0,125). I tillegg ble to identiske sett av bilder fra Saos to bein kreft gitt til to analytikere uten ytterligere informasjon om parameterinnstillingene (se Figur 7B). Påvirkningen av fargingen på analysen ble testet ved å ta bilder av ben kreftceller farget med Coomassie Blå R. Deretter fargestoffet ble fjernet. Etter re-farging med Coomassie Blå G et andre sett av bilder ble tatt. Figur 7C illustrerer resultatene fra begge seriene, som ble analysert ved hjelp av samme bruker med identiske verdier for minimal nedbøyning (0,25 um), og konturen terskel (0,25) .

Et typisk eksempel på anvendt mekanisk-profilering er presentert i figur 8A, karakterisert ved at den kompilerte data presenteres for de ben kreftcellelinjer HuO9 og M132 etter å ha analysert 151 celler samlet fra hver av de fire rekker. I denne oversikten alle indikatorverdier er høyere for HuO9 enn for M132 allerede indikerer at HuO9 celler bruke mer makt enn M132. Men dataene fra bildeanalyse inneholder en stor mengde ekstra encellet informasjon som kan være minelagt for å bedre forstå phenotypic cellelinje oppførsel og celle-til-celle variasjon innenfor en gitt linje. Ved å presentere resultatene for kraft per micropost i et boksplott finner man at til tross for lignende este og lengste, er dataverdier ulikt fordelt, og faktisk den lave metastatisk cellelinje HuO9 celler har en tendens til å bruke mer makt enn den svært metastatisk M132 linjen (se Figur 8B). Videre, ved å kategorisere kraftverdiene med hensyn til celleområde finner man at den gjennomsnittlige kraft pr celle ikke bare forhøyet i HuO9 celler i forhold til M132, men også at den gjennomsnittlige kraft pr micropost øker etter hvert som cellene spres inntil gjennomsnittlig kraft pr legg delene en mer stabil verdi (som kan sees i figur 8C). Videre for celler som omfatter syv microposts verdiene er nesten identiske, noe som sannsynligvis skyldes det faktum at de vanligvis vises i heksagonal form med en sentral ikke-avbøyd micropost uavhengig av deres cellelinje. Bortsett fra diffranser i kontraktilitet, kan morfologiske forskjellene kvantifiseres med interessant resultat. For eksempel i motsetning til de svært metastatiske M132 celler var det svært få HuO9 celler som dekket bare tre microposts. Andre morfologiske sammenligninger mellom cellelinjer kan bli gjort, herunder fordeling av celleområdet representert ved antallet microposts dekket. Figur 8D illustrerer at de to cellelinjer også variere i dynamisk spredning oppførsel når det vokser på toppen av microposts. Kort sagt, den mechanoprofile for foreldrecellelinje HuO9 avslører at de vanligvis dekke et større område og bruke litt mer kraft til microposts mens den metastatisk cellelinje M132, en aggressiv celle som stammer fra HuO9, karakteristisk dekker færre microposts og gjelder mindre kraft per micropost . Disse resultatene viser potensialet for en TFM basert tilnærming for diskriminerende applikasjoner.

Figur 1. Experiment Workflow. (A) Den generelle prosedyren inneholder fem påfølgende store skritt fra seeding celler på en micropost array å profilere sine mekaniske egenskaper. (B) Bildet Analysen er utført med den beskrevne MechProfiler programvare. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2. Imaging oppsett. En standard invertert mikroskop brukes til å avbilde celler på micropost arrays. Oppsettet inneholder også et mikroskop kamera og kontrolleren, som også kan gi datalagrings funksjoner. Den store skjermen vises, ikke er avgjørende, men likevel er praktisk for utvidede bildeøkter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3. Retningslinje for micropost bildebehandling. (A) Bilde av fargede celler på en micropost matrise tatt med en 40X objektiv i lyse-feltet modus. Ikke-avbøyde microposts vises som mørke ringer når avbildes. Avbøyd innlegg anta en elliptisk form med både mørkere og lysere under regioner. Fargede celler som dekker microposts gjør dem ser enda mørkere til det punktet at det ikke er noen motsetning mellom micropost og celle. (B) identiske bilder tatt etter justering av linsekompensasjon ring og re-fokusering. Her kjernene til microposts blir vesentlig lysere og gi mer kontrast. (C) Den samme posisjon avbildes igjen etter adjusting alle parametere belysning med kameraet kontrolleren. De fritt stående microposts fremstå som lyse sirkler med en mørk ring. Avbøyd microposts viser en tydelig halvmåne "skygge" rundt bukta kjernen langs trekke aksen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.>

Figur 4. MechProfiler skjermbilder av analyserte microposts. (A) Et typisk eksempel på en tom micropost utvalg kan sees i dette skjermbildet. De microposts er anordnet i en konstant sekskantet mønster. (B) Et histogram med blokker de verdier for disse microposts viser at alle verdier er under 200 nm. (C) Typisk eksempel på en HuO9 benkreft celle dekkerog trekke på flere microposts. Det kan sees at mengden av trekking er heterogen. (D) Histogrammet med nedbøyning verdier for HuO9 cellen viser det brede spekteret av nedbøyninger som oppstår fra cellenes interaksjon med micropost underlaget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5. Micropost opptredener i lyse-feltet belysning og strategier for beregning av sin posisjon i et bilde. (A) for ikke-avbøyes microposts fremstår som en lys sirkulært område med en mørk ytre ring. Det geometriske tyngdepunkt beregnes ved en Hough transformasjon. Avbøyd microposts viser mørke halvmåne former. Avhengig av mikroskop oppsettet dersom microposts møte ligh t kilde (for eksempel invertert mikroskop) er det to godt synlige halvmåne former. Dersom microposts møte objektivet (f.eks oppreist mikroskop) er bare en halvmåne godt synlig, men også helt i utkanten av spissen. I begge tilfeller bør brukes konturen tilnærming for å beregne micropost spissen. (B) Et originalbilde (øverst) ved hjelp av et invertert mikroskop fra en HuO9 benkreft celle og dens analysert versjon (bunnen) ved hjelp av konturen tilnærming. (C) Opprinnelig bildet fra samme micropost array (øverst) ved hjelp av en oppreist mikroskop og analysert versjon, igjen påføring av konturen tilnærmingen (nederst), men med en mye lavere kontur terskelverdi mer egnet for å kalle den mørke ringformede kant. Vennligst Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

laste / 53350 / 53350fig6.jpg "/>
Figur 6. Konturen tilnærming, og å velge den passende terskelverdi. (A) De tre skjerm illustrerer de samme som ble analysert ved hjelp av tre forskjellige microposts kontur terskelverdier. Hvis verdien er satt enten for lav (venstre) eller for høy (høyre) enn programvaren passer den blå ringen som representerer micropost hodet feil. Det undervurderer eller overshoots den virkelige plasseringen av micropost hodet. En riktig valgt terskelverdi gjør det mulig for programvare for å passe den blå ring til den halvmåneformede mørke området inne i micropost som dannes gjennom avbøyning. (B) Grafen viser gjennomsnittlig antall nedbøyninger avhengig av valgt kontur terskelen for microposts vist i ovenfor. Det illustrerer også at verdiene for de microposts utenfor cellen disposisjonen ikke er berørt siden konturen montering ikke er brukt der. (C) Grafen viser at valgen terskelverdi innenfor et moderat intervall minimalizes risikoen for over- eller undervurdere micropost nedbøyninger. Forskjellen mellom verdiene valgt av forskjellige opplærte brukere er normalt mindre enn 0,05, noe som resulterer i akseptable forskjeller i gjennomsnitts deflection verdier. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 7. Robusthet test for mekanisk-profil resultater fra ulike bein kreft cellelinjer; de feilfelt representerer ett standardavvik (A) Mekano-profilering resultater fra fire identiske micropost arrays etter såing HuO9 celler på rekke 1 og M132 på rekke 3 -. fire dager senere seeding HuO9 på rekke 2 og M132 på rekke 4. (B) Sammenligning av resultater fra mechano-profilering basert på identiske sett av bilder etter analyse av to uavhengige analytikere. (C) Sammenligning av bildeanalyseresultater fra to forskjellige bildeserie første tatt etter farging med Coomassie Blue R og den andre etter fullstendig fjerning av fargestoff og re-farging med Coomassie Blå G. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet .>

Figur 8. mekano-profilering av ben kreftcellelinjer. (A) En sammenligning mellom de to bein kreftcellelinjer HuO9 (lavt metastatisk potensiale) og M132 (sterkt metastatisk) Grafen viser at alle indikatorverdiene er høyere for HuO9 cellelinje ( Totalt N = 302; to uavhengige sett med eksperimenter, error bar = standardavvik). (B trong>) Boksplottet viser at de påførte krefter per micropost er i nedre nano-Newton-serien. Men HuO9 celler trekke mer enn M132 celler (Whiskers representerer minimum data og maksimum). (C) Et lignende resultat kan sees ved sammenligning av celler som dekker det samme antall microposts. HuO9 celle bruke mer makt enn M132 celler. Antallet HuO9 celler som dekker tre microposts ikke er representativt og bare tatt for fullstendighet (error bar = standardavvik). (D) De ulike distribusjoner over antallet som omfattes microposts viser at hvert bein kreft cellelinje har sitt eget sprer karakteristiske når vi samhandler med micropost arrays. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

ppfig9.jpg "/>
Supplerende Figur 9. pikselstørrelsen for et mikroskop oppsett er vanligvis bestemmes ved hjelp av en spesiell objektglass med en skala bar på det; alternativt micropost rekke layout, gitt av produsenten kan brukes. For eksempel, 15 enheter med 13 my (195 mikrometer total lengde) delt på 2375 piksler (etablert med et bildebehandlingsverktøy) fører til 0,082 mikrometer / pxl. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende Figur 10. Sammenligning av bilder av en HuO9 benkreft cellen tatt fra den samme stilling ved hjelp av to belysningsteknikker i et invertert mikroskop; Dio farget microposts er grønne fluorescerende. (A lyse-feltet modus. (B) analyserte jeg Mage tatt etter bytte til grønn fluorescens kanal uten omstilling.   (C) Second fluorescens bilde etter å ha rettet fokus til de aller micropost tips. (D) Overlay av både belysning kanaler for illustrative formål.   (E) Mekano-profilering indikatorer som resultatene fra de tre bildene. Til tross for å korrigere fokus på fullt utslag kan ikke anslås utifra fluorescens bildene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende Figur 11. Bilde sekvens i samme stilling fluorescently farget microposts bruker Dil på en oppreist mikroskop (A) Bright-feltet image.; det er tre microposts berører hverandre på spissen. (B) Samme stilling etter å bytte til den fluorescerende kanalen litt over microposts hoder. (C) Senke fokusplanet til helt i spissen av de microposts. (DE) etterfølgende bilder etter ytterligere senking av fokusplanet trinnvis mot microposts 'bunnen. (F) Bilde av microposts etter senking fokalplanet inne i silikon elastomersubstrat. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Supplerende Figur 12. Skjermbilde av MechProfiler GUI. Typisk analyseresultat fra profilere en HuO9 bein kreftcelle. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Dette arbeidet søker å fremme innen trekkraft mikroskopi av vesentlig senke tekniske og praktiske etableringshindringer. Disse barrierene kommer fra to sider. Først og fremst er de mange ikke-trivielle tekniske utfordringer som må overvinnes for å reproduserbart produsere og eksperimentelt provisjon en micropost array. For det andre, er den tilsvarende ikke-triviell behov for en pålitelig semi-automatisk analyse av enkeltcelle krefter - med tanke på at et typisk forsøk kreve at analysen av hundrevis eller kanskje tusenvis av celler. De ovenfor beskrevne teknikker ble utviklet for å gjøre micropost basert trekkraft mikros tilgjengelig innen cellebiologi laboratorier som ikke har bosatt ingeniørkompetanse. Sensorer og analyseteknikker som presenteres i denne artikkelen bør tillate ikke-eksperter til lett og nøyaktig analysere de kreftene som utøves av enkeltceller.

Bortsett fra tilgang til en cellebiologi lab med minst en middels kvalitet lyse-feltet mikroskop, de beskrevne metodene krever noen ekstra tekniske elementer. Her fleste brukere kan utføre gyldige trekkraft mikroskopi eksperimenter med begrenset erfaring, til tross for kraft og allsidighet av teknikken. Likevel er det tre viktige aspekter i den framlagte protokoll som må vurderes. Først er det nødvendig å sikre at micropost arrays alltid er dekket med væske for å unngå at deres kollaps på grunn av kapillarkreftene. Second man trenger for å optimalisere bildeparametere for ervervet micropost bilder, som gjøres best ved å ta serie bilder av samme matrise posisjon mens varierende eksponeringstid, iris blenderåpning, og kompensasjon ring posisjon. Det er viktig å finne den riktige fokalplanet for micropost spissen, og dette aspektet gjør det ta litt erfaring fått liten dimensjons dybden av sensoroppstillinger. Tredje må man laste ned åpent tilgjengelig bildeanalyse programvare MechProfiler discussed her, for som en detaljert bruksanvisning og opplæring eksempler er tilgjengelig på nedlastingsside. Etter litt erfaring med bruk av programvare for å analysere eksempler som leveres med manuell, skal brukeren ta testbilder på bildeoppsett som skal brukes, slik som å konfigurere egnede mikroskop innstillinger. Basert på de oppnådde bildene, må konturen terskelverdien på lignende måte optimaliseres. En enkelt micropost bilde kan bli analysert av en trenet bruker i løpet av et minutt ved hjelp av open-source MechProfiler programvare uansett om den inneholder en eller flere celler, slik at genereringen av statistisk relevante resultater (analyse av flere hundre celler) i løpet av få timer .

Et annet aspekt som krever litt tuning er optimalisering av alle anvendte cellefarging prosedyren. Når cellene er altfor-farget programvaren kan unnlate å registrere de riktige micropost stillinger. På den annen side hvis farging er for svak krever det mer innsats av brukeren for å oppdage en"True" celle omriss som tynne celle utstikkere kan være savnet.

Imidlertid, ved å anvende en fast protokoll av cellefarging og matrise avbildningsprosedyre området for denne feilen blir akseptabel liten. I løpet av dette arbeidet forskjellige cellefargingsprosedyrer ble testet, på grunnlag av forskjellige konsentrasjoner av krystallfiolett, tilstedeværelse av overflateaktive midler som Tween 20 eller Triton-X, eller en kombinasjon av fargestoffer ved tilsetning av eosin. Ikke desto mindre, til intensiteten av fargingen, så vel som dens stabilitet varierte betydelig fra eksperiment eksperiment. Bare bruk av Brilliant Blue G, som beskrevet ovenfor, viste en akseptabel cellefarging robusthet kombinert med tilstrekkelig intensitet til å fortsatt se den tynne celle omriss, men uten å forstyrre den utviklede kontur tilnærming.

Generelt er det muligheter for å endre den presenteres teknikk. For eksempel ved å kombinere de lyse-feltet teknikkene som presenteres her med fluorescens mikroskopi flekker organellersom kjernen eller aktin filament nettverk, noe som kan gi ytterligere informasjon om de underliggende celleprosesser i sammenheng med celle mekanikk. Videre bruker langkjedede dialkylderi carboxycyanines (Dil eller Dio) de microposts som lyser opp. ¹⁴ Likevel er det viktig å kontrollere hvert avvik fra den presenteres teknikk. De supplerende figurene 10 og Figur 11 illustrerer potensielle fallgruver. Bilder som er tatt av en Coomassie Blå G farget NIH 3T3 fibroblast celle i den grønne fluorescens kanalen (figur 10B og 10C) ved hjelp av det inverterte mikroskop presentere hoved micropost legemene, men ikke sine tips som fører til en defekt posisjon analyse (figur 10E). Til tross for den beste for å refokusere etter bytte fra lys-feltmodus (figur 10A) på micropost tips ikke kan avbildes, som kan være på grunn av absorpsjon av det fluorescens-signalet av cellen flekken. Dette er i motsetning til imaGES tatt med den gule fluorescerende kanalen fra en oppreist mikroskop (figur 11B-11F), karakterisert ved at flere skarpe bilder kan være oppnå langs z-aksen. Her brukeren trenger for å sikre at bildet er tatt med fokusplanet helt på tuppen (figur 11C) og ikke et sted nærmere micropost bunnen for å unngå å ringe feil deflection verdier.

Det bør bemerkes at det også finnes tekniske begrensninger for micropost analyser. For eksempel, nøyaktigheten av en detektert defleksjon er avhengig av kvaliteten på den optiske konfigurasjonen. Mikroskoper er ofte optimalisert for fluorescensavbildning hvori lysfølsomhet koblet kameraet har en høyere prioritet enn et stort antall piksler. Naturligvis, dette fører til bilder med større pikselstørrelse. Videre bør det bemerkes at lys-feltet bilder ikke kan avgjøre om cellefremspring når substratet bunnen. Imidlertid ble de kommersielle micropost arrays testet ved hjelp av konfokalmikroskopi. Det ble funnet at celler som synes å godta den binære belegg som fremmer adhesjon bare på micropost tips og ikke for resten av micropost matrisen. En annen faktor som kommer fra posisjonsfeilen til micropost matrise, som har vist seg å være 0,2 um. Sammen med den gitte fjærkonstant på 2,8 nN / um dette fører til en feil i kraft utlesning av 0,6 nN. En annen begrensning for micropost analyser stammer fra det faktum at de påførte krefter fra microposts deles av flere celler som ikke kan bestemmes. Derfor kan bare isolerte enkelt-celler analyseres. En spesifikk begrensning for det presenterte protokollen stammer fra den korrekte anvendelse av sensitive kontur tilnærming, som krever en viss mengde trening for brukeren for å oppnå pålitelige resultater. Videre, for en hurtigere analyse brukeren skal ta bilder, karakterisert ved at micropost matrisen er innrettet til å danne en horisontal eller en vertikal linje langs kanten av observasjonsfeltet. Despite at programvarealgoritme for å finne microposts innenfor et heksagonalt gitter geometri ikke er begrenset av en rotasjonsvinkel avbildning av microposts mer enn 5 ° av-akse gjør det vanskelig å skjære til en bildeseksjon uten å inneholde ufullstendig microposts, som deretter fører til en sviktende av "Generer Grid" -funksjonen. I et slikt tilfelle kan brukeren bruke den integrerte rotasjonsfunksjonen før man begynner å analysere micropost stillinger.

Den beskrevne metoden ble i hovedsak brukt til å karakterisere to bein kreftcellelinjer, en foreldrecellelinje som heter HuO9, og en avledet svært metastatisk linje denominert M132. I denne sammenheng over seks hundre encellede bildene ble tatt i lysfelt-modus og analysert ved anvendelse av programvaren MechProfiler. Den påfølgende data mining viste at foreldrenes cellelinje HuO9 utøver litt mer kraft og vanligvis dekker flere microposts per celle enn celler fra metastatisk cellelinje M132. Men celleneikke var synkronisert, og derfor i forskjellige faser av cellesyklusen i øyeblikket for fiksering, noe som sannsynligvis bidratt til det brede spekter av resultater. Ved å ta levende celle bilder over tidsperioder på opp til 24 timer, ble det funnet at etter å spre mange celler forblir i sine opprinnelige posisjon mens andre vandrer, spredning, koble og migrere igjen med forskjellige hastigheter (se utfyllende videoer). Dette indikerer at den mekaniske profil av en celle er ofte ikke er konstant og kan variere i stor grad på tvers av en cellepopulasjon eller til og med i en enkelt celle, avhengig av sin nåværende aktivitet. En annen medvirkende faktor kan være at på en micropost rekke en celle er tvunget til å utføre diskrete migrasjons trinn for å nå en annen micropost, noe som er i motsetning til klassisk TFM, der cellene holder seg til flate overflater og kan migrere med minutters trinn. Men for å analysere disse små trinn er det nødvendig å ta fluorescerende bilder av kontaktklebepunkter, noe som krever tilgang til meget avansert microscopes og svært forseggjort bildeanalyse programvare. Likevel, er fordelingen av mekaniske profiler innen større populasjoner fortsatt ofte et særtrekk ved en cellelinje. Således er en high-throughput metode som muliggjør karakterisering av et stort antall celler er viktig. Den manuelle bildeprosessen og åpen tilgang til programvare som presenteres her havner stort potensial for skalering til helautomatiske mikroskop systemer.

Oppsummert en robust trekkraft mikros tilnærming blir presentert som er lett adoptable i et standard cellebiologi lab. Hele arbeidsflyten fra celle seeding til bildeanalyse er enkel og effektiv. Mens protokollen beskrevet her er fullt funksjonell, forbedringer pågår for å tilpasse analyse algoritmer for å kunne også håndtere micropost arrays med ortogonale oppsett og utviklings prosedyrer som forenkler analysen av bildesekvenser fra levende celle bildebehandling. I sammenheng med resultatene for bein kreft celle lines, kan de fremgangsmåter som er beskrevet her kan brukes til å screene celler fra kliniske biopsier for å fastslå hvorvidt slike analyser kan ha prognostisk verdi, slik at klinikere å forutsi metastatisk potensial av vevsprøve celler fra benet kreftpasienter. En slik analyse vil påvirke de terapeutiske strategier. Andre potensielle anvendelser er knyttet til testing farmasøytisk aktive forbindelser på mekanisk aktive celler som glatte muskelceller eller kardiomyocytter, potensielt for å hjelpe til med å etablere en medikamentets effektivitet eller toksisitet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera