Introduction
Ensaios baseados em células sensíveis de Mecano-permitir que células aderentes para investigar, com uma ampla gama de aplicações, que reflectem o papel central que a mecânica pode desempenhar na biologia celular. Estas aplicações costumam se concentrar sobre os mecanismos subjacentes que impulsionam processos subcelulares ou comportamento de células inteiras. Por um lado, os factores ambientais externos tais como a composição da matriz extracelular ou a rigidez da matriz pode afectar dramaticamente a resposta mecânica e biológica de uma célula. 1 O mesmo pode ser observada após a utilização de diversas classes de compostos farmaceuticamente activos, os efeitos dos quais são muitas vezes caracterizados utilizando modelos de cultura de células. 2 sobre as outras propriedades genotípicas de mão, tais como aquelas causadas por mutações genéticas espontâneas ou induzidas experimentalmente, pode induzir alterações acentuadas no fenótipo da célula que estão associadas a alterações na estrutura e na função do citoesqueleto. 3 Estes exemplos têm apenas algumas das muitas possíveistópicos para os quais fenotipagem mecânica de células é relevante, e todos eles foram útil investigado com matrizes micropost.
No momento da redação deste artigo, aproximadamente 200 artigos foram publicados descrevendo a interação célula-micropost. Estas obras discutir aspectos teóricos da micropost princípios de deflexão bem como instruções práticas sobre o seu fabrico. O primeiro artigo descrevendo a interação das células e matrizes micropost flexíveis foi publicada por Tan e seus colegas em 2003. 4 Em contraste com a microscopia de força de tração clássica (TFM), onde os substratos macios contínuas são usadas para estimar a contratilidade de células nanonewton escala, Tan et al. descrito um método utilizando múltiplos feixes verticais espaçados feitas de elastómero de silicone. As principais vantagens desta técnica emergem duas características principais. Em primeiro lugar, a fim de alterar a rigidez célula-substrato resulta uma só precisa de mudar as dimensões, mantendo micropostcaso contrário, a composição do substrato constante e evitando-se assim diferenças de topologia de superfície e química. Segundo microposts atuar como molas individuais que podem ser analisados de forma discreta com força e resolução espacial da ordem de adesões focais individuais e pode reduzir os desafios analíticos que são inerentes à análise análoga por padrão TFM.
Hoje, a gama de aplicações para matrizes micropost excede em muito apenas o mapeamento de forças por algumas células individuais. Por exemplo, Akiyama relata o uso de um tecido isolado a partir de um vaso dorsal lagarta da traça como um actuador para uma matriz micropost, a fim de desenvolver uma potência muscular autónoma micro-robô inseto. 5
No entanto, a maioria das aplicações publicadas de microposts concentraram-se em estudos de condições médicas, como infecção ou câncer. Por exemplo, matrizes micropost têm sido utilizados para estudar a geração de forças de empacotado pili de tipo IV de Neisseria gonorrhcolónias OEA que está associado com cascatas de sinalização reforço infecção. 6 Outros usaram microposts para estudar as células de câncer de mama tratados com compostos farmacêuticos visando o citoesqueleto. 7
Deflexão de um micropost é muitas vezes descrita usando a teoria clássica do feixe para um cantilever com uma carga final assumindo que a célula atribui apenas à ponta da micropost. Aqui, a força F aplicada que provoca uma deflexão δ depende do micropost "rigidez de flexão" e K é calculado por:
(1)
com E, I, e L sendo o módulo de Young, a área de momento de inércia e do feixe de comprimento, respectivamente. No entanto, os resultados de esta equação só dar uma aproximação geral das forças no trabalho desde feixe de corte e dobra, bem como a deformação de substrato não são levados em accontagem. Considerando que microposts são normalmente feitos de material macio, como polidimetilsiloxano (PDMS) à base de borracha de silicone esses fatores precisam ser incluídos. . Schoen et ai demonstraram a existência de um tal factor de correcção com base na relação do micropost (L / D) e do polímero correspondente coeficiente de Poisson v aspecto 8 É dada a.:
(2)
Com o t inclinação (v) ser um coeficiente de inclinação que inclui um parâmetro de ajuste = 1,3 como pode ser encontrado no mesmo artigo:
(3)
Isso significa que a rigidez corrigido de um micropost corr k é o produto da rigidez à flexão pura = k k curvatura e o factor de correcção corrdado por:
(4)
Portanto, os cálculos de força da célula deve ser realizada utilizando a variação mais refinada da equação (1) lendo agora:
(5)
O impacto da correcção torna-se mais evidente, logo que os valores típicos para dimensões micropost são utilizados. Por exemplo, a 15 mícron de comprimento micropost com uma secção transversal circular e um diâmetro de 5 mm feito de borracha de silicone à base de PDMS leva a um factor de correcção de 0,77 e, por conseguinte, um cálculo não corrigido superestimariam as forças exercidas pelas células 23%. Isso se torna ainda mais grave para microposts com proporções menores.
Tradicionalmente, micropost análise de imagem também tem sido baseada na teoria de flexão feixe idealizada. Em 2005, o grupo que foi pioneira no uso de micrmatrizes OPOST publicou um software de análise de imagem adequada para a análise micropost 9 O software exige uma licença de software eo usuário deve tomar três imagens para cada posição.; cada um dos planos superiores e inferiores do micropost em modo de transmissão e outro em modo de fluorescência com a célula corada. Depois de comparar as posições superior e inferior para cada micropost o software determina um campo de força do vetor e calcula os parâmetros relacionados como força por post. Existem outros pacotes de software e os seus princípios de análise são brevemente mencionadas nos artigos correspondentes que os descrevem, mas estes pacotes de software de análise geralmente não estão disponíveis publicamente. 10,11
As matrizes micropost concebidos para forças de células de mapeamento pode ser classificada como sendo uma disposição em micropost ortogonal ou um sextavado, o último dos quais têm a vantagem de todas as aberturas equidistantes entre microposts vizinho. Microposts típicos have uma secção transversal circular e as suas dimensões variam de 1,0 um a 10 um de diâmetro e 2 a 50 um de comprimento. 4 Contudo, microposts com secção transversal elíptica ou quadrado também têm sido relatados. 12,13
O uso de misturas à base de silicone PDMS como material de micropost permite a adição de nanopartículas na mistura. Por exemplo a adição de cobalto nano-hastes permite uma ativação magnética do micropost e, assim, dá um outro grau de liberdade para potenciais projetos experimentais. 14 A maioria dos grupos produzir suas matrizes micropost em substratos rígidos planas como tampa de vidro ou dentro de uma placa de Petri. No entanto, Mann e colaboradores relataram recentemente uma matriz micropost formada sobre uma membrana elástica. 15 Esta permite a aplicação de células alongamento forças para células aderentes ao estudar ao vivo de células subcelular respostas dinâmicas em termos de contratilidade celular.
O estab e mais amplamente empregadocido processo para fazer matrizes micropost é baseado em litografia macia, tal como descrito nos protocolos de perspicaz Sniadecki e colegas. 16-18 em processos de salas brancas curtas normalizados são utilizados para gerar as microstruturas no topo de uma pastilha de silício utilizando fotorresistente SU8. Isto é seguido por um processo de cópia, em que a borracha de silicone é lançada sobre as estruturas transferindo-se em moldes. Num segundo passo, estes moldes são utilizados para replicar a microestrutura inicial utilizando borracha de silicone sobre um substrato escolhido. No entanto, apesar da grande e crescente número de publicações relacionadas com a sua aplicação, estabelecendo um processo de fabricação para microposts leva tempo considerável, mesmo para especialistas micro-engenharia; há muitas etapas do processo que exigem otimização e adaptação ao ambiente de laboratório específico e layout micropost para se obter um nível de qualidade aceitável.
Micropost matrizes comerciais estão agora disponíveis em um pronto-to-uso ("off-the-shelf") formato com uma qualidade consistentemente alta. Como tal, são uma alternativa ao processo de fabrico complexo e moroso necessário para a produção no local. Neste trabalho uma matriz micropost comercialmente disponível foi utilizado para o mapeamento forças celulares usando uma imagem de microscopia de campo brilhante único. Mais importante este artigo descreve e documenta um software open-source totalmente funcional chamado MechProfiler, que está disponível para download como material suplementar a este manuscrito. Uma versão mantida activamente do software podem também ser encontradas em http://www.orthobiomech.ethz.ch.
A combinação de um ensaio de "off-the-shelf" e um software de análise de código aberto compatível reduz significativamente a barreira de entrada para alcançar experimentos precisos TFM. Os pesquisadores não têm acesso a qualquer instalações de sala limpa ou experiência em desenvolvimento de software pode analisar forças celulares com sucesso. Ele permite que um usuário para se concentrar nas mechanosensitivity saída ensaio ao invés de a tecnologia em si, e faz medições de força de tração disponíveis a uma comunidade mais ampla. Além disso, este é um passo importante para preparar o caminho para triagem automática de matrizes micropost.
O software de análise de MechProfiler processa imagens no formato de arquivo TIFF, PNG, BMP e JPG. As imagens podem ser tomadas através de fluorescência, contraste de fase, luz ou microscopia de campo brilhante. O programa autônomo é executado em conjunto com o livre Matlab Compiler Runtime (disponível em: Figura 12) e algoritmos subjacentes permitir o processamento de imagem simplificada, que permite ao usuário processar imagens com células únicas ou múltiplas em cerca de 1 min. Além disso, estas células podem ou ser vivo ou "Fixo".
O software MechProfiler é capaz de aumentar significativamente a análise dos dados de transferência por depender de reprodutibilidade das matrizes qualidade micropost comercial, mais especificamente, o padrão & #8220; não desvia "posição de cada post na matriz pode ser presumido contra uma grade ideal (desvios de fabrico para a grade nas matrizes utilizadas para este estudo foram inferiores a 100 nm).
Num curto abre uma selecção de ficheiros de imagem para análise, as culturas-los para a região de interesse, define as mensagens abrangidos pelas células ou que necessita de ser descartado, determina as posições de pós, calcula as deflexões / forças contra a grade ideal, e finalmente salva todos os dados específicos de celulares com a possibilidade de exportação, incluindo a uma planilha de escritório padrão.
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Protocol
1. As células de cultura em micropost matrizes
Nota: Todas as etapas devem ser executadas em um gabinete de biossegurança para garantir a esterilidade. Os volumes dadas aqui são para T25 frascos de cultura celular. A cultura de células meio de receita e semeadura de células densidade são otimizados para linhas celulares de cancro do osso HuO9 e M132.
- Preparar uma cultura de células para a semeadura em uma matriz micropost.
- Inspeccionar a qualidade de cultura de células, colocando o frasco de cultura sobre um microscópio de luz padrão. Certifique-se de que as células mostram um crescimento e morfologia típicas por estimar quanto do fundo garrafa de cultura é coberto. Uma cobertura de 70% -80% reflecte uma taxa de crescimento saudável. Preste atenção à quantidade de células flutuante uma vez que representam as células mortas e / ou uma cultura mato.
- Tripsinizar as células e por remover o meio de lavagem com 4 ml de solução salina tamponada com fosfato 1x tampão (PBS). Adicionar 0,8 ml de 1x tripsina / ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e incubar a temperatura ambiente até que a células desalojar, que leva cerca de 2-4 min. Verificar o processo com o microscópio e ocasionalmente bater suavemente o frasco para suportar o desalojamento.
- Adicionar 5 ml de meio de cultura celular (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) / F12 com soro a 10% de bovino fetal (FBS), 1% de penicilina / estreptavidina (Pen / Strep)) para parar a reacção e para lavar as células residuais que ainda se sente na parte inferior do frasco. Em seguida, pipetar esta suspensão cima e para baixo várias vezes, para obter uma mistura homogénea. Certifique-se de pipeta todas as soluções em toda a área de crescimento original do frasco para ganhar uma desalojar eficaz.
- Transferir a suspensão de células para um tubo de 15 ml e centrifugar-lo usando uma centrífuga de bancada a 0,5 xg durante 3 min.
- Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento de células em 5 ml de meio por pipetagem para cima e para baixo 5 vezes. Certifique-se evitar a criação de bolhas ao fazê-lo.
- Determinar a densidade celular utilizando uma câmara de contagem de células e um microsco luzpe. Verifique a suspensão de células na câmara de contagem celular para agregados de células e assegurar a ter apenas as células individuais para a experiência subsequente. Pipeta novamente para cima e para baixo várias vezes se as células tendem a formar agregados para separá-los.
- Dilui-se a suspensão de células com meio suficiente para obter uma solução de células de 25.000 células / ml. Misture bem invertendo o tubo fechado várias vezes.
- Prepare uma matriz micropost para semeadura de células.
Nota Crítica: Não pipete para a matriz micropost diretamente, pois isso poderia prejudicar os microposts, especialmente quando as bolhas indesejados são introduzidos. Além disso, certifique-se que a matriz micropost não resseca como ocorrendo forças capilares levar a colapso dos microposts.- Colocar o substrato de vidro com a matriz micropost viradas para cima em um poço de uma placa de 12 poços, utilizando um par de pinças e molhá-lo por adição de 1 ml de etanol (99%). Incubar à temperatura ambiente durante 20-30 seg.
- Dilui-se o etanolpasso a passo através da adição de cerca de 1 ml estéril água desionizada (água Dl) do lado da aspiração e bem cerca de 1 ml, utilizando uma pipeta de transferência ou o dispositivo de aspiração. Repetir esta etapa, pelo menos, 3 vezes.
- Substituir o-água Dl com tampão PBS, do mesmo modo por adição de aspiração e aproximadamente 1 ml. Repita este passo 3 vezes.
- Substituir o-tampão de PBS com meio por aspiração e a adição de aproximadamente 1 ml de meio. Repita este passo 3 vezes.
- Pipete 1 mL de solução de células (25.000 células) na parte superior de cada matriz micropost preparado. Fechar placa multi-poços e transferi-lo para uma incubadora (CO2 5%, 37 ° C). Deixe as células aderir e crescer em cima de microposts para 6 -7 horas.
- Inspecione o processo de adesão, ocasionalmente usando uma luz de um microscópio. Verifique se a maioria das células estão distribuídas em vários microposts.
2. Fixação e coloração de células
Nota: Todos os passos evolumes dadas aqui são para um único poço de uma placa de 12 poços. Recomenda-se a processar não mais do que quatro dos doze poços de cada vez para evitar a secagem dos poços após a aspiração de qualquer líquido, o que resultará num colapso das microposts.
- Aspirar o meio do poço e lavar as células 2x com 1 ml de tampão PBS. Certifique-se a aplicar uma força suave durante a lavagem com PBS para remover os restos celulares que se acumulou na matriz micropost durante a incubação e de separar as células mortas.
- Fixar as células com uma solução de formaldeído tamponada a 0,5 ml de 3,7% durante 5 min.
- Substitua a solução de formaldeído por lavagem das 2x matriz micropost com 1 ml de água DI estéril.
- Corar as células com corante (de 0,05% Azul Brilhante de Coomassie em 50% de água, etanol a 40% e ácido acético a 10%) durante cerca de 90 seg. Lavar o excesso de solução de coloração off 2x com 1 ml de água DI estéril. Adicionar 1 ml de água DI para micropost matriz.
- Verifique resultado coloração utilizando um microscópio de luz. Repita tele coloração passo, se o corpo da célula for muito fraca para ser visualizado.
- Matrizes micropost loja com as células marcadas na parte superior em uma geladeira a 4 ° C. Certifique-se de mantê-los sob a água em todos os momentos.
Imagem 3. celular
Nota: Passo 4 só se aplica aos microscópios sem infinidade corrigido óptica.
- Adicionar 2 ml DI-água para uma placa de Petri com um fundo de vidro fino em alta resolução de imagem.
- Transferir matriz micropost usando um par de pinças para o prato de imagens com as microposts voltado para cima.
- Coloque a imagiologia de Petri sobre uma fase móvel de um microscópio de luz.
- Rodar o anel de compensação da lente utilizada para geração de imagens até que o número na escala representa a espessura total de todos os materiais ao longo do percurso óptico para compensar o desfasamento em índices de refracção do substrato de vidro, o elastómero de silicone e o líquido em cima. Isso deve levar a uma aparência brilhante dos micropostsnúcleos.
- Fechar o diafragma do lado da iluminação até 50% e remover quaisquer anéis de contraste de fase a partir do caminho óptico de comutação para um modo de campo brilhante comum.
- Alinhe a matriz micropost que os microposts formar uma linha horizontal através do campo de observação. Definir um ponto de partida (por exemplo, superior esquerdo) e mova a placa de Petri gradual em toda a fase de varredura da matriz micropost enquanto tomar várias imagens.
- Tire todas as imagens com a configuração de resolução mais alta para a câmera usando uma objetiva de 20X ou 40X. Destinam-se a ter uma única célula no centro da imagem.
- Varrer ao longo do eixo Z através do substrato até que as pontas micropost estão no foco. Use a roda de foco fino ajuste do microscópio e transformá-lo no sentido de centrando-se na parte inferior micropost para cerca de 2-3 mm.
- Estabelecer um procedimento de imagem padrão, tomando série de imagens de teste de uma seção matriz varrendo os parâmetros de imagem uma de cada vez (por exemplo, tempo de exposição,configuração de íris, as configurações de lâmpadas etc.). Analisar imagens com MechProfiler e determinar um conjunto de parâmetros adequados para uma análise rápida e confiável.
4. Análise de Imagem com Open Source Software "MechProfiler"
Nota: Todas as funções do software pode ser ativado com um dispositivo apontador com o botão esquerdo do mouse. No entanto, um operador treinado irá utilizar as teclas de atalho documentados projetado para ser na metade esquerda do teclado para permitir um processamento de imagem de duas mãos eficiente.
- Comece análise de imagem software MechProfiler e abrir uma série de imagens que precisam ser analisados, clicando em "Abrir".
- Introduza todos os parâmetros para a seção "Configurações" dada pelo desenvolvedor de software. Determinar os parâmetros que devem ser personalizada configurada (isto é, limite de contorno e à distância mínima) de acordo com os procedimentos descritos em detalhe no manual de software.
- Analisar imagems um-por-um, cortando-os para a área de interesse, usando "Cortar" (clique e arraste com o botão do mouse pressionado). Clique duas vezes dentro do retângulo desenhado para concluir esta ação.
- Marcação cada contorno celular visível um por um, clicando em "desenhar os contornos de células" e use o cursor de cruz para o desenho, incluindo todos os microposts a célula está ligado a.
- Descarte qualquer microposts indesejados, clicando em "desfazer Mensagens" e usar o cursor de cruz para desenhar. Coloque todos os microposts que pertencem a uma célula do lado de fora da secção de imagem ou que são desviados por qualquer outro motivo, mas não pela célula de interesse.
- Comece a sub-rotina software "Encontre Centróides" pelo clique do mouse. Ajuste a definição direita ao lado do botão "Find Centróides" até que todos os microposts são registradas, o que é visível por uma cruz vermelha em seu centro de filtro. Se a definição de filtro é muito baixa microposts irá ser ignorado, se ele for muito elevado de muposições ltiple será marcada para uma única micropost. Mantenha o filtro definição constante durante uma sessão de análise.
- Use a função de edição manual "Editar Manual" para centroids com múltiplas posições perdidas ou micropost. Use o cabelo do mouse cruz para seleccionar a micropost em questão clicando e arrastando-o do outro lado. Clique duas vezes dentro do retângulo e coloque o marcador vermelho ausente na seção imagem ampliada, que fecha automaticamente. Descarte um tal micropost se ele está fora do contorno celular desenhado (ver passo 4.5) antes de prosseguir.
- Encontre a grade micropost ideal ativando a função "Gerar Grid" com um clique do mouse. Garantir a posição corresponde com a cabeça micropost verdade, mostrado por um anel azul, dentro do contorno celular desenhado.
- Corrija qualquer fabricante grade deslocada dentro da área da célula onde for necessário utilizar a função "Manuel Editar" correspondente com um clique do mouse. Use a mira para selecionar o micropost em question clicando e arrastando-o do outro lado. Clique duas vezes dentro do retângulo que aparece e coloque o marcador azul ausente na seção imagem ampliada, que fecha automaticamente.
- Use o botão "Calcular" deflexões pelo clique do mouse para obter um histograma dos valores de deflexão calculados com base na diferença entre a posição de um micropost dentro da seção de imagem e da grelha ideal gerado.
- Salve a análise completa, incluindo as tabelas de valores por um clique do mouse em "Salvar".
- Continuar a análise de imagem clicando em "Reset View" e analisar outra seção imagem ou clique do mouse em "Next Imagem", que convenientemente pode ser feito usando a tecla cursor do teclado direito.
5. Análise de Dados - Mechanoprofiling
- Abra o arquivo "Results.xls" com um programa de escritório planilha da pasta com as imagens analisadas. Ele contém os dados com all valores calculados, incluindo todos os desvios micropost e medidas de derivados convencionais, tais como o trabalho (isto é, a energia de deformação do substrato) pela célula analisado.
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Representative Results
A principal vantagem da técnica descrita reside na sua simplicidade e potencial para integração rápida e eficaz para o trabalho de laboratório de rotina. A combinação de alta qualidade conjuntos de sensores comerciais combinados com software de código aberto fornece informações sobre mecano-sensibilidade que seria de outra forma exige o acesso a instalações de salas limpas e conhecimento em profundidade de análise de imagem e desenvolvimento de software. A figura 1 ilustra o fluxo de trabalho do método apresentado. Ela começa com a preparação e sementeira de células sobre a matriz micropost. Após a fixação e coloração das células matrizes micropost estão prontos para a imagem latente. A parte central da técnica é a análise de imagens usando o software MechProfiler. Um usuário pode iniciar analyszng imagens imediatamente depois de entrar todos os parâmetros relevantes em "Configurações" do GUI. O tamanho do pixel correspondente é o comprimento que é representada por um único pixel e depende da configuração do utilizador. Precisapara ser estabelecida separadamente para cada ampliação usado por a tomada de imagens de objectos com dimensões conhecidas. Um exemplo é dado na Figura 9 complementar.
A qualidade da imagem é um fator fundamental, pois influencia fortemente o processo de análise. A fim de alcançar a mais alta qualidade deve-se certificar de ter uma plataforma de imagem estável e rotineiramente servida como mostrado na Figura 2. Em particular, o alinhamento da fonte de luz é importante porque desalinhamento provocará sombras indesejáveis que podem ser problemáticos quando se analisa o imagens. Além disso, colocar o microscópio de luz em cima de uma mesa de anti-vibração ou placa é benéfica na maioria dos laboratórios, pois dá mais estabilidade durante o exame.
As vantagens de usar um fundo de placa de Petri de vidro fino para imagens incluem valores de abertura numérica maior eficazes que se traduz em imagens mais brilhantes com maior resolução.
Quando taking as imagens no modo de campo brilhante de 50% iris fechados é recomendado, como incidindo sobre as dicas microposts é facilitado devido às circunferências que aparecem como um anel escuro crisp. Além disso, no caso de o objectivo usado tem um anel de compensação, é essencial para configurá-lo corretamente para obter leituras precisas da força. O impacto de recurso que pode ser visto comparando a Figura 3A e Figura 3B. As imagens que pode ser rapidamente analisados são conseguidos através da combinação do ajuste correcto do anel de compensação, juntamente com uma iluminação óptima, como mostrado na Figura 3C. Forte contraste entre um micropost e de sua região circunvizinha reduz o tempo de análise, uma vez que acelera o algoritmo de busca. Os usuários vão achar que só a experiência mínima é necessária para conseguir imagens que podem ser analisados com facilidade.
Mais importante, os protocolos acima superar um obstáculo crítico e comum a integração rápida e eficaz das matrizes micropost em rotinatrabalho de laboratório. Este obstáculo decorre da necessidade de controlar a qualidade array - uma demanda que é alcançável apenas por caracterização experimental minuciosa e detalhada de sensor de reprodutibilidade, sensibilidade e precisão. No entanto, voltando-se para matrizes micropost disponíveis comercialmente este obstáculo considerável é completamente evitada. Figuras 4A e 4B ilustram a precisão de tal uma matriz micropost. O desvio da posição microposts está bem abaixo dos 200 nm e, como tal, comparável com um "erro de pixel", que acompanha a câmera / combinação objetivo, que resultou em um tamanho de pixel de 82 nm para a configuração utilizada. A análise de imagens com as células de deflexão microposts demonstra que os valores para uma deflexão imposta por células são substancialmente mais elevados do que 200 nm (como mostrado na Figura 4C e a Figura 4D) que conduz a um sinal confortável à relação de ruído.
Figura 5 IllustratES os diferentes tipos de jogos pelo microposts dentro de uma imagem, dependendo se é desviada ou não. Como mencionado acima microposts não desvia têm uma aparência brilhante circular com um anel escuro ao redor deles. A sua posição pode ser determinada usando uma transformação de Hough, que é uma técnica para a extracção de parâmetros de análise de imagem digital.
Além disso, mostra que microposts desviados em um microscópio invertido mostram duas formas de frente para meia-lua escuros (veja a Figura 5A). Em um microscópio vertical da borda da ponta micropost e uma forma de meia-lua negra são propriamente visível enquanto o segundo se torna difícil de detectar. Estas características são a base para o cálculo das posições de imagens de microscópio de campo brilhante das pontas de microposts desviados, que foi desenvolvido para este protocolo e foi nomeado o "contorno de aproximação".
A Figura 5B é um exemplo de um cancro de osso HuO9celular em microposts fotografada em um microscópio invertido (em cima). A versão analisados de imagem que mostra os resultados a partir da abordagem contorno aplicada (em baixo). Figura 5C foi feita usando a mesma matriz micropost com um microscópio vertical (de cima). Novamente a versão analisados mostra os resultados de usar a aproximação do contorno.
Cada sessão de análise de imagem começa por uma verificação do usuário dos parâmetros na seção "Configurações" do MechProfiler. Alguns são dadas pelo fabricante micropost como micropost dimensões da matriz e constante da mola. Outras estão definidas pelo utilizador, tais como os valores para o limite de contorno e de um limiar mínimo de deflexão de acordo com os procedimentos detalhados no manual do software. No entanto, é importante notar que estes valores devem ser escolhidos com cuidado e deve ser constante para todas as imagens dentro de um grupo relacionado de imagens para garantir a comparabilidade. Considerando que as etapas de pré-processamento para a analysi imagems, como corte, são auto-explicando as estratégias subjacentes para as funções de software como "Encontrar Centróides", "Gerar Grid" e do "contorno de aproximação" precisam de explicações mais detalhadas.
Algorithmic detecção de posição micropost padrão (como fornecido pelo fabricante) começa usando a função de software "Encontrando centroids". O algoritmo começa no canto superior esquerdo de uma imagem Pesquisa pela primeira micropost. Subsequentemente todos os outros microposts são encontradas com base nas coordenadas do referido primeiro micropost mais os valores para o tamanho da grelha e micropost dada pelo fabricante após a geometria hexagonal. O centróide para cada micropost encontrado é calculada usando uma transformação Hough. O cursor do filtro ao lado do botão de comando do GUI permite ajustar a sensibilidade desta transformação. Todos os microposts encontrados são marcados com uma cruz vermelha e as suas posições conhecido por suprocessos bsequent.
Em seguida, a função "Gerar Grid" leva para as coordenadas de todos os microposts dicas. Eles são os resultados de um processo multi-passo. Primeiro uma função de otimização é resolvido incluindo as posições iniciais do algoritmo executado antes "Encontre centroids" para estabelecer a rede ideal. Segundo as posições dos microposts dentro da área célula é calculada. Microposts com menos deflexão do que definido no parâmetro de configuração "limiar mínimo desvio" em relação ao sistema ideal são processados com uma transformação Hugh. Todas as outras posições da ponta micropost são calculados utilizando a aproximação do contorno acima descrito para microposts deflectidas. Aqui, o software começa a procurar a partir do centro inicial distância do centro da célula para uma borda circular (claro para escuro) dentro de um ângulo de 15 ° (ver Figura 5A). Uma vez que a borda é encontrado um círculo com o diâmetro micropost dado estiver equipado para tborda chapéu usando o valor do limiar de contorno a partir das definições no GUI. Esse parâmetro determina qual o pixel de valor de cinzento é usado para o processo de montagem. Quanto maior esse valor é o mais o encaixe se inclina em direção ao centro micropost mais brilhante que o menor valor, mais ele se encaixa nesse círculo ao contorno micropost mais escura. Uma vez escolhido esse valor deve permanecer constante para todas as análises imagem dentro de um determinado estudo para evitar a adição de deflexão artificial ou chamando desvios demasiado conservadora.
Por exemplo, a Figura 6 ilustra a importância de decidir por um valor limite de contorno apropriado. O software permite que o usuário escolha para uma ampla gama (0,1 a 0,9) para abranger todas as situações de iluminação fisicamente possíveis. A tradução da informação óptica para distâncias de deformação dados para ambos os extremos e um valor mais prático no meio são apresentados na Figura 6B. No entanto, os usuários do software treinados frequentemente converge para valores de limiar de contorno muito semelhantes, conduzindo a resultados comparáveis, como pode ser observado na Figura 6C. Além disso, utilizando-se procedimentos padronizados para a coloração de células de imagem e minimiza o risco de limiares contorno inválidos, que geralmente devem permanecer constante dentro de conjuntos interligados de imagens.
Para demonstrar a robustez do método de selecção de um resultado de perfilação de mecano estão resumidos na Figura 7. Na Figura 7A dois resultados a partir de células de cancro ósseo HuO9 e dois de M132 são comparados. Todas as quatro matrizes são do mesmo lote de produção e, por conseguinte, têm propriedades mecânicas idênticas. A análise foi realizada com um conjunto fixo de parâmetros para uma deflexão mínima (0,25 mm) e para o limite de contorno (0,125). Além disso, dois conjuntos idênticos de imagens de SaOS câncer 2 osso foram dadas a dois analistas, sem mais informações sobre as definições de parâmetros (veja a Figura 7B). A influência da coloração na análise foi testada por obtenção de imagens de células de cancro ósseo corado com azul Coomassie R. Subsequentemente, o corante foi removido. Depois de re-coloração com Azul de Coomassie G um segundo conjunto de imagens foi feita. A Figura 7C ilustra os resultados de ambas as séries, as quais foram analisadas pelo mesmo utilizador com valores idênticos para a deflexão mínima (0,25 um) e o limite de contorno (0,25) .
Um exemplo típico de aplicação mecano-perfilamento é apresentado na Figura 8A, em que os dados compilados é apresentado para as linhas celulares de cancro do osso HuO9 M132 e depois analisando a 151 células reunidas a partir de cada um dos quatro matrizes. Nesta visão geral todos os valores dos indicadores são mais elevados do que para HuO9 para M132 já indicando que as células HuO9 aplicar mais força do que M132. No entanto, os dados a partir da análise de imagem contém uma grande quantidade de informação de uma única célula adicional que pode ser extraído a compreender melhor fencomportamento linha celular otypic e variabilidade célula-a-célula dentro de uma dada linha. Ao apresentar os resultados para a força por micropost em um gráfico de caixa encontra-se que, apesar de mínimos e máximos semelhantes, valores de dados são distribuídos diferentemente e de fato a linha de células metastático baixo células HuO9 tendem a aplicar mais força do que a linha M132 altamente metastático (ver Figura 8B). Além disso, ao categorizar os valores de força em relação à área da célula verifica-se que a força média por célula não só é elevado para as células HuO9 comparação com M132, mas também que a força média por micropost aumenta à medida que as células se espalhar até vigor Média por mensagem atinge um valor mais estável (como pode ser visto na Figura 8C). Além disso, para as células que abrangem sete microposts os valores são quase idênticas, o que é provavelmente devido ao facto de que eles são normalmente apresentados na forma hexagonal com um centro não desvia micropost independente da sua linha de células. Para além do diffrências da contratilidade, diferenças morfológicas podem ser quantificados com resultado interessante. Por exemplo, em contraste com as células altamente metastáticas M132 foram muito poucas células HuO9 que cobriam apenas três microposts. Outras comparações morfológicas entre as linhas celulares podem ser feitos, incluindo a distribuição de área celular representado pelo número de microposts cobertos. A Figura 8D ilustra que as duas linhas celulares também diferem em comportamento espalhamento dinâmico quando crescendo na parte superior da microposts. Em suma, o mechanoprofile para a linha celular parental HuO9 revela que eles geralmente cobrem mais área e aplique um pouco mais de força para microposts enquanto que a linha de células metastático M132, uma célula agressiva que deriva de HuO9, caracteristicamente cobre menos microposts e aplica-se menos força por micropost . Estes resultados demonstram o potencial de uma abordagem baseada TFM para aplicações discriminatórias.
Figura 2. Configuração Imaging. Um microscópio invertido padrão é usado para geração de imagens das células nas matrizes micropost. A instalação também contém uma câmara de microscópio e o seu controlador, que também pode fornecer funções de armazenamento de dados. A grande tela mostrada não é essencial, mas ainda assim é conveniente para a imagem latente prolongadasessões. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Orientação para a imagem latente micropost. (A) Imagem de células coradas em uma matriz micropost tomada com uma lente de 40X no modo de campo brilhante. Microposts não desviados aparecem como anéis escuros quando trabalhada. Mensagens desvia assumir uma forma elíptica com as duas sub-regiões mais escuras e brilhantes. Células coradas que cobrem microposts fá-los parecer ainda mais escuro até o ponto que não há contraste entre micropost e celular. (B) imagens idênticas tomada depois de ajustar o anel de compensação lente e re-focar. Aqui, os núcleos dos microposts se tornam substancialmente mais brilhante e dar mais contraste. (C) A mesma posição novamente representada por imagem após AdjusTing todos os parâmetros de iluminação com o controlador de câmara. Os microposts pé livremente aparecem como círculos luminosos com um anel escuro. Microposts desviado mostram uma meia-lua "sombra" distinta em torno do núcleo de dobra ao longo do eixo de tração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.>
Figura 4. screenshots MechProfiler de microposts analisados. (A) Um exemplo típico de um vazio micropost matriz pode ser visto nesta imagem. Os microposts estão dispostos num padrão hexagonal constante. (B) O histograma com os valores de deflexão para estes microposts mostra que todos os valores estão abaixo de 200 nm. (C) Exemplo típico para um HuO9 osso cobertura de células de câncere puxando em vários microposts. Pode ser visto que a quantidade de puxar é heterogéneo. (D) O histograma com os valores de deflexão para a célula HuO9 mostra o amplo espectro de desvios que surge a partir da interação das células com o substrato micropost. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. aparências micropost na iluminação de campo brilhante e as estratégias para calcular a sua posição dentro de uma imagem. (A) microposts não-desviado aparece como uma área circular brilhante com um anel externo escuro. O centróide é calculada por uma transformação de Hough. Microposts desviados mostrar formas de meia-lua escura. Dependendo da configuração do microscópio se os microposts enfrentar o ligh fonte T (por exemplo, microscópio invertido), existem duas formas de meia-lua bem visíveis. Se os microposts enfrentar a lente (por exemplo, microscópio vertical), apenas uma meia-lua é bem visível, mas também a própria borda da ponta. Em ambos os casos, a abordagem contorno deve ser utilizado para calcular a ponta micropost. (B) Uma imagem original (topo) utilizando um microscópio invertido de uma célula de cancro do osso e a sua versão HuO9 analisados (inferior) utilizando a abordagem do contorno. (C) A imagem original a partir da mesma matriz micropost (topo), utilizando um microscópio vertical ea versão analisada, novamente aplicando a abordagem do contorno (parte inferior), mas com um valor limite de contorno muito menor mais adequada para chamar a borda escura em forma de anel. Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 6. A abordagem do contorno e a escolha do valor limiar apropriado. (A) Os três imagens ilustram os mesmos microposts analisados utilizando três diferentes valores de patamar contorno. Se o valor for definido muito baixo (à esquerda) ou muito alto (à direita) do que o software se encaixa o anel azul que representa a cabeça micropost incorretamente. Ele subestima ou ultrapassa a posição real da cabeça micropost. Um valor limite corretamente escolhida permite que o software para atender esse anel azul para a meia-lua em forma área escura dentro do micropost que se forma através do desvio. (B) O gráfico mostra o volume médio de deflexão depende do limiar de contorno escolhidos para as microposts mostrados em cima. É também ilustra que os valores para as microposts fora do contorno da célula não são afectados uma vez que a montagem de contorno não é aplicada ali. (C) O gráfico ilustra que a escolhaum valor limite dentro de um intervalo de moderada minimalizes o risco de super ou subestimando os desvios micropost. A diferença entre os valores escolhidos por diferentes usuários treinados é normalmente inferior a 0,05, o que resulta em diferenças aceitáveis em valores médios de deflexão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7. teste de robustez para resultados mecano-perfil de linhas celulares de cancro ósseo diferentes; as barras de erro representam um desvio padrão (A) Mecano-profiling resultados de quatro matrizes micropost idênticos após a semeadura células HuO9 na matriz 1 e M132 em conjunto. 3 - quatro dias depois semeando HuO9 na matriz 2 e M132 em conjunto 4. (B) Comparação dos resultados de mEchano-perfis baseados em conjuntos idênticos de imagens após análise por dois analistas independentes. (C) Comparação dos resultados de análise de imagens a partir de duas diferentes séries imagem primeira tomada após coloração com Coomassie Blue R eo segundo após a remoção completa do corante e re-coloração com Coomassie Blue G. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura .>
Figura 8. Mecano-perfis de linhas celulares de cancro do osso. (A) A comparação entre as linhas de células do cancro do osso dois HuO9 (baixo potencial metastático) e M132 (altamente metastáticas) gráfico mostra que todos os valores do indicador são mais elevadas para a linha celular HuO9 ( N total = 302; dois conjuntos independentes de experimentos, bar erro = desvio padrão). (B trong>) O enredo caixa ilustra que as forças aplicadas por micropost estão no menor intervalo de nano-Newton. No entanto, as células HuO9 puxar mais do que as células M132 (Bigodes representam o mínimo de dados e máximo). (C) Um resultado semelhante pode ser visto comparando as células que cobrem o mesmo número de microposts. Célula HuO9 aplicar mais força do que as células M132. O número de células que cobrem três HuO9 microposts não é representativo e incluído apenas para a completude (barra de erro = desvio padrão). (D) As distribuições diferentes em todo o número de microposts cobertos demonstrar que cada linha de células do cancro de osso tem sua própria característica espalhando ao interagir com matrizes micropost. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura Suplementar 9. O tamanho do pixel para uma configuração de microscópio é tipicamente determinada utilizando uma lâmina de microscópio especial com uma barra de escala sobre ele; alternativamente, o layout matriz micropost, dado pelo fabricante pode ser usado. Por exemplo, 15 unidades com 13 microns (195 mm de comprimento total) divididos por 2.375 pixels (estabelecidos com uma ferramenta de processamento de imagem) leva a 0,082 mm / pxl. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10. Comparação suplementar de imagens de uma célula de cancro do osso HuO9 retirado da mesma posição, usando duas técnicas de iluminação em um microscópio invertido; The Dio manchado microposts são verde fluorescente. (A Modo de campo brilhante. (B) Analisado i Magé tomada após a mudança para o canal de fluorescência verde sem reorientação. (C) imagem de fluorescência segundo lugar depois de corrigir a concentração para as pontas muito micropost. (D) Sobreposição de ambos os canais de iluminação apenas para fins ilustrativos. (E) Mecano-profiling indicadores como resultados das três imagens. Apesar corrigir o foco do desvio total não pode ser estimada a partir das imagens de fluorescência. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Fi Suplementarfigura 11. sequência Imagem da mesma posição de microposts manchadas fluorescente usando DII em um microscópio vertical imagem de campo brilhante (A).; há três microposts que tocam-se na ponta. (B) A mesma posição depois de mudar para o canal fluorescente ligeiramente acima da cabeça dos microposts. (C) a redução do plano focal para a ponta dos microposts. (DE) imagens consecutiva depois reduzindo ainda mais o passo a passo plano focal para um fundo dos microposts. (F) Imagem dos microposts depois de abaixar o plano focal no interior do substrato de elastômero de silicone. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar 12. Captura de tela da GUI MechProfiler. Resultado de análise de perfil típica de uma célula de câncer nos ossos HuO9. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este trabalho visa avançar no campo da microscopia de força de tração, diminuindo substancialmente os obstáculos técnicos e práticos à entrada. Estas barreiras vêm de dois lados. Primeiro e mais importante são os inúmeros desafios técnicos não triviais que devem ser superados para a fabricação reprodutível e comissionar uma matriz micropost experimentalmente. Em segundo lugar, é a necessidade de forma semelhante não trivial para uma análise semi-automatizado de confiança de forças de células únicas - tendo em mente que uma experiência típica pode exigir a análise de centenas ou mesmo milhares de células. As técnicas descritas acima foram desenvolvidos para fazer microscopia de força de tração com base micropost acessíveis dentro de laboratórios de biologia celular que não têm conhecimentos de engenharia residente. Os sensores e técnicas de análise apresentadas neste artigo deve permitir que não-especialistas para prontamente e precisa analisar as forças exercidas por células individuais.
Além de acesso a uma biologia celular lAB com, pelo menos, um meio-grau microscópio de campo brilhante, os métodos descritos requerem poucos elementos técnicos adicionais. Aqui a maioria dos usuários pode executar experimentos de microscopia de força de tração válidos, mesmo com pouca experiência, apesar de o poder ea versatilidade da técnica. No entanto, há três aspectos críticos do protocolo apresentado que deve ser considerado. Em primeiro lugar é necessário garantir que as matrizes micropost são sempre cobertas com um líquido a fim de evitar que o seu colapso devido às forças capilares. Em segundo lugar é preciso otimizar os parâmetros de imagem para imagens micropost adquiridas, que é o melhor feito tomando série de imagens da mesma posição de matriz enquanto variando o tempo de exposição, abertura da íris, e posição do anel de compensação. É importante encontrar o plano focal correto para a ponta micropost, e este aspecto faz um pouco de experiência dada a pequena profundidade dimensional dos conjuntos de sensores. Em terceiro lugar é preciso baixar o abertamente acessíveis análise de imagem MechProfiler software Discussed aqui, para os quais estão disponíveis no site de download um manual de usuário e de formação exemplos detalhados. Depois de alguma experiência usando o software para analisar exemplos fornecidos com o manual, o usuário deve tomar imagens de teste sobre a configuração de imagem a ser utilizado, de modo a configurar as definições de microscópio adequados. Com base nas imagens obtidas, o valor limiar contorno deve ser optimizada de forma semelhante. Uma imagem micropost único pode ser analisado por um utilizador treinado dentro de um minuto, utilizando o software MechProfiler-fonte aberto, independentemente do facto de ele contém uma ou mais células, permitindo a geração de resultados estatisticamente relevantes (análise de várias centenas de células) dentro de algumas horas .
Outro aspecto que requer algum ajuste é a otimização de qualquer processo de coloração celular aplicada. Quando as células são excessivamente corados o software pode deixar de registar as posições micropost corretos. Por outro lado, se a coloração é demasiado fraco que requer mais esforço por parte do utilizador para detectar um"True" esboço célula como saliências celulares finas pode ser desperdiçada.
No entanto, através da aplicação de um protocolo fixo de coloração de células e matriz de imagem procedimento a gama de erro para este torna-se aceitavelmente baixo. Durante este trabalho diferentes procedimentos de coloração de células foram testados, com base em várias concentrações de violeta cristal, a presença de agentes tensioactivos tais como Tween 20 ou Triton-X, ou uma combinação de corantes por adição de Eosina. No entanto, a intensidade da coloração, bem como a sua estabilidade substancialmente variou de experiência para experiência. Apenas o uso de Brilliant Blue G como descrito acima mostrou uma robustez coloração celular aceitável combinado com intensidade suficiente para ainda ver o contorno da célula fina, mas sem interferir com a abordagem desenvolvida contorno.
Em geral, existem opções para modificar a técnica apresentada. Por exemplo, combinando as técnicas de campo brilhante apresentados aqui com organelas microscopia de fluorescência de coloraçãocomo o núcleo ou a rede de filamentos de actina, que pode fornecer informações adicionais sobre os processos celulares subjacentes no contexto da mecânica celulares. Além disso, utilizando carboxycyanines de dialquilo de cadeia longa (DII ou DIO) os microposts tornar fluorescente. 14 No entanto, é importante para controlar cada um desvio em relação à técnica apresentada. As Figuras complementares 10 e Figura 11 ilustra as armadilhas potenciais. Imagens tiradas de um celular de fibroblastos NIH 3T3 Coomassie Blue G manchado no canal de fluorescência verde (Figura 10B e 10C), utilizando o microscópio invertido apresentar os principais órgãos micropost mas não suas dicas que conduzem a uma análise posição com defeito (Figura 10E). Apesar do melhor esforço para reorientar após a mudança do modo de campo brilhante (Figura 10A) micropost as pontas não podem ser trabalhada, o que pode ser devido à absorção do sinal de fluorescência por célula a mancha. Isto está em contraste com IMAGES tomadas com o canal de fluorescência amarela de um microscópio vertical (Figura 11B-11F), em que várias imagens nítidas pode ser obter ao longo do eixo z. Aqui, o usuário precisa para assegurar que a imagem for tomado com o plano focal na ponta (Figura 11C) e não em algum lugar mais perto do fundo micropost para evitar chamar valores de deflexão defeituosos.
Deve notar-se que também existem limitações técnicas para ensaios micropost. Por exemplo, a precisão de um desvio detectado depende da qualidade da configuração óptica. Microscópios são frequentemente optimizado para imagiologia de fluorescência em que a sensibilidade à luz da câmara ligada tem uma prioridade maior do que um grande número de pixels. Naturalmente, isto leva a imagens com um tamanho maior do pixel. Além disso, deve notar-se que as imagens de campo brilhante não é possível determinar se as saliências de células alcançar o fundo do substrato. No entanto, as matrizes micropost comerciais foram testados usando confocalmicroscopia. Verificou-se que as células parecem aceitar o binário de revestimento que promove a adesão única nas pontas micropost e não para o resto da matriz micropost. Outro fator deriva do erro de posição do conjunto micropost, que foi demonstrado ser 0,2 um. Juntamente com a constante de mola dado de 2,8 nN / iM isto leva a um erro na leitura de força de 0,6 nN. Um outro constrangimento para ensaios micropost deriva do facto de que as forças aplicadas a partir de microposts compartilhados por várias células não pode ser determinada. Portanto, células isoladas únicas só podem ser analisados. Uma limitação específica para o protocolo apresentado deriva da aplicação correcta da abordagem sensível do contorno, o que exige uma certa quantidade de treinamento para o usuário, a fim de obter resultados confiáveis. Além disso, para uma análise mais rápido o utilizador deve levar imagens em que a matriz micropost está alinhada de modo a formar um eixo horizontal ou uma linha vertical ao longo da extremidade do campo de observação. Despite o facto de o algoritmo de software para encontrar microposts dentro de uma geometria grelha hexagonal não é limitado por um ângulo de rotação da imagem de microposts mais do que 5 ° fora do eixo torná-la difícil de cortar para uma secção de imagem sem conter microposts incompletos, o que conduz então a uma falha da função "Gerar Grid". Em tal caso, o utilizador pode utilizar a função de rotação integrado antes de começar a analisar as posições micropost.
O método descrito foi aplicado principalmente para caracterizar duas linhas celulares de cancro do osso, uma linha celular parental chamado HuO9, e uma linha altamente metastática derivado denominados M132. Neste contexto, mais de seiscentos imagens unicelulares foram tiradas em modo de campo brilhante e analisados utilizando o software MechProfiler. A mineração de dados posteriores revelaram que a linha celular parental HuO9 exerce um pouco mais de força e cobre tipicamente mais microposts por célula do que as células da linha celular metastático M132. No entanto, as célulasnão foram sincronizadas e, por conseguinte, em diferentes fases do ciclo celular no momento da fixação, o que contribuiu provavelmente para a ampla gama de resultados. Ao tomar imagens de células vivas ao longo de períodos de tempo de até 24 horas, verificou-se que depois de propagação de muitas células permanecem na sua posição inicial, enquanto outros migram, propagação, desligue e migrar novamente com diferentes velocidades (ver vídeos complementares). Isto indica que o perfil mecânico de uma célula muitas vezes não é constante e pode variar muito entre uma população de células ou mesmo dentro de uma única célula em função da sua actividade actual. Outro fator que contribui em que poderia ser uma matriz micropost uma célula é forçado a executar as etapas de migração discretas para alcançar outro micropost, o que está em contraste com a clássica TFM, onde as células aderem a superfícies planas e pode migrar com passos hora. No entanto, a fim de analisar estes pequenos passos, é necessário tomar as imagens fluorescentes de pontos de adesão focal, o que requer o acesso a m muito avançadoicroscopes e altamente elaborado software de análise de imagem. No entanto, a distribuição de perfis mecânicas dentro de populações maiores ainda é muitas vezes uma característica de definição de uma linha celular. Assim, um método de alto rendimento que permite a caracterização de um grande número de células é essencial. O processo de gravação manual e software de acesso livre aqui apresentado abriga um grande potencial para a expansão de sistemas de microscopia totalmente automáticas.
Em resumo uma abordagem robusta microscopia de força de tração é apresentado que é facilmente adoptáveis em um laboratório de biologia celular padrão. Todo o fluxo de trabalho de semeadura de células para análise de imagem é simples e eficaz. Enquanto os protocolos descritos aqui são totalmente funcionais, as melhorias estão em andamento para adaptar os algoritmos de análise para ser capaz de lidar também com matrizes micropost layouts ortogonais e procedimentos em desenvolvimento que simplificam a análise de sequências de imagens a partir de imagens de células vivas. Em contexto com os resultados para li célula de câncer ósseones, as abordagens descritas aqui podem ser usadas para células a partir de biópsias de tela clínicos, a fim de determinar se tais ensaios podem deter um valor prognóstico, permitindo que os médicos para prever o potencial metastático de células provenientes de biópsias de pacientes com cancro do osso. Um tal ensaio poderiam influenciar as estratégias terapêuticas. Outras potenciais aplicações para os compostos de teste se referem farmaceuticamente activos em células mecanicamente activas, como as células do músculo liso ou cardiomiócitos, potencialmente, para ajudar a estabelecer a eficácia ou toxicidade da droga.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm |
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
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