Introduction
- 기계에 민감한 세포 기반 분석은 역학 세포 생물학에서 재생할 수있는 중심적인 역할을 반영하는 다양한 애플리케이션으로, 부착 세포를 조사 할 수 있습니다. 이 애플리케이션은 세포 내 프로세스 또는 전체 셀 동작을 구동하는 기본 메커니즘에 초점을 맞추고있다. 한편, 예컨대 세포 외 매트릭스 조성물 또는 매트릭스 강성 같은 외부 환경 요인 극적 셀의 기계적 및 생물학적 반응에 영향을 미칠 수있다. (1) 같은 약학 적 활성 화합물의 많은 클래스의 사용 후에 관측 될 수 있고, 효과가있는 아르 종종 세포 배양 모델을 이용하여 특징으로한다. (2) 등의 골격 구조 및 기능의 변화와 관련된 세포 표현형으로 표시 변경을 유도 할 수 자발 또는 실험적으로 유도 된 유전자 돌연변이에 의한 것과 같은 다른 한편 유전자형 특성에서. (3)이 예는 많은 수의 몇 가지주제에있는 세포의 기계적 표현형 관련이며,이 모든 유용하게 micropost 배열로 조사되었다.
이 글을 쓰는 시점에서, 약 200 기사 세포 micropost 상호 작용을 설명하는 발표되었다. 이 작품은 micropost 편향 원칙의 이론적 인 측면뿐만 아니라 제조에 실제적인 지침을 설명합니다. 세포와 유연한 micropost 배열의 상호 작용을 설명하는 첫 번째 기사는 연속 부드러운 기판을 탄 등 nanonewton 규모의 세포 수축력을 추정하는 데 사용되는 고전적인 견인 힘 현미경 (TFM)과는 대조적으로 2003 년 4 탄 및 동료에 의해 출판되었다. 실리콘 엘라스토머로 이루어지는 다수의 근접하게 이격 된 수직 빔을 사용하는 방법을 설명했다. 이 기술의 주요 장점은 두 가지 주요 기능에서 등장. 유지하면서 제 휴대 명백 기판의 강성을 변경하기 위해 하나의 유일한 micropost 치수를 변경해야달리 일정하므로, 표면 토폴로지 및 화학의 차이를 피하는 기판 조성물. 둘째 microposts는 이산 개별 초점 유착 정도의 힘과 공간 해상도로 분석 할 수 있습니다 및 표준 TFM에 의해 유사한 분석에 고유 한 분석 문제를 줄일 수있는 개별 스프링과 같은 역할을합니다.
오늘 micropost 배열에 대한 응용 프로그램의 범위는 크게 몇 하나의 셀에 대한 힘의 단지 매핑을 초과합니다. 예를 들어, 아키야마는 곤충 근육 탑재 자율 마이크로 로봇을 개발하기 위해서는, micropost 어레이 액츄에이터 방 애벌레로부터 격리 등쪽 혈관 조직의 사용을보고한다. (5)
그러나 microposts 대부분의 게시 된 응용 프로그램은 감염이나 암과 같은 질환의 연구에 초점을 맞추고있다. 예를 들어, micropost 어레이는 나이 세리아 gonorrh 번들의 타입 IV의 필리의 구동력 발생을 연구하기 위해 사용되어왔다. 신호 캐스케이드 감염 향상과 연관된 6 기타 세포 골격 타겟팅 약학 화합물로 처리 유방암 세포를 연구 microposts를 사용한 콜로니 OEA. 7
micropost 편향 종종 셀을 가정 단부 하중 고전 캔틸레버 빔 이론을 이용하여 설명하는 매우 micropost의 선단에 부착. 편향 δ 원인이 여기에 적용되는 힘 (F)은 micropost의 "휨 강성"K에 의존에 의해 계산된다 :
(1)
E, I, L 및 인 영률 각각 관성 빔 길이의 면적 모멘트. 기판 휨이 교류로 촬영되지 않습니다 그러나,이 방정식의 결과는 빔 전단 이후 작업뿐만 아니라 굴곡의 힘의 근사치를 제공카운트. microposts 전형적 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)와 같은 부드러운 재료로 제조되는 것을 고려할 때 이러한 요소가 포함될 필요가 실리콘 고무 기반. . Schoen 외는 micropost (L / D) 및 해당 중합체의 포아송 비 (V)의 종횡비에 기초하여 이러한 교정 인자가 있다는 것을 증명 8 그것은로 주어진다. :
(2)
T 기울기는 (V) 동일한 문서에서 발견 될 수있는 피팅 파라미터 = 1.3를 포함 틸팅 계수되면서 :
(3)
즉 micropost 보정의 강성 K CORR은 순수한 굽힘 강성 K = K 벤드의 생성물 및 보정 계수 CORR 의미주어진:
(4)
따라서, 셀 력 계산 이제 판독 식 (1)의보다 정교한 변형을 사용하여 수행한다 :
(5)
보정의 영향은 즉시 micropost 치수에 대한 일반적인 값을 사용으로 더 분명해진다. 예를 들면, 원형 단면과 PDMS 계 실리콘 고무로 만들어진 5 ㎛의 직경 15 마이크론 길이 micropost는 0.77의 보정 계수에 이르게하기 때문에 보정 전 계산은 23 %가 소비 된 전지의 힘을 과대 평가한다. 이것은 훨씬 더 심각한 작은 종횡비 microposts에 대한된다.
전통적으로, micropost 이미지 분석은 이상적인 빔 굽힘 이론에 근거하고있다. 2005 년 MICR의 사용을 개척 한 그룹opost 어레이 micropost 분석에 적합한 이미지 분석 소프트웨어를 발표 9 소프트웨어는 소프트웨어 라이센스가 필요하고 사용자가 각각의 위치에 대한 세 개의 이미지를 취한다.; 전송 모드와 스테인드 세포에 형광 모드에서 또 하나의 micropost의 상단과 하단면에서 한 각. 각각의 상부 및 하부 위치를 비교 한 후 소프트웨어가 힘 벡터 필드를 결정하고, 포스트 당 힘과 같은 관련 파라미터를 계산 micropost. 기타 소프트웨어 패키지는 존재와 그 분석의 원칙은 간단하게 그들을 설명하는 해당 기사에 언급되어 있지만, 이러한 분석 소프트웨어 패키지는 일반적으로 공개적으로 사용할 수 없습니다. (10, 11)
셀 매핑 힘을 위해 설계 micropost 어레이는 모든 이웃 microposts 사이의 등거리 간격 장점이 후자의 직교 micropost 레이아웃 또는 육각형 하나에 되로 분류 될 수있다. 일반적인 microposts 하원형 단면을 적이 그들의 사이즈 타원 또는 사각형 단면 microposts 또한보고되었다 그러나, 길이가 50 ㎛ 인 내지 1.0 μm의 직경이 10 ㎛ 내지 2. (4)를 배열한다. 12,13
micropost 재료로서 PDMS 기반 실리콘의 혼합물의 혼합물을 사용하는 나노 입자를 추가로 허용한다. 코발트 나노로드를 추가 예를 들어 micropost의 자기 활성화를 가능하게하고, 따라서 잠재적 인 실험 디자인에 자유의 또 다른 학위를 제공합니다. 14 대부분의 그룹은 커버 유리와 같은 또는 페트리 접시 내부 평면 딱딱한 기판 상에 자신의 micropost 배열을 생산하고 있습니다. 그러나 맨과 동료들은 최근에 신축 막에 형성된 micropost 배열을보고했다. 15 세포 수축성의 관점에서 라이브 셀 세포 내 동적 응답을 공부하는 동안이 부착 세포에 세포 스트레칭 힘의 응용 프로그램을 할 수 있습니다.
널리 사용되는 가장 맛 음료SU8 포토 레지스트를 이용하여 실리콘 웨이퍼 위에 마이크로 구조를 생성하는 데 사용되는 간단한 표준 클린 룸 공정에서 Sniadecki 동료. 16-18의 통찰력 프로토콜에 기재된 바와 같이 micropost 어레이 제작 오리스 공정은 소프트 리소그래피에 기초한다. 이것은 실리콘 고무 몰드로 이송 구조 위에 캐스팅 된 상기 복사 프로세스가 이어진다. 제 2 단계에서, 이들 몰드 선택된 기판 위에 실리콘 고무를 사용하여 초기 미세 구조를 복제하기 위해 사용된다. 그러나 microposts위한 제조 공정을 확립 그들의 애플리케이션과 관련된 서적의 큰 증가에도 불구하고 마이크로 공학 전문가에도 상당한 시간이 소요; 허용 가능한 품질 레벨을 산출하기 위해 특정 테스트 환경과 micropost 레이아웃 최적화 및 적응을 필요로하는 많은 공정 단계가있다.
상업 micropost 배열은 준비-T에 사용할 수 있습니다지속적으로 높은 품질의 오 사용 ( "기성") 형식입니다. 따라서 그들은 현장 생산에 필요한 복잡하고 긴 제조 공정에 대한 대안이다. 이 논문에서 시판 micropost 어레이는 단일 시야 현미경 이미지를 사용하여 셀룰러 힘을 매핑하는데 사용 하였다. 더 중요한이 문서에서는이 원고에 대한 보충 자료 등을 다운로드 할 수 있습니다 MechProfiler라는 이름의 완전한 기능을 오픈 소스 소프트웨어를 설명합니다. 소프트웨어 적극적 유지 버전도 http://www.orthobiomech.ethz.ch에서 찾을 수있다.
"기성품"분석과 호환 오픈 소스 분석 소프트웨어의 조합은 현저히 TFM 정확한 실험을 달성하기 엔트리 장애물을 낮춘다. 클린 룸 시설이나 소프트웨어 개발 전문 중 하나에 대한 액세스 권한이없는 연구원은 성공적으로 세포의 힘을 분석 할 수 있습니다. 이 메케에 초점을 사용자로 하여금ensitivity 분석 출력보다는 기술 자체, 및 더 넓은 지역에 사용할 견인력을 측정한다. 또한, 이것은 micropost 어레이 전자동 스크리닝 향해 방법을 포장하는 중요한 단계이다.
MechProfiler 분석 소프트웨어는 파일 형식 TIFF, PNG, BMP와 JPG의 이미지를 처리합니다. 이미지는 형광, 위상차 또는 밝은 장광 현미경을 사용하여 수행 될 수있다. 독립 실행 형 프로그램은 (이용 가능한 그림 12) 무료 matlab에 컴파일러 런타임과 함께 실행하고 기본 알고리즘은 약 1 분에 하나 또는 여러 개의 세포와 이미지를 처리하는 사용자 수 있도록 효율적인 이미지 처리를 위해 수 있습니다. 또한, 이들 세포 중 살아있는되거나 "고정".
MechProfiler 소프트웨어 크게 상업용 품질 micropost 어레이의 재현성에 의존하여 데이터 분석 처리량을 증가시킬 수있다, 구체적으로는, 기본 및 #8220은 비 - 편향 "배열의 각 포스트의 위치가 이상적 그리드에 대해 추정 될 수있다 (본 연구에 사용 된 배열에서 그리드 제조 편차를 100nm 이하였다).
단 하나의 관심 영역에 작물, 분석 용 이미지 파일의 선택이 열리면 세포에 의해 덮여 게시물을 정의되거나 또는 폐기해야하는 사후 위치를 결정하고, 편향 / 이상적 그리드에 대해 힘을 산출하고, 최종적으로 표준 Office 스프레드 시트에 포함, 수출 가능성을 가진 모든 세포 관련 데이터를 저장합니다.
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Protocol
Micropost 배열 1. 배양 세포
참고 : 모든 단계는 불임을 보장하기 위해 생물 안전 캐비닛에서 수행해야합니다. 여기에 지정된 볼륨은 T25 세포 배양 플라스크에 대한 것입니다. 세포 배양 배지 및 세포 레시피 파종 밀도 골암 세포주 HuO9 및 M132에 최적화되어있다.
- micropost 배열에 파종을위한 세포 배양을 준비합니다.
- 표준 광학 현미경에 배양 플라스크를 배치하여 세포 배양 품질을 검사한다. 세포가 덮여 얼마나 많은 문화 플라스크 바닥의 추정에 의한 전형적인 성장과 형태를 보여 있는지 확인합니다. 70 % -80 %의 범위는 건강한 성장 속도를 반영한다. 그들은 죽은 세포 및 / 또는 자란 문화를 대표로 세포를 부동의 양에주의를 기울이십시오.
- 4 ㎖의 1X 인산염과 중간 및 세척을 제거하여 세포를 Trypsinize은 식염수 (PBS) 버퍼를 버퍼. 셀 때까지 실온에서 0.8 ㎖의 1X 트립신 / 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA)를 첨가하고, 배양약 2-4 분 소요 S를시키다. 현미경으로 프로세스를 확인하고 가끔 빠지을 지원하기 위해 조심스럽게 플라스크를 누릅니다.
- 5 ml의 세포 배양 배지 (둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM), 10 % 소 태아 혈청 (FBS와 / F12), 1 % 페니실린 / 스트렙 (PEN / 패 혈성)) 반응을 정지하고 가만히 잔여 세포를 씻어을 추가 플라스크의 바닥에. 그 후 균일 한 혼합물을 얻기 위해 상하 수회 현탁액을 피펫. 효과적인 빠지을 얻기 위해 플라스크의 원래의 성장 영역에서 모든 솔루션을 피펫해야합니다.
- 15 ML 튜브에 세포 현탁액을 전송하고 3 분 동안 0.5 XG에서 테이블 상단 원심 분리기를 사용하여 원심 분리.
- 상층 액을 제거하고 최대 피펫 팅에 의해 5 배 아래로 5 ml의 배지에서 세포 펠렛을 다시 일시 중지합니다. 그렇게하는 동안 거품의 발생을 방지해야합니다.
- 셀 카운팅 챔버와 microsco 광을 사용하여 세포 농도를 결정PE. 세포 집합체에 대한 세포 계수 챔버에서 세포 현탁액을 확인하고 다음 실험을 위해 단지 하나의 세포를 가지고 확인합니다. 피펫은 세포를 분리 집계를 형성하기 위해 다시 여러 번 아래로 경향합니다.
- 25,000 세포 / ml의 세포 용액을 얻기 위해 충분한 배지로 세포 현탁액을 희석. 밀폐 튜브를 수회 반전시킴으로써 잘 섞는다.
- 세포 파종을위한 micropost 배열을 준비합니다.
중요 참고 :이 잠재적 microposts를 손상시킬 수있는 직접적으로 불필요한 거품이 소개되어 특히, micropost 배열에 피펫하지 마십시오. 또한, micropost 배열이 결코 모세관 힘이 microposts의 붕괴로 이어질 발생하는 것으로 밖으로 건조하지 있는지 확인하십시오.- 핀셋을 사용하여 12- 웰 플레이트의 웰에 직면하고 1 ㎖의 에탄올 (99 %)을 첨가하여 습윤 micropost 어레이 부착 유리 기판을 배치했다. 20 ~ 30 초 동안 실온에서 품어.
- 에탄올을 희석잘 측에 약 1 ㎖의 멸균 탈 이온수 (DI 물)을 첨가하고 전사 피펫 또는 흡인 장치를 사용하여 약 1ml의 흡입에 의해 단계적. 이 단계에서 적어도 3 번 반복합니다.
- 추가하고 약 1 ml의 흡입에 의해 같은 방식으로 PBS 버퍼와 DI-물을 교체합니다. 이 단계를 3 번 반복합니다.
- 추가하고 약 매체의 1 ml의 흡입에 의해 매체와 PBS 버퍼를 교체합니다. 이 단계를 3 번 반복합니다.
- 각 준비 micropost 배열의 상단에 피펫 1 ml의 세포 용액 (25,000 세포). 멀티 웰 플레이트 닫고 인큐베이터로 전송 (CO 2 5 %, 37 ° C). 세포 부착 및 6 -7 시간 동안 microposts 위에 성장 보자.
- 가벼운 현미경을 사용하여 때때로 접착 공정을 검사합니다. 세포의 대부분은 여러 microposts에 걸쳐 퍼져 나타납니다 있는지 확인합니다.
2. 고정 및 염색 세포
참고 : 모든 단계를하고여기에 주어진 볼륨은 12 웰 플레이트의 단일 잘위한 것입니다. 그것은 microposts의 붕괴가 발생합니다 액체의 흡인 후 우물에서 건조를 방지하기 위해 한 번에하지 더 열두 우물의 네 이상을 처리하는 것이 좋습니다.
- 우물에서 대기음 매체와 세척 세포를 1 ml의 PBS 버퍼로 2 배. 배양 동안 micropost 배열에 축적 된 세포 파편을 제거하고 죽은 세포를 분리 PBS로 세척하는 동안 부드러운 힘을 적용해야합니다.
- 5 분 동안 0.5 ml의 3.7 % 완충 포르말린 용액으로 세포를 고정한다.
- 1 ml의 멸균 탈 이온수와 micropost 배열 배를 세척하여 포름 알데히드 용액을 교체합니다.
- 약 90 초 동안 (50 % 물, 40 % 에탄올 및 10 % 아세트산 0.05 % 쿠마시 브릴리언트 블루)와 색소 세포를 염색. 1 ml의 멸균 탈 이온수로 2 배 오프 초과 염색 액을 씻으십시오. 배열을 micropost 1 ml의 탈 이온수를 추가합니다.
- 광학 현미경을 사용하여 염색 결과를 확인한다. 반복 T세포체가 가시화 되기에는 너무 희미 경우 그 단계를 염색.
- 4 ° C에서 냉장고에 상단에 염색 된 세포에 저장 micropost 배열. 항상 물 속에서 그들을 유지하기 위해 확인합니다.
3. 세포 이미징
참고 : 4 단계는 무한 보정 광학없이 현미경에 적용됩니다.
- 고해상도 이미징을위한 얇은 유리 바닥 페트리 접시에 2 ml의 디 - 물을 추가합니다.
- microposts면이 위를 향하도록하여 영상 접시에 핀셋을 사용하여 micropost 배열을 전송합니다.
- 광학 현미경의 이동 무대에 영상 페트리 접시를 놓습니다.
- 스케일 수가 유리 기판, 실리콘 엘라스토머와 위에 액체의 굴절률 부정합을 보상하기 위해, 광 경로를 따른 모든 재료의 전체 두께를 나타낸다까지 촬상에 사용 렌즈의 보정 링을 돌려. 이 microposts의 밝은 모습으로 이어질한다코어.
- 다운 50 %, 조명 측에 조리개를 닫고 일반 명 시야 모드 활성화 광로에서 어떠한 위상차 링을 제거한다.
- microposts가 관찰 들판을 가로 질러 수평 라인을 형성 micropost 배열을 맞 춥니 다. 시작점 (예를 들어, 왼쪽 상단)을 정의하고 다수의 이미지를 복용하는 동안 micropost 배열을 스캔 스테이지에서 페트리 접시 단계적으로 이동합니다.
- 20 배 또는 40 배 목표를 사용하여 카메라의 최고 해상도 설정으로 모든 이미지를 가져 가라. 이미지의 중심에서 단일 세포를 목표로.
- micropost 팁에 초점이 될 때까지 기판을 통해 Z 축을 따라 스윕. 현미경의 미세 조정 초점 휠을 사용하여 약 2 ~ 3 μm의에 대한 micropost 바닥에 초점을 향해 돌립니다.
- (한 번에 하나의 촬상 파라미터 휩쓸고 하나의 어레이 부분의 테스트 이미지의 시리즈를 취함으로써 표준 촬상 확립 수순 예, 노출 시간,조리개 설정, 램프 설정 등). MechProfiler 이미지를 분석하고 빠르고 신뢰성있는 분석을위한 적절한 매개 변수 세트를 결정합니다.
오픈 소스 소프트웨어 "MechProfiler"4. 이미지 분석
주 : 모든 소프트웨어 기능은 마우스 왼쪽 버튼을 이용하여 포인팅 디바이스로 활성화 될 수있다. 그러나, 숙련 된 작업자가 양손 효율적인 이미지 처리를 가능하게하는 키보드의 좌측 절반으로 설계 문서화 단축 키를 사용한다.
- 이미지 분석 소프트웨어 MechProfiler를 시작하고 "열기"를 클릭하여 분석 할 필요가 이미지의 범위를 엽니 다.
- 소프트웨어 개발자에 의해 주어진 "설정"섹션에 모든 매개 변수를 삽입합니다. 맞춤형 소프트웨어 매뉴얼 상세히 기재된 절차에 따라서 (즉, 형상 및 최소 임계 거리)를 구성해야 파라미터를 결정.
- 이미지 분석의 - 한 - "자르기"를 사용하여 관심 영역에 자르기로 (클릭하고 마우스 버튼으로 드래그 누름). 그려진 사각형 안에 두 번 클릭하여이 작업을 완료합니다.
- "세포 윤곽을 그리기"및 셀에 연결된 모든 microposts을 포함하여 도면에 대한 십자 커서를 사용을 클릭하여 각각의 눈에 보이는 세포 개요 하나씩을 표시.
- "취소 게시물"을 클릭하여 원치 않는 microposts을 취소하고 그리기 십자 커서를 사용합니다. 이미지 섹션 외부의 셀에 속하거나 그 어떤 다른 이유가 아니라 관심의 세포에 의해 편향되는 모든 microposts을 묶습니다.
- 소프트웨어 서브 루틴 마우스 클릭하여 "무게 중심 찾기"를 시작합니다. 바로 옆에 자신의 중앙에 붉은 십자가가 눈에 보이는 모든 microposts가 등록 될 때까지 "무게 중심 찾기"버튼에 필터 설정을 조정합니다. 필터 설정이 너무 경우가 너무 높은 경우, MU 낮은 microposts은 무시 될 것이다ltiple 위치는 하나의 micropost에 대해 표시됩니다. 분석 세션 동안 일정하게 설정 필터를 유지합니다.
- 여러되거나 누락 micropost 위치와 무게 중심의 매뉴얼 편집 기능 "수동 편집"를 사용합니다. 클릭을 가로 질러 드래그하여 문제의 micropost을 선택하려면 마우스 크로스 헤어를 사용합니다. 사각형 내부를 두 번 클릭하고 자동으로 닫힙니다 확대 된 이미지 섹션에서 누락 된 빨간색 마커를 배치합니다. 이 그린 셀 개요를 벗어나면 이러한 micropost 폐기 진행하기 전에 (단계 4.5 참조).
- 마우스 클릭으로 "그리드 생성"기능을 활성화하여 이상적인 micropost 그리드를 찾아보십시오. 위치 그린 셀 내부 윤곽선 블루 링으로 도시 진정한 micropost 헤드, 대응 확인.
- 마우스 클릭으로 해당 "마누엘 편집"기능을 사용하여 필요한 셀 영역 내부에 잘못 그리드 메이커를 수정합니다. 한때의 micropost을 선택 십자선을 사용하여클릭을 가로 질러 드래그하여 estion. 나타나는 사각형 내부를 두 번 클릭하고 자동으로 닫힙니다 확대 된 이미지 섹션에서 누락 된 파란색 마커를 배치합니다.
- micropost의 화상 부 내측 위치 및 생성 된 이상적 그리드 간의 차이에 기초하여 계산 된 편차 값들의 히스토그램을 얻기 위해 마우스 버튼을 클릭하여 "계산 처짐"를 사용.
- "저장"에 마우스를 클릭하여 값의 테이블을 포함한 완전한 분석을 저장합니다.
- "보기 재설정"편리 오른쪽 키보드 커서 키를 사용하여 수행 할 수 있습니다 "다음 이미지"에 다른 이미지 섹션 또는 마우스 클릭을 분석 클릭하거나 이미지 분석을 계속합니다.
5. 데이터 분석 - Mechanoprofiling
- 분석 된 이미지가있는 폴더에서 오피스 스프레드 시트 프로그램을 사용하여 파일 "results.xls"를 엽니 다. 그것은 알루미늄과 데이터를 포함분석 된 셀의 모든 micropost의 처짐 및 작업 (즉, 기판의 변형 에너지)와 같은 표준 파생 조치를 포함하여 L 계산 된 값.
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Representative Results
설명 된 기술의 주요 장점은 일상적인 실험실 작업에 신속하고 효율적인 통합을위한 단순하고 잠재력에있다. 오픈 소스 소프트웨어와 결합 고품질 상용 센서 어레이의 조합하고자 달리 이미지 분석 소프트웨어 개발의 지식 크린룸 시설 및 심층 액세스해야 - 기계 감도에 대한 정보를 제공한다. (1)가 제공 방법의 흐름을 도시한다. 그것은 micropost 배열에 세포를 준비 시드로 시작합니다. 세포를 고정하고 염색 후 micropost 어레이는 이미징을위한 준비가되어 있습니다. 기술의 중앙부는 MechProfiler 소프트웨어를 사용하여 이미지 분석이다. 사용자는 즉시 GUI의 "설정"에 관련된 모든 매개 변수를 입력 한 후 이미지를 analyszng 시작할 수 있습니다. 대응하는 픽셀의 크기는 단일 픽셀로 표현하고, 사용자의 설정에 따라 결정되는 길이이다. 그것은 필요알려진 크기와 물체의 이미지를 고려하여 각각의 사용 확대에 대해 개별적으로 설정할 수 있습니다. 예 부가도 9에 제시되어있다.
강하게 분석 프로세스 영향으로 화질이 중요한 요소이다. 특히도 2에 도시 된 바와 같이 하나의 안정하고 일상적 서비스 이미징 플랫폼을 가지고 있는지 확인한다 최고의 품질을 달성하기 위해, 광원의 배향을 분석 할 때 문제가 될 수있는 불필요한 그림자 발생할 오정렬만큼 중요 이미지. 이 촬상시에 추가적인 안정성을 제공한다 더욱이, 방진 테이블 또는 판 위에 광학 현미경을 배치하는 것은 대부분의 실험실에서 유리하다.
이미징을 위해 얇은 유리 바닥 페트리 접시를 사용하는 장점은 증가 된 해상도와 더 밝은 이미지로 변환 높은 유효 개구 값을 포함한다.
때 타키microposts 팁에 집중하는 것은 용이로 50 % 폐쇄 홍채 인해 선명하고 어두운 고리로 나타나는 둘레에 추천 밝은 필드 모드에서 이미지를 겨. 사용자의 목적은 보정 링을 가지고있는 것은 또한, 그것은 그것을 정확하게 설정하는 힘 정확한 판독을 달성하기 위해 필수적이다. 그 기능의 영향은도 3a 및도 3b를 비교함으로써 알 수있다.도 3c에 신속 같이 최적의 조명과 함께 보정 링의 정확한 설정을 조합함으로써 달성 될 수있는 이미지를 분석한다. 이 검색 알고리즘 속도로 micropost 및 그 주변 사이의 강한 대비 분석 시간을 감소시킨다. 사용자는 최소한의 경험을 쉽게 분석 할 수있는 이미지를 달성하기 위해 필요하다는 것을 발견 할 것이다.
중요한 것은, 위의 프로토콜은 루틴에 micropost 배열의 신속하고 효과적인 통합에 대한 중요하고 일반적인 장애물을 극복실험실 작업. 전용 센서의 재현성, 감도 및 정확도 철저하고 상세한 실험 특성화함으로써 달성 수요 -이 장애물은 어레이의 품질을 제어 할 필요성에 기인. 그러나, 시판 micropost 어레이에 돌려 상당한 장애물이 완전히. 회피도 4a 및도 4b는 micropost 어레이의 정확성을 도시한다. microposts 위치의 편차가 아니라 200 nm의 아래 및 사용 설정을위한 82 nm의 픽셀 크기 결과 카메라 / 목적 조합을 함께 "픽셀 오류"와 같은 비교로입니다. microposts 편향 세포 이미지 분석 잡음비 편안한 신호 선도 (도 4c 및도 4d에 도시 된 바와 같이) 셀 부과 편향에 대한 값은 대략 200nm보다 높은 것을 보여준다.
그림 5 illustratES 이미지 내의 microposts 출전 용의 다른 종류는 편향 여부 따라. 비 편향 microposts 위에서 언급 한 바와 같이 주위 어두운 반지와 밝은 원형의 모양을 가지고있다. 이들의 위치는 디지털 화상 분석 피쳐 추출 기법 허프 변환을 사용하여 결정될 수있다.
또한, 도립 현미경에 편향된 microposts 어두운 반달 모양 (도 5a 참조) 두 개의 대향 표시 보여준다. 두번째는 검출 곤란해진다 반면 직립 현미경 micropost 팁과 하나 어두운 반달 모양의 가장자리가 제대로 볼 수 있습니다. 이러한 특성은 본 프로토콜 개발되었으며 "형상 접근"명명 하였다 편향 microposts로부터 팁의 명 시야 현미경 이미지의 위치를 산출하기위한 기초가된다.
도 5b는 HuO9 뼈 암의 한 예입니다거꾸로 현미경 (위)에 몇 군데 microposts에 세포. 해당 이미지의 분석 버전이 적용된 형상 접근 (아래). 그림 5C는 직립 현미경 (위)와 같은 micropost 배열을 사용하여 찍은의 결과를 보여줍니다. 다시 분석 버전 형상 접근을 사용하는 결과를 나타낸다.
모든 이미지 분석 세션은 MechProfiler의 "설정"섹션에있는 매개 변수의 사용자 인증으로 시작됩니다. 일부는 micropost 배열의 차원과 스프링 상수 같은 micropost 제조업체가 제공됩니다. 기타는 같은 형상 임계치와 소프트웨어 매뉴얼에 설명 된 절차에 따라 최소의 편향에 대한 임계 값으로서 사용자에 의해 정의된다. 그러나,이 값은 신중하게 선택해야하며 비교를 보장하기 위해 이미지의 상호 세트 내의 모든 이미지에 대해 일정해야한다는 것이 중요하다. 화상 analysi위한 전처리 단계 반면S "는 찾기 무게 중심", 같은 소프트웨어 기능 "그리드 생성"과 "형상 접근"더 자세한 설명이 필요위한 기본 전략을 자기 설명, 자르기처럼된다.
기본 micropost 위치 검출 알고리즘 (제조자로 전달되는) "찾는 무게 중심"소프트웨어 기능을 이용하여 시작된다. 이 알고리즘은 첫 번째 micropost를 검색하는 이미지의 왼쪽 상단 모서리에 시작합니다. 그 후 다른 모든 microposts은 육각형 형상 다음과 같은 제조업체에 의해 주어진 그리드 및 micropost 크기에 대한 첫 번째 micropost의 좌표를 더한 값을 기준으로 발견된다. 각 발견 micropost의 중심은 허프 변환을 사용하여 계산됩니다. GUI의 명령 단추 옆에있는 필터 슬라이더는 이러한 변화의 감도를 조정 허용한다. 모든 발견 microposts는 빨간색 십자가로 표시하고 그들의 위치는 SU 유명하다bsequent 처리합니다.
다음으로, "그리드 생성"기능은 모든 microposts 팁의 좌표로 연결됩니다. 이들은 다단계 프로세스의 결과이다. 제 최적화 기능은 이상적 그리드를 확립하기 전에 실행 "무게 중심 찾기"알고리즘에서 초기 위치를 포함하여 해결된다. 두 번째 셀 영역 내부 microposts의 위치가 계산된다. 이상적인 그리드 설정 매개 변수 "최소 편향 임계 값"상대에 정의보다 적은 편향과 Microposts은 휴 변환으로 처리됩니다. 다른 모든 micropost 팁 위치 편향 microposts위한 상술 형상 접근을 사용하여 계산된다. 여기에 소프트웨어 (그림 5A 참조) 거리 (어두운 밝은) 원형 모서리에 대한 세포 센터에서 15 °의 각도 내에서 초기 중심에서 검색을 시작합니다. 그 가장자리가 주어진 micropost 직경 원을 발견되면 T로 장착되어있다GUI의 설정에서 컨투어 문턱 값을 이용하여 모자 가장자리. 즉, 매개 변수는 픽셀의 회색의 값이 피팅 프로세스에 사용되는 결정합니다. 이 높을수록 그 값은 피팅이 밝은 micropost의 중심을 향해 몸을 숙 더 낮을는 어두운 micropost 개요에 그 원에 맞는 더 많은 가치를 그. 일단 모든 이미지가 인공 편향을 추가하거나 너무 보수적 편향을 호출하는 것을 방지하기 위해 주어진 연구에서 분석에 대한 값이 일정하게 유지하도록 선택.
예를 들어,도 6은 적절한 형상의 임계 값에 대한 결정의 중요성을 나타낸다. 소프트웨어는 사용자가 물리적으로 가능한 모든 조명 상황을 포괄하는 넓은 범위 (으로 0.1 내지 0.9)을 위해 선택할 수있다. 두 극단 중간에 실제적인 가치를 부여 편향 거리에 광 정보의 번역은 그림 6의 (b)에 주어진다. 그러나 훈련 소프트웨어 사용자들은 convergE 매우 유사한 형상의 임계 값,도 6c에서 알 수있는 바와 같이 유사한 결과 선도. 또한, 세포 염색 및 이미징을위한 표준 절차를 사용하면, 일반적으로 이미지의 세트에 대해 상호 일정한 내에 유지되어야 잘못된 컨투어 임계 값의 위험을 최소화한다.
방법의 견고 함을 입증하기 위해 프로파일 링 결과 - 기계의 선택은도 7에 요약되어있다.도 7a 개의 뼈 암세포 HuO9 결과 및 M132 두을 비교한다. 네 개의 배열은 동일한 생산 배치에서 동일하며, 따라서 기계적 특성을 갖는다. 분석은 최소한의 편향 (0.25 μm의)에 대한 매개 변수의 고정 세트 및 윤곽 임계 값 (0.125)에 대해 수행되었다. 또한, SAOS 2 골 암에서 이미지의 두 개의 동일한 세트 매개 변수 설정 (그림 7 참조에 대한 자세한 정보없이 두 분석가들에게 주어졌다B). 염색 분석에의 영향은 계속해서 염료를 제거하고 쿠마시 블루로 염색 R. 뼈 암세포의 이미지를 취함으로써 시험 하였다. 쿠마시 블루 G 재 염색 후 화상의 제 2 세트가 수행되었다.도 7C는 최소 편향 (0.25 μm의)에 대해 동일한 값을 갖는 동일한 사용자가 분석되었다 모두 일련의 결과 및 형상 임계 값을 나타낸다 (0.25) .
인가 - 기계 프로파일의 전형적인 예는 컴파일 된 데이터는 네 개의 어레이 각각으로부터 풀링 된 셀 (151)을 분석 한 후 골암 세포주 HuO9과 M132을 위해 제시되는 것을도 8a에 제시되어있다. M132 이미 HuO9 세포 M132보다 더 많은 힘을 나타내는 것보다이 개요의 모든 지표 값은 HuO9에 대한 더 높다. 그러나, 이미지 분석 데이터로부터 더 잘 이해하기 페닐 채굴 할 수있는 추가의 단일 셀 정보의 많은 양을 포함주어진 행 내의 otypic 세포주 동작 및 세포 간 가변성. 박스 플롯 micropost 당 힘의 결과를 제시 한 유사한 최소값과 최대 값에도 불구하고, 데이터 값이 서로 다르게 분포되어 실제로 HuO9 세포는 고도로 전이성 M132 라인보다 높은 하중을 적용하는 경향이 낮은 전이성 세포주 (도 참조 것을 발견 8B). 또한, 셀 영역에 대하여 하중 값을 구분하여 하나의 셀당 평균 힘만을 M132뿐만 아니라 micropost 증가 당 평균 힘 세포 확산로서 해당 게시물에 도달 당 평균 힘까지 비교 HuO9 전지용 상승되지 않는 것을 발견 AS (도 8c에서 알 수있는)보다 안정된 값. 또한 일곱 microposts를 덮는 셀 값들은 전형적으로 인해 중앙 하나 육각형 나타나는 사실 아마 인, 거의 동일 비 편향된 이들 세포주 micropost 독립적. 그렇다 DIFF에서erences 수축성, 형태 적 차이가 흥미로운 결과를 정량화 할 수있다. 높은 전이성 M132 세포는 대조적으로 예를 들어 세 개의 microposts 덮여 거의 HuO9 세포가 있었다. 세포주 사이의 다른 형태의 비교가 덮여 microposts의 숫자로 표시되는 셀 영역의 분포를 포함 할 수있다.도 8D는 microposts 위에 성장하는 경우에 두 개의 세포주는 또한 동적 확산 거동에 차이가 있음을 보여주고있다. 즉, 부모의 세포 라인에 대한 mechanoprofile은 HuO9은 일반적으로 특징적으로 적은 microposts을 포함, 더 많은 영역을 커버 및 전이성 세포 라인 M132, HuO9에서 파생 공격적인 세포 반면 microposts에 조금 더 힘을 적용하는 것이 밝혀과 micropost 당 더 적은 힘을 적용 . 이러한 결과는 차별적 애플리케이션 TFM 기반 접근의 가능성을 증명한다.
그림 2. 이미징 설치. 표준 거꾸로 현미경은 micropost 배열에 세포 이미징에 사용됩니다. 설치는 또한 데이터 저장 기능을 제공 할 수있는 현미경과 카메라 제어부를 포함한다. 도시 대형 스크린은 필수적이지는 않지만, 그럼에도 불구하고 확장 촬상 편리세션. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
micropost 영상 그림 3. 가이드 라인. 밝은 필드 모드에서 40 배 렌즈로 찍은 micropost 배열에 염색 된 세포의 (A) 이미지. 이미징 때 비 편향 microposts은 어두운 고리를 나타납니다. 편향 게시물은 어둡고 밝은 하위 영역 모두 타원형을 가정합니다. microposts을 커버 염색 된 세포는 그들 micropost와 세포 사이의 대비가 없다는 점에 더 어두워 보이게. (B)는 동일 이미지 렌즈 보정 링을 조정하고 다시 포커싱 후 촬영. 여기에 microposts의 코어는 실질적으로 밝아지고 더 많은 대비를 제공합니다. (C) 이후에 다시 묘화 adjus 동일한 위치팅 카메라 컨트롤러 모든 조명 매개 변수를 설정합니다. 자유롭게 서 microposts 어두운 반지와 같은 밝은 원을 나타납니다. 편향 microposts가 당기는 축을 따라 하천의 만곡부 코어 주위에 뚜렷한 반달 "그림자"를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. >
그림 4. 분석 microposts의 MechProfiler 스크린 샷. () 하늘의 전형적인 예 micropost 배열이 스크린 샷에서 볼 수 있습니다. microposts 일정한 각형 패턴으로 배치된다. (B)이 microposts에 대한 편향 값 히스토그램은 모든 값이 200 나노 미터 아래에있는 것을 알 수있다. HuO9 뼈 암세포 피복 (C)의 전형적인 예여러 microposts 당겨. 이는 인상 량이 불균일 것을 알 수있다. (D) HuO9 셀에 대한 편향 값 히스토그램 micropost 기판과 세포의 상호 작용에서 발생하는 처짐의 폭 넓은 스펙트럼을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5. Micropost 밝은 필드 조명에 출연하고 이미지 내에서 자신의 위치를 계산하기위한 전략. (A) 비 편향 microposts 어두운 외부 링 밝은 원형의 영역으로 나타납니다. 중심은 하프 변환에 의해 계산된다. 편향 microposts 어두운 반달 모양을 보여줍니다. microposts는 Light 미사용에 직면하는 경우 현미경 설정에 따라 T 소스 (예를 들어, 거꾸로 현미경)이 잘 보이는 반달 모양이 있습니다. microposts 렌즈에 직면하는 경우 (예를 들어, 직립 현미경) 하나만 반달 잘 볼뿐만 아니라, 팁의 매우 가장자리이다. 두 경우 모두 형상 접근은 micropost 팁을 계산하는 데 사용되어야한다. HuO9 뼈 암 세포와 윤곽 접근 방식을 사용하여 분석 버전 (아래)에서 거꾸로 현미경을 사용하여 (B) 원본 이미지 (위). (C) 직립 현미경 다시 형상 접근 (하단)을인가 분석 버전을 사용하여 동일한 micropost 어레이 (상부)에서 원본 이미지하지만 어두운 링 형상의 가장자리를 호출하기에 더 적합 훨씬 낮은 윤곽 임계치.와 주세요 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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형상 접근 및 적절한 임계 값을 선택 6.도. (A)는 세 개의 스크린 세 가지 형상의 임계 값을 이용하여 동일한 분석 microposts를 나타낸다. 값이 설정되어있는 경우 너무 낮 (왼쪽) 또는 (오른쪽) 소프트웨어가 제대로 micropost 헤드를 나타내는 파란색 링에 맞는보다 너무 높다. 이 과소 또는 micropost 헤드의 실제 위치를 오버 슈트. 제대로 선택 임계 값은 편향을 통해 형성 micropost 내부의 어두운 영역 모양의 반달에 그 블루 링에 맞게 소프트웨어를 할 수 있습니다. (B)의 그래프는 위에 표시된 microposts의 선택 윤곽 임계 값에 따라 편향의 평균 양을 보여줍니다. 또한, 형상 끼워 맞춤이 적용되지 않기 때문에, 세포의 윤곽 외부 microposts의 값이 영향을받지 않는 것을 나타낸다. (C)의 그래프는 선택하는 것을 도시적당한 간격 내에서 임계 값이 과다 또는 과소 평가 micropost 편향의 위험을 minimalizes. 다른 훈련을받은 사용자가 선택한 값 사이의 차이는 평균 편향 값의 허용 차이가 발생 0.05,보다 일반적으로 작다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 가지 골암 세포주에서 메카 프로파일 결과 견고성 테스트; 오차 막대는 하나의 표준 편차를 나타냅니다 (A) - 기계 프로파일 배열 3 배열 1, M132에 HuO9 세포를 파종 한 후 4 개의 동일한 micropost 배열의 결과를 -. 사일 나중에 배열 (4) (B)에 배열 2 M132에 HuO9 시드 M 결과의 비교두 개의 독립적 인 분석에 의한 분석 후 이미지의 동일한 세트를 기반으로 echano - 프로파일 링. 첫 번째는 쿠마 블루 R와 쿠마 블루 G. 완료 염료의 제거 및 재 염색에 이어 두 번째로 염색 후 촬영 다른 이미지 시리즈 두에서 이미지 분석 결과 (C) 비교 여기를 클릭하십시오이 그림의 더 큰 버전을 보려면 . >
도 8 골암 세포주 - 기계 프로파일. (A) 두 골 암 세포주 HuO9 간의 비교 (낮은 전이성 전위) 및 M132 (고도로 전이성) 그래프는 모든 지표 값 (HuO9 세포주 높은 것을 보여준다 총 N = 302; 두 개의 독립적 실험 세트 오차 막대 = 표준 편차). (B trong>)에서 박스 플롯 micropost 당인가 힘 하부 나노 뉴턴 범위에 있다는 것을 나타낸다. 그러나 HuO9 세포 M132 세포 (수염 데이터 최소 및 최대를 나타낸다)보다 당긴다. (C)와 유사한 결과가 microposts 동일한 수의 셀을 커버를 비교함으로써 알 수있다. HuO9 셀은 M132 세포보다 더 많은 힘을 적용합니다. 세 microposts을 포함 HuO9 세포의 수는 대표 만 완전성 (오차 막대 = 표준 편차)에 포함되지 않습니다. (D) 적용 microposts의 수에서 다른 배포판 micropost 배열과 상호 작용할 때 각 뼈 암 세포주가 자신의 확산 특성을 갖고 있음을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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부가도 9는 현미경 설정을위한 픽셀 크기는 전형적으로 그것의 스케일 바 특수 현미경 슬라이드를 사용하여 결정되고; 대안 적 제조자에 의해 지정된 micropost 어레이 레이아웃을 사용할 수있다. 예를 들어, (이미지 프로세싱 툴 확립) 2,375 픽셀로 나눈 13 마이크론 (195 μm의 총 길이)와 15 단위가 0.082 리드 μm의 / PXL. 여기를 클릭하세요 이 그림의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다.
보충도 거꾸로 현미경에 두 개의 조명 기술을 이용하여 동일한 위치에서 촬영 HuO9 골암 셀 (10)의 이미지의 비교; DIO 스테인드 microposts은 녹색 형광 있습니다. ( 밝은 필드 모드. (B)는 내가 녹색 형광 채널로 전환 한 후 찍은 MAGE 분석 재 초점없이. (C) 매우 micropost 팁에 초점을 수정 한 후 두 번째 형광 이미지. 두 조명 채널 (D) 오버레이 예시 목적으로 만. (E) 세 가지 이미지의 결과로 지표 메카는-프로파일. 전체 편향이 형광 이미지에서 추정 할 수없는 초점을 보정에도 불구하고. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 인터넷직립 현미경에 DII를 사용하여 형광 염색 microposts의 같은 위치의 gure 11. 이미지 시퀀스 (A) 밝은 필드 이미지입니다.; 끝에서 서로 닿지 세 microposts이있다. (B) 약간 microposts '머리 위에 형광 채널로 전환 한 후 동일한 위치. microposts의 바로 그 팁에 초점면을 낮추는 (C). (DE) 더 microposts '바닥을 향한 초점면을 단계적으로 낮추는 후 연속 이미지. (F) 실리콘 엘라스토머 기판 내부의 초점면을 낮추는 후 microposts의 이미지. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 그림 MechProfiler GUI의 12 스크린 샷. HuO9 뼈 암 세포를 프로파일 링에서 일반적인 분석 결과. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 작품은 실질적으로 진입 기술 및 실제적인 장벽을 낮춤으로써 견인 힘 현미경 분야의 발전을 추구한다. 이 장벽은 양측에서 온다. 가장 먼저 재현성 제조 및 실험적 micropost 배열을 의뢰하기 위해 극복해야 할 많은 비 사소한 기술적 문제가 있습니다. 전형적인 실험이 수백 또는 세포의 수천의 분석이 필요할 수 있습니다 염두에두고 - 둘째, 마찬가지로 적지 않은 단일 셀 힘의 신뢰할 수있는 반자동 분석이 필요하다. 전술 한 기술은 주민 엔지니어링 전문 지식이없는 세포 생물학 실험실 내에서 micropost 기반 견인 힘 현미경에 액세스 할 수 있도록하기 위해 개발되었습니다. 이 문서에 제시된 센서 및 분석 기술은 비전문가가 쉽게 정확하게 하나의 세포에 의해 가해지는 힘을 분석 할 수 있어야합니다.
그렇다 세포 생물학 (L)에 액세스로부터적어도 중급 밝은 필드 현미경 AB는 설명 방법은 몇 가지 추가 기술적 인 요소가 필요합니다. 여기에 대부분의 사용자는 기술의 힘과 다양성에도 불구하고, 심지어 제한된 경험을 가진 유효한 견인 힘 현미경 실험을 수행 할 수 있습니다. 그럼에도 불구하고 고려되어야 제시된 프로토콜의 세 가지 중요한 측면이있다. 첫째는 micropost 배열은 항상 붕괴 그 모세관 힘에 방지하기 위해 액체로 덮여 있는지 확인하는 것이 필요하다. 두 번째는 최선의 노출 시간, 아이리스의 조리개와 보정 링의 위치를 변화시키면서 동일한 배열 위치의 일련의 이미지를 취함으로써 수행된다 micropost 취득한 화상에 대한 촬상 파라미터를 최적화 할 필요가있다. 그것은 micropost 팁에 대한 정확한 초점 평면을 찾는 것이 중요하며,이 형태는 센서 어레이의 작은 차원 깊이 주어진 경험을한다. 공개적으로 접근 가능한 이미지 분석 소프트웨어 MechProfiler의 discusse을 다운로드해야합니다 세 번째여기 거라고하는 상세한 사용자 매뉴얼 및 교육 예는 다운로드 사이트에서 구할 수 있습니다. 적합한 현미경 설정을 구성 할 수 있도록 수동으로 제공되는 예를 분석하는 소프트웨어를 사용 경험 한 후, 사용자는 촬상 설정에 시험 화상이 사용될 취해야한다. 얻어진 화상에 기초하여, 형상의 임계 값은 마찬가지로 최적화되어야한다. 단일 micropost 화상은 몇 시간 내에 (셀 수백 분석) 통계적으로 중요한 결과의 발생을 허용 관계없이 하나 이상의 셀을 포함하는지 여부의 오픈 소스 MechProfiler 소프트웨어를 사용하여 분 이내에 훈련 사용자에 의해 분석 될 수있다 .
일부 조정이 필요 다른 태양은 어떤 응용 세포 염색 과정의 최적화이다. 세포가 과도하게 묻은 경우 소프트웨어는 올바른 micropost의 위치 등록이 실패 할 수 있습니다. 염색이 너무 약한 경우, 다른 한편으로는 검출 할 수있는 사용자에 의해 더 많은 노력이 필요얇은 세포 돌기로 "true"로 세포의 윤곽이 누락 될 수 있습니다.
그러나, 세포 염색 및 배열 이미징 절차의 고정 프로토콜을 적용하여이 오류의 범위는 허용 가능한 낮은된다. 이 작업 동안 다른 세포 염색 절차 크리스탈 바이올렛, 트윈 20 또는 트리톤 X 또는 에오신를 추가하여 염료의 조합과 같은 계면 활성제의 존재하에 다양한 농도에 기초하여, 시험 하였다. 그럼에도 불구하고, 실험에서 실질적으로 변화 염색의 강도뿐만 아니라 안정성을 실험한다. 전술 한 바와 같이 브릴리언트 블루 G만을 사용은 여전히 박형 전지 윤곽을 볼 수 있지만, 충분한 강도로 현상 된 형상 접근을 방해하지 않고 결합 허용 가능한 세포 얼룩 내성을 보여 주었다.
일반적으로 제시된 기술을 수정하는 옵션이 있습니다. 형광 현미경 염색 소기관으로 여기에 제시된 시야 기술을 조합함으로써, 예를 들어세포 역학의 맥락에서 기본 세포 프로세스에 대한 추가 정보를 제공 할 수있는 핵 또는 액틴 필라멘트 네트워크, 등을들 수있다. 또한, 사용한 장쇄 알킬 carboxycyanines (DII 또는 DIO) microposts 형광해진다. 14 그럼에도 불구하고,이 기술에서 각각의 표시 편차를 제어하는 것이 중요하다. 보충도 10 및 그림 11은 잠재적 인 함정을 설명한다. 거꾸로 현미경을 사용하여 녹색 형광 채널 (그림 10B와 10C)에서 쿠마 블루 G 염색 NIH 3T3 섬유 아세포의 세포 찍은 이미지는 잘못된 위치 분석 (그림 10E)로 이어지는 주요 micropost 기관이 아닌 자신의 팁을 제시한다. 셀 얼룩에 의한 형광 신호의 흡수로 인해 수 밝은 필드 모드 micropost 팁 몇 군데되지 않을 수 있습니다 (그림 10A)로 전환 한 후 다시 집중하기 위해 최선의 노력에도 불구하고. 이것은 IMA 대조적이다직립 현미경 (도 11B-11F)의 황색 형광 채널로 촬영 GES가 상기 복수 선명한 이미지는 Z 축을 따라 얻을 수있다. 여기에서 사용자는 이미지가 불량 편향 값을 호출 피할 micropost 바닥에 가까운 어딘가에 매우 팁 (도 11C)에 초점면으로 취하고되지 않도록 할 필요가있다.
그것은 micropost 분석 기술의 한계가 있다는 것을 또한 주목해야한다. 예를 들어, 검출 된 편차의 정확도는 광학 설치의 품질에 의존한다. 현미경은 종종 연결된 카메라의 감광도가 다수의 화소보다 더 높은 우선 순위를 갖는 형광 이미징을 위해 최적화된다. 당연히, 이것은 더 큰 픽셀 크기의 이미지로 이끈다. 또한,이 세포 돌기 기판 하단에 도달하면 명 시야 이미지를 결정할 수 있음을 유의해야한다. 그러나, 상업적 micropost 어레이는 촛점을 사용하여 테스트 하였다현미경 사용. 그것은 세포가 micropost 배열의 나머지 micropost 팁에만 접착을 촉진 아닌 바이너리 코팅을 받아 들일 것으로 보인다 것으로 나타났습니다. 또 다른 요인은 0.2 μm의 것으로 밝혀졌다 micropost 어레이의 위치 오차로부터 도출한다. 함께 2.8 윈 / μm의 주어진 스프링 상수이 0.6 윈의 힘 판독의 오류로 이어집니다. micropost 분석에 대한 또 다른 제약은 여러 셀에 의해 공유 microposts에서 적용 힘이 결정되지 않을 수 있다는 사실에서 유래. 따라서, 오직 고립 된 단일 세포를 분석 할 수있다. 제시된 프로토콜에 대한 특별한 제한은 신뢰할 수있는 결과를 얻기 위해 사용자에 대한 교육 일정량을 필요 민감한 형상 접근의 올바른 애플리케이션으로부터 유도한다. micropost 어레이는 수평 또는 관찰 영역의 가장자리를 따라 수직 라인을 형성하도록 정렬되는 것을 또한, 빠른 분석을 위해 사용자는 이미지를 취한다. DespitE 육각형 그리드 지오메트리 내의 microposts를 찾기위한 소프트웨어 알고리즘이보다 5 ° 오프 축 회전 각도에 의해 microposts의 촬상을 한정되지 않는다는 불완전한 microposts 후 리드를 함유하지 않고 어려운 화상 부분을 잘라낼 수 있도록 사실 "그리드 생성"기능의 실패에. 이러한 경우에 사용자는 micropost 위치를 분석하기 시작하기 전에 통합 회전 기능을 사용할 수있다.
설명 된 방법은 주로 두 골암 세포주 HuO9라는 부모 세포주, 및 M132 표시된 유래 높은 전이 라인의 특성을 적용 하였다. 이 문맥 백에 여섯 단세포 이미지 시야 모드에서 촬영하고 MechProfiler 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 후속 데이터 마이닝은 부모 세포주 HuO9가 약간 더 힘을 발휘하고 일반적으로 전이성 세포주 M132에서 세포보다 세포 당 microposts을 커버 것으로 나타났다. 그러나 세포예상 결과 광범위한 기여 정착의 순간에서 세포주기의 다른 단계에 따라서 동기화되지 않았다. 24 시간까지의 기간에 걸쳐 라이브 셀 이미지를 취함으로써, 그것은 다른 사람이, 확산 차단을 마이그레이션하고 다른 속도 (보충 동영상 참조) 다시 마이그레이션 반면 확산 후 많은 세포가 초기 위치에 유지 한 것으로 나타났습니다. 이것은 셀의 기계적 프로필 종종 일정하지 및 세포 집단에 걸쳐 또는 현재 활동에 따라 단일 셀 내에서 크게 달라질 수 있음을 나타낸다. 또 다른 요인은 셀이 셀은 평탄면에 부착하고 미세한 단계로 이주 할 수 고전 TFM, 대조적 인 다른 micropost 도달 이산 마이그레이션 단계를 수행하도록 강요된다 micropost 배열에 해당 될 수있다. 그러나, 이러한 작은 단계를 분석하기 위해 매우 진보 m에 대한 액세스를 요구하는 초점 포인트의 밀착성 형광 이미지를 고려할 필요가있다icroscopes 매우 정교한 이미지 분석 소프트웨어. 그럼에도 불구하고, 큰 개체군 내의 기계적 프로필 분포는 여전히 종종 세포주의 특성을 정의한다. 따라서 다수의 셀의 특성을 가능하게 높은 처리량 방법이 필수적이다. 여기에 제시된 수동 이미징 프로세스 및 오픈 액세스 소프트웨어는 완전 자동 현미경 시스템에 확장을위한 큰 잠재력을 품고.
요약하면 강력한 견인 힘 현미경의 접근 방식은 표준 세포 생물학 실험실에서 쉽게 채용입니다 표시됩니다. 이미지 분석에 세포 파종에서 전체 워크 플로우는 간단하고 효과적이다. 여기에 설명 된 프로토콜이 완전히 기능하지만, 개선도 생균 촬상으로부터 이미지 시퀀스의 해석을 단순화 직교 레이아웃 및 개발 절차 micropost 어레이를 처리 할 수 있도록 분석 알고리즘을 적응 진행 중이다. 뼈 암세포 리튬에 대한 결과와 문맥NES, 여기에 설명 된 방법은 이러한 분석법 골 암 환자로부터 생검 세포의 전이 잠재 성을 예측하기 위해 임상있게 예후 값을 보유 할 수 있는지 여부를 설정하기 위해 임상에서 생검 화면 셀에 사용될 수있다. 이러한 분석은 치료 전략에 영향을 미칠 것이다. 다른 잠재적 인 애플리케이션은 잠재적으로 약물의 효능 또는 독성을 수립을 지원하기 위해, 평활근 세포 또는 심근 세포와 같은 세포에 기계적 활성 시험 약학 적 활성 화합물에 관한 것이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm |
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
- Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
- Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
- Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
- Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
- Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
- Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
- Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
- Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
- Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
- Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
- Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311 (2007).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
- Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).
