Gemakkelijk en nauwkeurig voor mechanische profilering op MicroPOST Arrays

Introduction

Mechanisch gevoelige cellen gebaseerde assays mogelijk maken onderzoeken hechtende cellen met een breed toepassingsgebied dat de centrale rol kunnen spelen in de mechanica celbiologie weerspiegelen. Deze toepassingen richten zich vaak op de onderliggende mechanismen die subcellulaire processen of whole-cell gedrag sturen. Enerzijds kunnen externe omgevingsfactoren zoals extracellulaire matrix samenstelling of matrix stijfheid dramatische invloed op de mechanische en biologische reactie van een cel. ¹ Hetzelfde kan worden waargenomen na toepassing van vele klassen van farmaceutisch werkzame verbindingen, waarvan de gevolgen zijn vaak gekenmerkt gebruik celkweekmodellen. ² Anderzijds genotypische eigenschappen, zoals die veroorzaakt door spontane of experimenteel geïnduceerde genetische mutaties, kunnen duidelijke veranderingen in cel fenotype die zijn geassocieerd met veranderingen in het cytoskelet structuur en functie induceren. ³ Deze voorbeelden zijn slechts enkele van de vele mogelijkeOnderwerpen waarvoor mechanische fenotypering van cellen is relevant, en al deze zijn nuttig onderzocht met MicroPOST arrays.

Op het moment van dit schrijven, hebben ongeveer 200 artikelen gepubliceerd beschrijven cel-MicroPOST interactie. Deze werken bespreken theoretische aspecten van MicroPOST afbuiging principes en praktische instructies voor de vervaardiging ervan. Het eerste artikel beschrijft de interactie van cellen en flexibele MicroPOST arrays werd gepubliceerd door Tan en collega's in 2003. ⁴ In tegenstelling tot de klassieke trekkracht microscopie (TFM), waar continue zachte substraten worden gebruikt voor het schatten nanonewton schaal cel contractiliteit, Tan et al. beschrijft een werkwijze met meerdere dicht bij elkaar gelegen verticale balken van silicone elastomeer. De belangrijkste voordelen van deze techniek blijken uit twee belangrijke functies. Eerst teneinde de cel-substraat schijnbare stijfheid veranderen men hoeft alleen de MicroPOST afmetingen te veranderen terwijlde substraatsamenstelling overigens gelijkblijvende en aldus verschillen in oppervlakte topologie en chemie vermijden. Tweede micropalen handelen als individuele veren die discreet kan worden geanalyseerd met geweld en ruimtelijke resoluties over de volgorde van de afzonderlijke focale adhesies en kan de analytische uitdagingen die inherent zijn aan een soortgelijk onderzoek door standaard TFM zijn verminderen.

Vandaag is de waaier van toepassingen voor MicroPOST arrays veel groter is dan alleen het in kaart brengen van de krachten voor een paar enkele cellen. Bijvoorbeeld, Akiyama meldt het gebruik van een geïsoleerde dorsale vaatweefsel uit mottenrupsband als een actuator voor een MicroPOST array teneinde een insect spier-powered autonome micro-robot ontwikkelen. ⁵

De meeste gepubliceerde aanvragen van micropalen gericht op studies van medische aandoeningen zoals infecties of kanker. Zo zijn MicroPOST arrays gebruikt om de kracht genereren van gebundelde type IV pili van Neisseria gonorrh bestuderenOEA kolonies die is gekoppeld aan signaalcascades verbeteren infectie. ⁶ Anderen hebben gebruikt om micropalen borstkankercellen behandeld met farmaceutische samenstellingen gericht op de cytoskelet bestuderen. ⁷

Afbuiging van een MicroPOST wordt vaak beschreven met behulp van klassieke bundel theorie voor een cantilever met een end load veronderstelling dat de cel hecht alleen het uiterste puntje van de MicroPOST. Hier is de uitgeoefende kracht F die een afbuiging δ veroorzaakt afhankelijk van de MicroPOST's "buigstijfheid" k en wordt berekend door:

(1)

met E, I en L zijn de Young's modulus, oppervlakte traagheidsmoment en straallengte resp. Echter, de resultaten van deze vergelijking geven slechts een algemene benadering van de krachten op het werk sinds balk snijden en buigen als substraat kromtrekken niet in ac worden genomentellen. Gezien het feit dat micropalen zijn meestal gemaakt van zachte materialen zoals polydimethylsiloxaan (PDMS) -gebaseerde siliconenrubber deze factoren moeten worden opgenomen. . Schoen et al aangetoond dat er zo'n correctiefactor op basis van de verhouding van de MicroPOST (L / D) en de Poisson verhouding v de overeenkomstige polymeer ⁸ wordt gegeven door.:

(2)

Met T _tilt (v) een kantelbare coëfficiënt die fitting parameter a = 1,3 zoals kan worden gevonden in hetzelfde artikel omvat:

(3)

Dat betekent MicroPOST de gecorrigeerde stijfheid k _corr is het product van de zuivere buigstijfheid k = k _{buigen en} de correctiefactor corrgegeven door:

(4)

Daarom moet cel kracht berekeningen worden uitgevoerd met de meer verfijnde variatie van vergelijking (1) leest nu:

(5)

De impact van de correctie wordt meer duidelijk zodra typische waarden voor MicroPOST afmetingen worden gebruikt. Bijvoorbeeld, een 15-micron lang MicroPOST met een cirkelvormige dwarsdoorsnede en een diameter van 5 urn gemaakt van PDMS-gebaseerde siliconen rubber tot een correctiefactor van 0,77 en dus een gecorrigeerde berekening zou de uitgeoefende krachten cel overschatten met 23%. Dit wordt nog ernstiger voor micropalen met kleinere aspect ratio.

Traditioneel is MicroPOST beeldanalyse ook gebaseerd op geïdealiseerde balk buigen theorie. In 2005 heeft de groep die het gebruik van de MICR pionieropost arrays publiceerde een beeldanalyse-software geschikt voor MicroPOST analyse ⁹ De software vereist een softwarelicentie en de gebruiker moet drie beelden voor elke positie in te nemen.; één elk van de MicroPOST de boven- en onderkant vliegtuigen in de transmissie-modus en een andere in fluorescentie mode met de gekleurde cel. Na vergelijking van de bovenste en onderste posities voor elke MicroPOST bepaalt de software een kracht vectorveld en berekent daarmee samenhangende parameters als kracht per paal. Andere software pakketten bestaan ​​en hun analyse principes zijn kort in de desbetreffende artikelen die ze beschrijven genoemd, maar deze analytische software pakketten zijn over het algemeen niet voor iedereen beschikbaar. ^10,11

De MicroPOST matrices voor mapping cel krachten kunnen worden geclassificeerd als zijnde in een orthogonale MicroPOST layout of een hexagonaal is, waarvan de laatste het voordeel van gelijke afstand tussen alle spleten naaste micropalen. Typische micropalen have een cirkelvormige dwarsdoorsnede en de afmetingen variëren van 1,0 urn tot 10 urn in diameter en 2 tot 50 urn lengte. ⁴ echter micropalen met elliptische of vierkante doorsnede zijn ook gemeld. ^12,13

Het gebruik van PDMS-gebaseerde siliconen mengsels MicroPOST materiaal maakt voor het toevoegen van nanodeeltjes in het mengsel. Bijvoorbeeld het toevoegen van kobalt nano-staven maakt een magnetische activering van de MicroPOST en dus geeft een andere vrijheidsgraad om potentiële experimentele ontwerpen. ¹⁴ De meeste groepen produceren hun MicroPOST arrays op vlakke harde ondergronden zoals dekking van glas of in een petrischaal. Echter, Mann en collega meldde onlangs een MicroPOST matrix gevormd op een uitrekbaar membraan. ¹⁵ Dit maakt de toepassing van cel strekkrachten hechtende cellen tijdens de studie levende cellen subcellulaire dynamische responsen qua cel contractiliteit.

De alom gebruikte en meest Estabsteld werkwijze voor het maken MicroPOST arrays gebaseerd op zachte lithografie zoals beschreven in de protocollen van inzichtelijke Sniadecki en collega. ^16-18 Kortom standaard cleanroom processen worden toegepast om de microstructuren op een siliciumwafer gebruikt SU8 fotoresist genereren. Daarna volgt een kopieerproces waarbij de siliconenrubber gegoten via structuren overzetten in mallen. In een tweede stap deze schimmels worden gebruikt om de oorspronkelijke microstructuur behulp siliconenrubber op een gekozen substraat repliceren. Maar ondanks de grote en groeiende aantal publicaties in verband met de toepassing ervan, de oprichting van een productieproces voor micropalen neemt aanzienlijke hoeveelheid tijd, zelfs voor micro-technische deskundigen; er zijn veel processtappen die optimalisatie en aanpassing aan de specifieke testomgeving en MicroPOST lay-out nodig om een ​​acceptabel kwaliteitsniveau opleveren.

Commerciële MicroPOST arrays zijn nu beschikbaar in een kant-en-to-gebruik ("off-the-shelf") formaat met een constante hoge kwaliteit. Als zodanig zijn ze een alternatief voor de complexe en tijdrovende productieproces vereist ter plaatse produceren. In dit artikel werd een commercieel verkrijgbaar MicroPOST serie gebruikt voor het in kaart brengen cellulaire krachten afbeelding één helder-veld microscopie gebruikt. Nog belangrijker is dit artikel beschrijft en documenteert een volledig functionele open-source software genaamd MechProfiler, die beschikbaar zijn voor download als aanvullend materiaal om dit manuscript is. Een actief gehandhaafd versie van de software is ook te vinden op http://www.orthobiomech.ethz.ch.

De combinatie van een "off-the-shelf" test en een compatibele open-source analyse software aanzienlijk verlaagt de ingang hindernis om nauwkeurige TFM experimenten te bereiken. Onderzoekers zonder toegang tot ofwel clean room faciliteiten of de ontwikkeling van software ervaring met succes kan analyseren cellulaire krachten. Het stelt een gebruiker om zich te concentreren op het mechanosensitivity assay uitgang in plaats van de technologie zelf, en maakt trekkracht metingen beschikbaar om een ​​bredere gemeenschap. Bovendien is dit een belangrijke stap op de weg naar volledig automatische screening van MicroPOST arrays effenen.

De MechProfiler analyse software verwerkt afbeeldingen in bestandsformaat tiff, png, bmp en jpg. De beelden kunnen worden gemaakt met behulp van fluorescentie, fase contrast of fel-veld lichtmicroscopie. Het standalone programma loopt samen met de vrije Matlab Compiler Runtime (verkrijgbaar bij: Figuur 12) en de onderliggende algoritmes mogelijk maken gestroomlijnde beeldverwerking, waarmee de gebruiker om beelden met één of meerdere cellen te verwerken ongeveer 1 min. Verder kunnen deze cellen ofwel levend of "vast".

De MechProfiler software kan aanzienlijk verhogen gegevensanalyse throughput beroept op reproduceerbaarheid van de kwaliteit commerciële MicroPOST arrays, meer bepaald de standaard & #8220, niet afgebogen "-positie van elk record in de array kan worden aangenomen tegenover een ideale rooster (fabricageafwijkingen voor het raster in de arrays gebruikt voor deze studie minder dan 100 nm).

Kortom men opent een selectie van beeldbestanden voor analyse, gewassen ze naar de regio van belang, bepaalt de ambten waarop cellen of die moeten worden weggegooid, bepaalt de post posities, berekent de doorbuiging / krachten tegen de ideale raster, en ten slotte slaat alle cel-specifieke gegevens met de mogelijkheid voor de export, met inbegrip van een standaard kantoor spreadsheet.

Protocol

1. het kweken van cellen op MicroPOST Arrays

Opmerking: Alle stappen moeten in een bioveiligheid kast worden uitgevoerd om de steriliteit te waarborgen. De hier gegeven volumes zijn voor T25 celcultuur flessen. Het celkweekmedium recept en cellen zaaidichtheid zijn geoptimaliseerd voor botkanker cellijnen HuO9 en M132.

1. Bereid een celkweek voor het zaaien op een MicroPOST array.
   1. Inspecteer de celkweek kwaliteit door het plaatsen van de kolf op een standaard lichtmicroscoop. Ervoor zorgen dat de cellen een normale groei en morfologie door het schatten hoeveel van de kweekfles bodem bedekt. Een dekking van 70% -80% weerspiegelt een gezonde groei. Besteed aandacht aan het bedrag van de drijvende cellen als zij vertegenwoordigen dode cellen en / of een begroeide cultuur.
   2. Trypsinize cellen door het verwijderen van medium en wassen met 4 ml 1x fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) buffer. Voeg 0,8 ml 1x trypsine / Ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) en incubeer bij kamertemperatuur totdat de cels los te die ongeveer 2-4 minuten duurt. Controleer het proces met de microscoop en tik soms de kolf voorzichtig naar loskomen ondersteunen.
   3. Voeg 5 ml celkweek medium (Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (DMEM) / F12 met 10% foetaal runderserum (FBS), 1% penicilline / streptavidine (Pen / Strep)) om de reactie te stoppen en wassen residuele cellen die nog zitten op de bodem van de fles. Pipetteer vervolgens deze suspensie op en neer meerdere malen om een ​​homogeen mengsel te krijgen. Zorg ervoor dat alle oplossingen in de oorspronkelijke groeigebied van de kolf pipet om een ​​effectieve loskomen krijgen.
   4. Breng de celsuspensie in een 15 ml buis en centrifugeer met behulp van een tafelblad centrifuge bij 0,5 xg gedurende 3 min.
   5. Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 5 ml medium op en neer te pipetteren 5 keer. Zorg ervoor dat de generatie voorkomen van bellen tijdens het doen.
   6. Bepaal celdichtheid met behulp van een cel telkamer en een licht Micrpe. Controleer de celsuspensie in cel telkamer voor mobiele aggregaten en ervoor te zorgen dat slechts enkele cellen hebben voor de volgende experiment. Pipetteer weer omhoog en omlaag meerdere keren de cellen de neiging om aggregaten te scheiden vormen.
   7. Verdun de celsuspensie met voldoende medium een ​​celoplossing van 25.000 cellen / ml te verkrijgen. Meng het goed door het omkeren van de gesloten buis meerdere malen.
2. Bereid een MicroPOST array voor cel zaaien.
   Kritische noot: niet pipet op de MicroPOST serie direct als dit zou kunnen schadelijk zijn voor de micropalen, vooral wanneer ongewenste luchtbellen worden geïntroduceerd. Bovendien, zorg ervoor dat de MicroPOST reeks droogt nooit uit als optredende capillaire krachten leiden tot het instorten van de micropalen.
   1. Plaats het glazen substraat met de matrix MicroPOST boven in een putje van een 12-wells plaat met behulp van een pincet en nat door toevoeging van 1 ml ethanol (99%). Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20-30 sec.
   2. Verdun de ethanolstapsgewijs door toevoeging van ongeveer 1 ml steriel gedeïoniseerd water (DI water) aan de put kant en aanzuigen ongeveer 1 ml met behulp van een overdracht pipet of aspiratorinrichting. Herhaal deze stap ten minste 3 maal.
   3. Vervang de DI-water met PBS-buffer op dezelfde wijze door het toevoegen en aspireren ongeveer 1 ml. Herhaal deze stap 3 keer.
   4. Vervang de PBS-buffer met medium door het toevoegen en aspireren ongeveer 1 ml medium. Herhaal deze stap 3 keer.
3. Pipetteer 1 ml celoplossing (25.000 cellen) bovenop elkaar bereide MicroPOST array. Close multiwell-plaat en overgebracht naar een incubator (5% _CO2, 37 ° C). Laat de cellen hechten en te groeien op de top van micropalen voor 6 -7 uur.
4. Controleer de hechting proces af en toe met behulp van een licht microscoop. Controleer dat de meeste van de cellen lijken verspreid over meerdere micropalen.

2. Bevestiging & kleuring Cellen

Opmerking: Alle stappen envolumes hier gegeven zijn voor een enkel putje van een 12-wells plaat. Aanbevolen verwerken niet meer dan vier van de twaalf putjes tegelijk om uitdroging van de putjes te voorkomen na afzuigen van elke vloeistof, die zal leiden tot een instorting van de micropalen.

1. Zuig medium uit de put en was cellen 2x met 1 ml PBS-buffer. Zorg ervoor dat u een zachte kracht toe te passen tijdens het wassen met PBS tot cel puin dat zich op het MicroPOST serie tijdens incubatie te verwijderen en om de dode cellen los.
2. Fixeer de cellen met 0,5 ml 3,7% gebufferde formaldehyde-oplossing gedurende 5 min.
3. Vervang de formaldehyde-oplossing door het wassen van de MicroPOST serie 2x met 1 ml steriel DI water.
4. Vlekken op de cellen met kleurstof (0,05% Coomassie Brilliant Blue in 50% water, 40% ethanol en 10% azijnzuur) gedurende 90 sec. Was de overtollige kleuroplossing af 2x met 1 ml steriel DI water. Voeg 1 ml DI water array MicroPOST.
5. Controleer vlekken resultaat met behulp van een lichtmicroscoop. Herhaal tHij kleuring stap, als cel lichaam is te zwak om te worden gevisualiseerd.
6. WINKEL MicroPOST arrays met gekleurde cellen geplaatst in een koelkast bij 4 ° C. Ervoor te zorgen dat ze onder water te houden ten alle tijden.

3. Cell Imaging

Opmerking: Stap 4 geldt alleen voor microscopen zonder oneindig gecorrigeerd optiek.

1. Voeg 2 ml DI-water op een petrischaal met een dunne glazen bodem voor hoge resolutie beeldvorming.
2. Overdracht MicroPOST array met behulp van een pincet in de beeldvorming schaal met de micropalen omhoog.
3. Plaats de imaging petrischaal op een beweegbare fase van een lichtmicroscoop.
4. Draai de compensatiering van de gebruikte lens voor het afbeelden dat het nummer op de schaal staat voor de totale dikte van alle materialen langs de optische baan te compenseren voor de mismatch in brekingsindex van het glazen substraat, de silicone-elastomeer en de vloeistof op. Dit moet leiden tot een heldere weergave van de micropalenkernen.
5. Sluit de iris op de verlichting naar beneden tot 50% en verwijder eventuele fasecontrast ringen van het optische pad waardoor een gewone heldere-veld modus.
6. Lijn de MicroPOST array die de micropalen vormen een horizontale lijn over het veld observatie. Definieer een startpunt (bijvoorbeeld linksboven) en beweeg de petrischaal stapsgewijs over het podium het scannen van de MicroPOST serie terwijl het nemen van een groot aantal beelden.
7. Neem alle beelden met de hoogste resolutie-instelling voor de camera met een 20x of 40x objectief. Doel om een ​​cel in het midden van het beeld heeft.
8. Vegen langs de z-as door het substraat tot de MicroPOST tips zijn in focus. Gebruik de fijnafstemming nadruk wiel van de microscoop en zet hem in de richting van de nadruk op de MicroPOST bodem voor ongeveer 2-3 urn.
9. Stelt een standaard beeldvorming procedure door het nemen reeks testbeelden van een reeks sectie vegen door de beeldvorming parameters één voor één (bijvoorbeeld, belichtingstijd,iris instelling, lamp instellingen etc.). Analyseer beelden met MechProfiler en bepalen van een geschikte parameter set voor een snelle en betrouwbare analyse.

4. Image Analysis met Open Source Software "MechProfiler"

Opmerking: Alle software functies kunnen worden geactiveerd met een aanwijsapparaat met de linker muisknop. Toch zal een getrainde operator de gedocumenteerde sneltoetsen ontworpen om op de linkerhelft van het toetsenbord om een ​​efficiënte twee-handed beeldverwerking mogelijk te maken.

1. Start beeldanalysesoftware MechProfiler en open een reeks van beelden die moeten worden geanalyseerd door te klikken op "Open".
2. Steek alle parameters in de sectie "Instellingen" gegeven door de softwareontwikkelaar. Bepaal de parameters die aangepast moet worden ingesteld (bijv contour drempel en minimale afstand) volgens de gedetailleerd beschreven door de software handmatige procedures.
3. Afbeelding analyserens één voor één door te snijden ze naar het gebied van belang met behulp van "Crop" (klik en sleep met de muisknop ingedrukt). Dubbelklik in de getekende rechthoek om deze actie te voltooien.
4. Op iedere zichtbare cel outline één voor één door te klikken op "Trek cel contouren" en het gebruik van het kruis haar cursor voor tekenen met inbegrip van alle micropalen de cel is gekoppeld.
5. Gooi alle ongewenste micropalen door te klikken op "Gooi berichten" en het gebruik van het kruis haar cursor voor het tekenen. Sluit alle micropalen die tot een cel buiten het beelddeel of die afgebogen om een ​​andere reden hebben ze niet de cel van belang.
6. Start de software subroutine "Find centroïdes" door muisklik. Pas de filter instellen naast de "Find centroïdes" knop totdat alle micropalen geregistreerd, die zichtbaar is door een rood kruis in hun midden. Als de filter instelling te laag is micropalen worden genegeerd, als het te hoog multiple posities worden gemarkeerd voor een enkele MicroPOST. Houd het filter instellen constant gedurende een analyse sessie.
7. Gebruik de handleiding editing-functie "Handmatig bewerken" voor centroïden met meerdere of gemiste MicroPOST posities. Gebruik de muis kruis haar om de MicroPOST in kwestie selecteren door te klikken en te slepen over. Dubbelklik binnen de rechthoek en plaats de ontbrekende rode marker in de uitgebreide sectie beeld, dat automatisch sluit. Gooi zo'n MicroPOST wanneer deze buiten de getekende cel omtrek (zie stap 4.5) voordat u verder gaat.
8. Vind de ideale MicroPOST rooster door het activeren van de "Generate Grid" functie met een muisklik. Zorg ervoor dat de positie komt overeen met de ware MicroPOST hoofd, blijkt uit een blauwe ring, binnen de getekende cel omtrek.
9. Corrigeren misplaatste rooster maker in de cel waar nodig met behulp van de bijbehorende functie "Manuel Bewerken" met een muisklik. Gebruik het kruis haar om de MicroPOST in Qu selecterenestion door te klikken en te slepen over. Dubbelklik in het verschijnen rechthoek en plaats de ontbrekende blauwe markering in de uitgebreide sectie beeld, dat automatisch sluit.
10. Gebruik de knop "Bereken Doorbuigingen" met een muisklik om een ​​histogram van de berekende doorbuiging waarden op basis van het verschil tussen de positie van een MicroPOST's in de beelduitsnede en de gegenereerde ideale rooster krijgen.
11. Sla de volledige analyse inclusief de tabellen van waarden door een muisklik op "Opslaan".
12. Blijven de beeldanalyse, hetzij door te klikken op "Reset View 'en een ander beeld sectie of muisklik op" Next Image ", die gemakkelijk kan worden gedaan met behulp van de juiste toetsenbord cursor key analyseren.

5. Data Analysis - Mechanoprofiling

1. Open het bestand "results.xls" met een kantoor spreadsheet-programma uit de map met de beelden geanalyseerd. Het bevat de gegevens all berekende waarden waaronder alle MicroPOST doorbuigingen en standaard afgeleide maatregelen, zoals het werk (dwz substraat deformatie energie) van de geanalyseerde cel.

Representative Results

Het belangrijkste voordeel van de beschreven techniek ligt in de eenvoud en de mogelijkheden voor snelle en effectieve integratie in routine laboratoriumwerk. De combinatie van commerciële sensor arrays van hoge kwaliteit gecombineerd met open-source software geeft informatie over mechanisch-gevoeligheid die anders toegang tot de cleanroom faciliteiten en diepgaande kennis van de beeldanalyse en de ontwikkeling van software zou nodig. Figuur 1 toont de workflow van de gepresenteerde methode. Het begint met de voorbereiding en zaaien cellen op de MicroPOST array. Na de vaststelling en kleuren van de cellen van de MicroPOST arrays zijn klaar voor de beeldvorming. Het centrale deel van de techniek is de beeldanalyse met de MechProfiler software. Een gebruiker kan direct na het invoeren van alle relevante parameters in het "Instellingen" van de GUI starten analyszng beelden. De bijbehorende pixelgrootte is de lengte die wordt aangeduid met een enkele pixel en is afhankelijk van setup van de gebruiker. Het heeft nodigafzonderlijk worden ingesteld voor elke gebruikte vergroting door het nemen van foto's van objecten met bekende grootte. Een voorbeeld wordt gegeven in de aanvullende figuur 9.

Beeldkwaliteit is een belangrijke factor omdat het sterk het analyseproces. Om de hoogste kwaliteit moet men ervoor zorgen om een stabiele en routinematig onderhouden imaging platform zoals weergegeven in figuur 2. In het bijzonder te bereiken, de uitlijning van de lichtbron is belangrijk omdat uitlijning zal ongewenste schaduwen die problematisch kan zijn bij het ​​analyseren van de oorzaak afbeeldingen. Bovendien zijn het de lichtmicroscoop bovenop een antivibratietafel of plaat belang voor de meeste laboratoria omdat het verhoogde stabiliteit geeft tijdens de beeldvorming.

De voordelen van het gebruik van een dunne glazen bodem petrischaal voor de beeldvorming onder hogere effectieve numerieke opening waarden die vertaalt naar heldere beelden met een hogere resolutie.

Wanneer taking van de beelden in helder-veld-modus 50% gesloten iris wordt aanbevolen, omdat de nadruk op de micropalen tips wordt vergemakkelijkt vanwege de omtrekken verschijnen als een heldere donkere ring. Bovendien, indien de gebruikte doel een compensatiering, is het noodzakelijk om het correct ingesteld accurate werking uitlezingen bereiken. Het effect van deze functie kan worden gezien door het vergelijken van Figuur 3A en Figuur 3B. Beelden die snel geanalyseerd kunnen worden bereikt door de juiste instelling van de compensatiering met optimale belichting zoals getoond in figuur 3C. Sterke contrast tussen een MicroPOST en omgeving reduceert de analysetijd zoals versnelt het zoeken algoritme. Gebruikers zullen merken dat slechts minimale ervaring is vereist om beelden die kunnen worden geanalyseerd met gemak te bereiken.

Belangrijk is dat de protocollen boven te overwinnen een kritische en gemeenschappelijke obstakel voor een snelle en effectieve integratie van MicroPOST arrays in routinelaboratorium werk. Dit obstakel komt voort uit de noodzaak om de array-kwaliteit te controleren - een vraag die alleen kan worden gerealiseerd door een grondige en gedetailleerde experimentele karakterisering van de sensor reproduceerbaarheid, gevoeligheid en nauwkeurigheid. Echter, door te draaien aan commercieel beschikbare MicroPOST arrays dit aanzienlijke hindernis wordt volledig vermeden. Figuren 4A en 4B illustreren de nauwkeurigheid van dergelijke MicroPOST array. De afwijking van de micropalen positie goed onder 200 nm en als zodanig vergelijkbaar met een "pixelfout" de camera / objectief combinatie die resulteerde in een pixelgrootte van 82 nm voor de gebruikte opstelling begeleidt. De beeldanalyse met cellen afbuigen van de micropalen aantoont dat de waarden voor een cel opgelegde vervorming aanzienlijk hoger zijn dan 200 nm (zie figuur 4C en Fig 4D) leidt tot een comfortabele signaal-ruisverhouding.

Figuur 5 illustrates de verschillende soorten wedstrijden voor micropalen binnen een afbeelding, afhankelijk of het wordt afgebogen of niet. Zoals hierboven niet afgebogen micropalen genoemd hebben een heldere cirkelvormige verschijning met een donkere ring om hen heen. Hun positie kan worden bepaald met een Hough transformatie, die een kenmerk extractie techniek voor digitale beeldanalyse.

Bovendien laat het zien dat afgebogen micropalen op een omgekeerde microscoop tonen twee tegenover donkere halve maan vormen (zie figuur 5A). In een rechtopstaande microscoop de rand van de MicroPOST tip en een donkere halve maan vorm zijn goed zichtbaar, terwijl de tweede een moeilijk op te sporen wordt. Deze kenmerken zijn de basis voor de berekening van de posities van heldere veld microscoop beelden van de tips van afgebogen micropalen, die is ontwikkeld voor dit protocol en kreeg de naam "Contour aanpak".

Figuur 5B is een voorbeeld van een HuO9 botkankercel op micropalen afgebeeld op een omgekeerde microscoop (boven). De geanalyseerde versie van die afbeelding toont de resultaten van de toegepaste contourenbenadering (onderaan). Figuur 5C werd gemaakt met dezelfde MicroPOST array met een rechtopstaande microscoop (boven). Opnieuw geanalyseerde versie toont de resultaten van het gebruik van de contourenbenadering.

Elke beeldanalyse sessie begint door een gebruiker de controle van de parameters in de sectie "Instellingen" van de MechProfiler. Sommige worden gegeven door de fabrikant als MicroPOST MicroPOST scala afmetingen en veerconstante. Anderen zijn gedefinieerd door de gebruiker, zoals de waarden voor de contour drempel en een minimale vervorming drempel volgens procedures van de software handleiding. Het is echter belangrijk op te merken dat deze waarden moeten zorgvuldig worden gekozen en moet constant voor alle beelden binnen een samenhangende reeks afbeeldingen om vergelijkbaarheid te garanderen. Terwijl de pre-processing stappen voor het beeld analysis, zoals bijsnijden, zijn zelf-verklaren van de onderliggende strategieën voor de software functies zoals "Finding centroïdes", "Genereer Grid" en "Contour Approach" behoefte aan meer gedetailleerde uitleg.

Algoritmische opsporing van standaard MicroPOST stand (zoals geleverd door de fabrikant) begint met behulp van de "Het vinden centroïden" software-functie. Het algoritme begint in de linkerbovenhoek van een beeld op zoek naar de eerste MicroPOST. Vervolgens alle micropalen zijn gevonden die aan de coördinaten van die eerste MicroPOST plus de waarden voor het net en MicroPOST omvang van de fabrikant na hexagonale geometrie. Het zwaartepunt voor elke gevonden MicroPOST wordt berekend aan de hand van een Hough transformatie. Het filter slider naast de opdracht knop van de GUI maakt het aanpassen van de gevoeligheid van deze transformatie. Alle gevonden micropalen zijn gemarkeerd met een rood kruis en hun posities bekend om subsequent processen.

Vervolgens wordt de functie "Generate Grid" leidt tot de coördinaten van alle micropalen tips. Zij zijn het resultaat van een meerstaps proces. Eerst een optimalisatie functie is opgelost met inbegrip van de eerste posities van de voorafgaande uitgevoerd "Find zwaartepunten" algoritme om de ideale rooster vast te stellen. Tweede de posities van de micropalen in de cel zone berekend. Micropalen met minder doorbuiging dan gedefinieerd in de instelling parameter "Minimale doorbuiging drempel" ten opzichte van de ideale raster worden verwerkt met een Hugh transformatie. Alle andere MicroPOST tip posities worden berekend met behulp van de hierboven beschreven contour aanpak afgebogen micropalen. Hier de software zoekt eerst op de oorspronkelijke zwaartepunt van het celcentrum een cirkelvormige rand (licht tot donker) binnen een hoek van 15 ° (zie figuur 5A). Zodra die rand wordt gevonden een cirkel met de gegeven MicroPOST diameter gemonteerd thoed rand met behulp van de contour drempelwaarde van de instellingen in de GUI. Deze parameter bepaalt welke pixel grijswaarde wordt gebruikt voor het aanpassingsproces. Hoe hoger deze waarde is het meer de montage neigt naar het helderder MicroPOST centrum van de lager dan de waarde van het nog aan te passen dat de cirkel naar de donkere MicroPOST omtrek. Eenmaal gekozen die waarde constant moet blijven voor alle afbeelding analyseert binnen een bepaalde studie te voorkomen dat het toevoegen van kunstmatige verlegging of te bellen doorbuigingen te conservatief.

Bijvoorbeeld, Figuur 6 illustreert het belang beslissen een passende contour drempelwaarde. De software kan de gebruiker kiezen voor een breed bereik (0,1-0,9) alle fysiek mogelijke verlichting situaties omvatten. De vertaling van de optische informatie in deflectie afstanden gegeven beide extremen en een praktische waarde in het midden zijn aangegeven in figuur 6B. Echter, opgeleid software gebruikers vaak converge nagenoeg even contour drempelwaarden, waardoor vergelijkbare resultaten zoals te zien in figuur 6C. Bovendien, met behulp van gestandaardiseerde procedures voor cel kleuring en imaging minimaliseert het risico van ongeldige contour drempelwaarden, die over het algemeen moet constant binnen blijven met elkaar verbonden sets van beelden.

Om de robuustheid van de werkwijze tonen een selectie van mechano-profiling resultaten zijn in figuur 7. In figuur 7A twee resultaten van botkanker cellen HuO9 en twee van M132 vergeleken. Alle vier arrays uit dezelfde productieserie en dus identieke mechanische eigenschappen. De analyse werd uitgevoerd met een vaste set van parameters voor een minimale doorbuiging (0,25 pm) en voor de contour drempel (0,125). Daarnaast werden twee identieke reeksen beelden van SaOS 2 botkanker aan twee analisten zonder verdere informaties parameterinstellingen (zie figuur 7B). De invloed van de kleuring van de analyse werd getest door het nemen van beelden van botkanker cellen gekleurd met Coomassie Blue R. Vervolgens werd de kleurstof verwijderd. Na re-kleuring met Coomassie Blue G een tweede reeks afbeeldingen genomen. Figuur 7C toont de resultaten van beide reeksen, die werden geanalyseerd door dezelfde gebruiker met identieke waarden voor de minimale vervorming (0,25 urn) en de contour drempelwaarde (0,25) .

Een typisch voorbeeld van toegepaste mechanisch-profilering is weergegeven in figuur 8A, waarbij de gecompileerde gegevens worden gepresenteerd voor het bot kankercellijnen HuO9 en M132 na analyse van 151 cellen verzameld van elk van vier arrays. In dit overzicht alle indicator waarden zijn hoger voor HuO9 dan M132 al aangeeft dat HuO9 cellen gelden meer kracht dan de M132. De gegevens van de beeldanalyse bevat een grote hoeveelheid extra eencellige informatie die kan worden gewonnen om beter inzicht phenotypic cellijn gedrag en cel-cel variabiliteit binnen een bepaalde lijn. Met de presentatie van de resultaten voor de kracht per MicroPOST in een boxplot vindt men dat ondanks gelijkaardige minima en maxima, data waarden worden anders verdeeld en ook de lage metastatische cellijn HuO9 cellen hebben de neiging om meer kracht toe te passen dan de zeer metastatische M132 lijn (zie figuur 8B). Verder in categorieën kracht waarden ten opzichte van het celoppervlak vindt men dat de gemiddelde kracht per cel niet alleen verhoogd voor HuO9 cellen vergeleken met M132 maar ook dat de gemiddelde kracht per MicroPOST toeneemt naarmate de cellen uitgespreid tot gemiddelde kracht per record bereikt een stabielere waarde (zoals te zien in figuur 8C). Zelfs voor cellen die zeven micropalen waarden zijn bijna identiek, wat waarschijnlijk te wijten aan het feit dat ze meestal weergegeven in hexagonale vorm met een centrale niet-afgebogen MicroPOST onafhankelijk van hun cellijn. Behalve de diffwijzingen in contractiliteit, kunnen morfologische verschillen worden gekwantificeerd met een interessant resultaat. Bijvoorbeeld in tegenstelling tot de zeer metastatische M132 cellen waren erg weinig HuO9 cellen die drie micropalen bedekt. Andere morfologische vergelijkingen tussen de cellijnen kunnen worden gemaakt, waaronder de verdeling van celoppervlakte weergegeven door het aantal micropalen bedekt. ​​Figuur 8D illustreert dat beide cellijnen verschillen ook dynamisch smeergedrag bij het ​​kweken bovenop micropalen. Kortom, de mechanoprofile de ouderlijke cellijn HuO9 blijkt dat ze meestal beslaan meer ruimte en toepassing iets meer kracht om micropalen, terwijl de metastatische cellijn M132, een agressieve cel die is afgeleid van HuO9, karakteristieke beslaat minder micropalen en geldt minder kracht per MicroPOST . Deze resultaten tonen het potentieel van een TFM benadering discriminerende toepassingen.

Figuur 1. Experiment Workflow. (A) De algemene procedure bestaat uit vijf opeenvolgende belangrijke stappen van het zaaien van cellen op een MicroPOST array om hun mechanische eigenschappen profileren. (B) Het beeld analyse wordt uitgevoerd met de beschreven MechProfiler software. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2. Imaging Setup. Wordt een standaard omgekeerde microscoop voor beeldvorming van de cellen op de MicroPOST arrays. De opstelling bevat ook een microscoop en de camera controller, die ook voorzien gegevensopslag functies. Het grote scherm getoond wordt is niet essentieel, maar toch is het handig voor uitgebreide imagingsessies. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 3. Richtlijn voor MicroPOST beeldvorming. (A) Afbeelding van gekleurde cellen op een MicroPOST reeks genomen met een 40X lens in heldere-veld modus. Niet-afgebogen micropalen verschijnen als donkere kringen als afgebeeld. Afgebogen berichten gaan uit van een elliptische vorm met zowel donkerder en helderder subregio's. Gekleurde cellen die micropalen dekken maakt ze lijken nog donkerder tot het punt dat er geen tegenstelling tussen MicroPOST en cel. (B) identieke beelden die na het instellen van de lens compensatie ring en opnieuw te focussen. Hier is de kernen van de micropalen geworden aanzienlijk helderder en geven meer contrast. (C) De dezelfde positie na de r weer in beeld gebrachtTing alle verlichting parameters met de camera controller. De vrij staande micropalen verschijnen als heldere cirkels met een donkere ring. Afgebogen micropalen tonen een duidelijke halve maan "schaduw" rond de bocht kern langs de as te trekken. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.>

Figuur 4. MechProfiler schermafbeeldingen geanalyseerde micropalen. (A) Een typisch voorbeeld van een lege MicroPOST array kan worden gezien in deze screenshot. De micropalen zijn gerangschikt in een constante hexagonaal patroon. (B) Het histogram van de doorbuiging waarden voor deze micropalen blijkt dat alle waarden beneden 200 nm. (C) typisch voorbeeld van een HuO9 botkanker celbedekkendeen trekken op meerdere micropalen. Men kan zien dat de hoeveelheid trekken heterogeen. (D) Het histogram met de doorbuiging waarden voor de HuO9 cel toont het brede spectrum van vervormingen die voortvloeit uit de interactie van de cellen met de MicroPOST substraat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 5. MicroPOST verschijningen in bright-field verlichting en de strategieën voor de berekening van hun positie binnen een afbeelding. (A) Niet-afgebogen micropalen verschijnt als een heldere cirkelvormig gebied met een donkere buitenring. Het zwaartepunt wordt berekend door een Hough transformatie. Afgebogen micropalen tonen donkere halve maan vormen. Afhankelijk van de microscoop setup als de micropalen het gezicht van de ligh t bron (bijvoorbeeld omgekeerde microscoop) zijn er twee goed zichtbare halve maan vormen. Als de micropalen gezicht van de lens (bv, rechtop microscoop) slechts een halve maan is goed te zien, maar ook de rand van de tip. In beide gevallen dient de contour benadering worden gebruikt om de MicroPOST tip te berekenen. (B) Een origineel beeld (boven) met behulp van een omgekeerde microscoop van een HuO9 botkanker cel en de geanalyseerde versie (onder) met de contourenbenadering. (C) Het originele beeld uit dezelfde MicroPOST array (top) via een rechtop microscoop en de geanalyseerde versie opnieuw van de contourenbenadering (onder), maar met een veel lagere contour drempelwaarde geschikter voor bellen dark ringvormige rand. Gelieve klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

upload / 53.350 / 53350fig6.jpg "/>
Figuur 6. De contourenbenadering en het kiezen van de juiste drempelwaarde. (A) De drie afbeeldingen illustreren hetzelfde micropalen geanalyseerd met behulp van drie verschillende contour drempelwaarden. Als de waarde ingesteld is te laag (links) of te hoog (rechts) dan de software past de blauwe ring die de MicroPOST hoofd verkeerd voorstelt. Het onderschat of overschrijdingen van de werkelijke positie van de MicroPOST hoofd. Een correct gekozen drempelwaarde kan de software aan te passen dat de blauwe ring om de halve maan vormige donkere gebied binnen de MicroPOST die zich vormt door de doorbuiging. (B) De grafiek toont het gemiddelde bedrag van de afbuiging afhankelijk van de gekozen contour drempel voor de in bovenstaande micropalen. Het illustreert ook dat de waarden voor de micropalen buiten de cel omtrek niet beïnvloed aangezien de contour fitting wordt er toegepast. (C) De grafiek laat zien dat het kiezeneen drempelwaarde binnen een matige interval minimaliseert het risico van over- of onderschatting van de MicroPOST doorbuigingen. Het verschil tussen de door verschillende opgeleide gebruikers gekozen waarden is doorgaans minder dan 0,05, wat resulteert in aanvaardbare verschillen in gemiddelde doorbuiging waarden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 7. Robuustheid test voor mechanisch-profiel resultaten van verschillende botkanker cellijnen; de fout bars vertegenwoordigt één standaarddeviatie (A) voor mechanische profiling resultaten van vier identieke MicroPOST arrays na het zaaien HuO9 cellen op rij 1 en M132 op rij 3 -. Vier dagen later zaaien HuO9 op rij 2 en M132 op rij 4. (B) Vergelijking van de resultaten van mEchano-profilering op basis van identieke sets van beelden na analyse door twee onafhankelijke analisten. (C) Vergelijking van beeldanalyse resultaten van twee verschillende reeks beelden eerste genomen na kleuren met Coomassie Blauw R en de tweede na de volledige verwijdering van de kleurstof en re-kleuring met Coomassie Blue G. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken .>

Figuur 8. Mechano-profilering van botkanker cellijnen. (A) De vergelijking tussen de twee botkanker cellijnen HuO9 (laag metastatische potentiële) en M132 (sterk uitgezaaide) grafiek laat zien dat alle indicator waarden hoger voor de HuO9 cellijn ( totaal N = 302; twee onafhankelijke sets van experimenten, error bar = standaarddeviatie). (B trong>) De boxplot illustreert dat de toegepaste krachten per MicroPOST zijn in de lagere nano-Newton bereik. Echter, HuO9 cellen meer trekken dan M132 cellen (Whiskers vertegenwoordigen de gegevens minimum en maximum). (C) Een soortgelijk resultaat kan worden gezien door vergelijking van cellen die hetzelfde aantal micropalen bestrijken. HuO9 cel passen meer kracht dan M132 cellen. Het aantal HuO9 cellen die drie micropalen is niet representatief en alleen inbegrepen voor volledigheid (error bar = standaarddeviatie). (D) De verschillende distributies over de aantallen bedekt micropalen aantonen dat elke botkanker cellijn heeft zijn eigen karakteristieke verspreiden wanneer interactie met MicroPOST arrays. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

ppfig9.jpg "/>
Aanvullende Figuur 9. De pixelgrootte een microscoop opstelling wordt kenmerkend bepaald met een speciale microscoopglaasje met een schaalbalk op; alternatief de MicroPOST reeks lay-out, die door de fabrikant kan worden gebruikt. Bijvoorbeeld, 15 eenheden met 13 micron (195 micrometer totale lengte) gedeeld door 2375 pixels (opgericht met een beeldverwerking tool) leidt tot 0,082 micrometer / pxl. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 10. Vergelijking van de beelden van een HuO9 botkanker cel uit dezelfde positie met behulp van twee Beluchtingtechniek op een omgekeerde microscoop; DIO gekleurd micropalen zijn groen fluorescerend. (A bright-field-modus. (B) Analyzed i Mage genomen na het overschakelen naar de groene fluorescentie kanaal zonder heroriëntatie.   (C) tweede beeld fluorescentie na het corrigeren van de focus naar de zeer MicroPOST tips. (D) Overlay van beide verlichting kanalen ter illustratie alleen.   (E) voor mechanische profiling indicatoren als resultaat van de drie beelden. Ondanks het corrigeren van de focus van de volledige uitslag kan niet worden geschat op basis van de fluorescentie beelden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 11. Afbeelding sequentie van dezelfde plaats van fluorescerend gekleurd micropalen behulp Dil op een rechtopstaande microscoop beeld Helder-veld (A).; er drie micropalen raken elkaar aan het uiteinde. (B) dezelfde positie na het inschakelen van de TL-kanaal iets boven de hoofden van de micropalen. (C) Het verlagen van de focal plane op het uiterste puntje van de micropalen. (DE) Opeenvolgende beelden na verdere verlaging van de focal plane stapsgewijs richting van de onderkant van de micropalen. (F) Afbeelding van de micropalen na het verlagen van de focal plane in de silicone-elastomeer substraat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende Figuur 12. Screenshot van de MechProfiler GUI. Typische analyse resultaat van het profileren van een HuO9 botkanker cel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Dit werk tracht het gebied van trekkracht microscopie vooraf door substantieel verlagen van technische en praktische belemmeringen voor de toegang. Deze belemmeringen van twee kanten komen. Eerst en vooral zijn de talloze niet-triviale technische uitdagingen die moeten worden overwonnen om reproduceerbaar vervaardigen en experimenteel Commissie MicroPOST array. Ten tweede, is het eveneens niet-triviale behoefte aan een betrouwbare semi-automatische analyse van cel krachten - rekening houdend dat een typisch experiment de analyse van honderden of zelfs duizenden cellen nodig. De hierboven beschreven technieken werden ontwikkeld om MicroPOST gebaseerd trekkracht microscopie toegankelijk binnen celbiologie laboratoria die niet woonachtig technische expertise hebben te maken. De sensoren en analysetechnieken in dit artikel moet het mogelijk maken niet-deskundigen om de krachten uitgeoefend door enkele cellen gemakkelijk en nauwkeurig te analyseren.

Behalve toegang tot een celbiologie lab met tenminste een mid-grade helder-veld microscoop, beschreven methoden vereisen enkele aanvullende technische elementen. Hier de meeste gebruikers kunnen geldig trekkracht microscopie experimenten uit te voeren met nog beperkte ervaring, ondanks de kracht en veelzijdigheid van de techniek. Niettemin zijn er drie kritische aspecten in de gepresenteerde protocol dat moet worden overwogen. Ten eerste is het noodzakelijk dat de MicroPOST arrays altijd bedekt met vloeistof om te voorkomen dat de ineenstorting gevolg van capillaire krachten. Ten tweede moet men imaging parameters te optimaliseren voor verworven MicroPOST beelden, die het best wordt gedaan door het nemen van reeks van beelden van dezelfde array positie terwijl wisselende belichtingstijd, iris diafragma, en compensatie ring positie. Het is belangrijk om de juiste brandvlak de MicroPOST tip te vinden, en dit aspect vergt wel enige ervaring gezien de geringe dimensionele diepte van de sensor arrays. Ten derde moet men openlijk toegankelijke beeldanalysesoftware MechProfiler discusse downloadenhier d, waarvoor een gedetailleerde handleiding en training voorbeelden zijn beschikbaar op de downloadsite. Na enige ervaring met de software voorbeelden voorzien de handmatige analyse moet de gebruiker neemt testbeelden de beeldvormende opstelling te gebruiken om geschikte microscoop configureren. Op basis van de verkregen beelden, moet de contour drempelwaarde dezelfde manier worden geoptimaliseerd. Een enkel beeld MicroPOST kunnen worden geanalyseerd door een ervaren gebruiker binnen een minuut met de open source MechProfiler software ongeacht of deze één of meer cellen, waardoor het genereren van statistisch relevante resultaten (analyse van enkele honderden cellen) binnen een paar uur .

Een ander aspect dat sommige afstemming vereist is de optimalisatie van elke toegepaste cel kleuring procedure. Wanneer cellen worden overdreven gekleurd kan de software niet de juiste MicroPOST posities te registreren. Anderzijds indien de kleuring te zwak is meer inspanning door de gebruiker om een ​​detectie vereist"True" cel schets zo dun cel uitsteeksels kan worden gemist.

Echter, door het toepassen van een vast protocol van cel kleuring en de vele imaging procedure het bereik voor deze fout wordt aanvaardbaar laag. Tijdens deze werkzaamheden werden andere cel kleuring procedures getest op basis van diverse concentraties van kristal violet, de aanwezigheid van oppervlakte-actieve middelen zoals Tween 20 of Triton-X, of een combinatie van kleurstoffen door toevoegen eosine. Niettemin, de intensiteit van de kleuring evenals de stabiliteit aanzienlijk varieerde van experiment tot experiment. Alleen het gebruik van Brilliant Blue G zoals hierboven beschreven vertoonden een aanvaardbare celkleuring robuustheid in combinatie met voldoende intensiteit nog de dunne cel lijnen zonder te interfereren met de ontwikkelde contourenbenadering.

In het algemeen zijn er mogelijkheden voor het gepresenteerde techniek passen. Bijvoorbeeld combineert het bright-field hier gepresenteerde technieken met fluorescentiemicroscopie kleuring organellenzoals de kern of actine filament netwerk, die aanvullende informatie over de onderliggende celprocessen in context cel mechanica verschaffen. Bovendien, het gebruik van lange-keten dialkyl carboxycyanines (Dil of DIO) de micropalen worden fluorescerende. ¹⁴ Desalniettemin is het belangrijk om elke afwijking van de gepresenteerde techniek beheersen. De aanvullende figuren 10 en Figuur 11 illustreren mogelijke valkuilen. Foto genomen van een Coomassie Blue G gekleurd NIH 3T3 fibroblast cel in het groene fluorescentie kanaal (Figuur 10B en 10C) met behulp van de omgekeerde microscoop presenteren de belangrijkste MicroPOST lichamen, maar niet hun tips die leiden tot een verkeerde positie analyse (Figuur 10E). Ondanks de inspanningen om heroriënteren na overgaan van helder-veld modus (figuur 10A) de MicroPOST tips niet kunnen worden afgebeeld, die kan worden veroorzaakt door absorptie van het fluorescentiesignaal van de cel vlek. Dit in tegenstelling tot imaGES genomen met de gele fluorescentie kanaal van een rechtopstaande microscoop (Figuur 11B-11F), waarbij meerdere scherpe beelden kan verkrijgen langs de z-as. Hier moet de gebruiker ervoor zorgen dat het beeld iets dichter wordt genomen met het brandvlak aan het uiteinde (figuur 11C) en niet op de bodem MicroPOST vermijden bellen defecte doorbuiging waarden.

Opgemerkt zij dat er ook technische beperkingen voor MicroPOST assays. Bijvoorbeeld, de nauwkeurigheid van een gedetecteerde afwijking hangt af van de kwaliteit van de optische opstelling. Microscopen worden vaak geoptimaliseerd voor fluorescentie beeldvorming waarin de lichtgevoeligheid van de aangesloten camera heeft een hogere prioriteit dan een groot aantal pixels. Uiteraard leidt dit tot beelden met een grotere pixelgrootte. Voorts zij opgemerkt dat helder-veld beelden niet kunnen bepalen of cellen uitsteeksels bereikt het onderste substraat. Echter, de commerciële MicroPOST arrays getest met behulp van confocalemicroscopie. Er werd gevonden dat cellen lijken de binaire coating die alleen de hechting op MicroPOST tips en niet de rest van de matrix MicroPOST accepteren. Een andere factor is afgeleid van de positiefout van de MicroPOST matrix, waarvan is aangetoond dat 0,2 urn. Samen met de gegeven veerconstante van 2,8 nN / um leidt tot een onjuiste werking uitlezing van 0,6 nN. Een andere beperking van MicroPOST assays voort uit het feit dat de toegepaste krachten van micropalen door meerdere cellen niet kunnen worden bepaald. Derhalve kunnen slechts geïsoleerde enkele cellen geanalyseerd. Een specifieke beperking voor de gepresenteerde protocol is afgeleid van de juiste toepassing van de gevoelige contour aanpak, die een zekere mate van training voor de gebruiker om betrouwbare resultaten te krijgen vereist. Bovendien, voor een snellere analyse moet de gebruiker beelden maken waarbij de MicroPOST array wordt afgestemd op een horizontale of verticale lijn langs de rand van het waarnemingsveld vormen. Despite het feit dat de software-algoritme voor het vinden micropalen binnen een hexagonale geometrie raster niet wordt beperkt door een rotatiehoek de beeldvorming van micropalen meer dan 5 ° off-as het moeilijk bijsnijden om een ​​beelduitsnede zonder dat onvolledige micropalen, die vervolgens leads een falen van de "Generate Grid" functie. In een dergelijk geval kan de gebruiker de geïntegreerde rotatiefunctie gebruiken voordat het MicroPOST posities analyseren.

De beschreven methode is vooral toegepast op twee botkanker cellijnen, een ouderlijke cellijn genaamd HuO9 en een afgeleide zeer metastatische lijn uitgedrukt M132 karakteriseren. In dit kader werden er meer dan zeshonderd eencellige beelden genomen in heldere veld modus en met behulp van de MechProfiler software geanalyseerd. De volgende data mining bleek dat de ouderlijke cellijn HuO9 oefent iets meer kracht en bestrijkt doorgaans meer micropalen per cel dan cellen van de metastatische cellijn M132. Echter de cellenniet gesynchroniseerd en dus verschillende stadia van de celcyclus op het moment van bevestiging, die waarschijnlijk bijgedragen aan de uiteenlopende resultaten. Door het nemen van levende cellen die beelden over perioden van maximaal 24 uur, bleek dat na de verspreiding veel cellen blijven op hun oorspronkelijke positie, terwijl anderen migreren, verspreiding, los en migreren opnieuw met verschillende snelheden (zie aanvullende video's). Dit geeft aan dat de mechanische profiel van een cel vaak niet constant en kan sterk variëren over een celpopulatie of zelfs binnen een enkele cel, afhankelijk van de huidige activiteit. Een andere bijdragende factor kan zijn die op een MicroPOST matrix een cel wordt gedwongen migratie discrete stappen als MicroPOST, dit in tegenstelling tot klassieke TFM, waarbij de cellen hechten aan vlakke oppervlakken en kunnen migreren met kleine stappen komen uitvoeren. Echter, om deze kleine stappen analyseren moeten fluorescentiebeelden van focale adhesie punten te nemen, die over zeer geavanceerde m vereisticroscopes en zeer uitgebreide beeldanalyse software. Niettemin, de verdeling van mechanische profielen binnen grotere populaties vaak nog een kenmerk van een cellijn. Aldus wordt een high-throughput methode karakterisering mogelijk maakt van een groot aantal cellen is essentieel. De handleiding imaging proces en de open-access software hier gepresenteerde herbergt een groot potentieel voor het schalen naar volautomatische microscoop systemen.

Samengevat een robuuste trekkracht microscopie aanpak gepresenteerd die gemakkelijk adoptable in een standaard celbiologie lab. De gehele workflow van cel zaaien tot beeldanalyse is eenvoudig en doeltreffend. Hoewel de hier beschreven protocollen zijn volledig functioneel, verbeteringen zijn gaande om de analyse algoritmen aan te passen om te kunnen ook overweg MicroPOST arrays met orthogonale lay-outs en het ontwikkelen van procedures dat de analyse van het beeld sequenties van live cell imaging vereenvoudigen. In verband met de resultaten voor botkanker cel lines, de hier beschreven aanpak kan worden gebruikt voor het screenen van cellen uit klinische biopsies om vast te stellen of een dergelijke assays prognostische waarde kan houden, waardoor clinici de metastatische potentieel van biopsie cellen van patiënten botkanker voorspellen. Een dergelijke test de therapeutische strategieën zou beïnvloeden. Andere mogelijke toepassingen betrekking hebben op het testen van farmaceutisch actieve verbindingen op mechanisch actieve cellen zoals gladde spiercellen of hartspiercellen, potentieel om te helpen bij het vaststellen van de werkzaamheid of toxiciteit van een geneesmiddel.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
T25 cell culture flasks	Nunc	156367
1x PBS-buffer	Sigma	D8537
0.5% Trypsin-EDTA	Life Technologies	15400054
Medium DMEM/F12	Sigma	D8437
FBS South America	Life Technologies	10270106
Penicillin-Streptomycin 100x	Sigma	P4333
15 ml centrifuge vials	Sarstedt	62.554.502
Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin	MicroDuits	MPA-col1/FN	Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm
Ethanol abs p.A.	Merck	100.983
12-well plate	Nunc	150628
Formalin solution, neutral buffered 10%	Sigma	HT5011
Brilliant Blue G-250	Sigma	27815	Coomassie blue
Methanol ACS p.A.	Merck	1.06009
Acetic acid	Sigma	695092
Glass bottom dish	WillCo Wells BV	GWSb-3522	35 mm diameter, aperture 22 mm
T-100 Eclipse	Nikon	n/a	Inverted microscope
D3-L3	Nikon	n/a	Camera controler
DS Fi2	Nikon		Camera