Introduction
Механотерапии чувствительные основе клеток анализы позволяют расследование прилипшие клетки, с широким спектром применения, которые отражают центральную роль, которую может играть механика в клеточной биологии. Эти приложения часто сосредоточиться на основных механизмов, которые управляют субклеточные процессы или поведение цельноклеточную. С одной стороны, внешние факторы окружающей среды, такие как дополнительное состава матрикса или матрицы жесткости может существенно влиять на механические и биологические реакции в клетке. 1 То же самое можно было наблюдать после использования многих классов фармацевтически активных соединений, воздействие которых являются часто характеризуется использованием модели клеточной культуры. 2 С другой стороны, генотипических свойств, таких как те, которые вызваны спонтанным или экспериментально индуцированных генетических мутаций, могут вызвать заметные изменения в клеточной фенотипа, которые связаны с изменениями в структуре цитоскелета и функции. 3 Эти примеры лишь немногие из многих возможныхТемы, по которым механические фенотипирование клеток является актуальной, и все из них были с пользой разбираться с micropost массивов.
На момент написания этой статьи, примерно 200 статей были опубликованы описания клеток micropost взаимодействия. Эти работы обсуждаются теоретические аспекты micropost принципов отклонения, а также практические инструкции по их производству. Первая статья, описывающая взаимодействие клеток и гибких массивов micropost была опубликована Тан и его коллеги в 2003 году 4 В отличие от классической тяги силовой микроскопии (TFM), где непрерывные мягкие субстраты, используемой для оценки сократительной клеток nanonewton масштабе, Тан и др. описан способ с использованием нескольких близко расположенных вертикальных балок из силиконового эластомера. Основные преимущества этого метода возникают из двух основных функций. Во-первых, с тем, чтобы изменить жесткость подложки клеток-очевидно нужно только изменить размеры, сохраняя micropostкомпозиция в противном случае постоянной и, таким образом, избежать различия в топологии и химии поверхности подложки. Второй microposts действовать как отдельные источники, которые могут быть дискретно анализируемых с силой и пространственным разрешением порядка отдельных координационных спаек и может уменьшить аналитические проблемы, которые присущи с аналогичным анализа по стандарту МТФ.
На сегодняшний день ассортимент приложений для micropost массивов значительно превышает только отображение сил в течение нескольких одиночных клеток. Например, Акияма сообщает об использовании изолированной Спинной сосуд ткани от моли гусеницы в качестве привода для массива micropost, для того, чтобы разработать мышцы насекомых питанием автономный микро-робота. 5
Тем не менее, большинство опубликованных приложения microposts сосредоточились на изучении медицинских условиях, таких как инфекции или рака. Например, micropost массивы были использованы для изучения поколения силовое комплекте типа IV пили Neisseria gonorrhОЕА колонии, который связан с сигналом каскадов повышения инфекции. 6 Другие используемые microposts изучать клетки рака молочной железы, получавших фармацевтических соединений, направленных цитоскелета. 7
Прогиб micropost часто описывается с помощью классической теории света для консоли с конечным нагрузки, предполагая ячейку придает только самый кончик micropost. Здесь приложенная сила F, что вызывает отклонение б зависит от "жесткости" изгиба к этой micropost и вычисляется по формуле:
(1)
с Е, I, L и будучи модуля Юнга, момент инерции площадей и длина пучка соответственно. Тем не менее, результаты этого уравнения дают лишь общее приближение сил на работе, так как балки стрижки и изгиб, а также подложки деформации не учитываются переменного токарассчитывать. Учитывая, что microposts как правило, сделаны из мягких материалов, таких как полидиметилсилоксановой (PDMS) основе силиконового каучука эти факторы должны быть включены. . Шон и др показали, что существует такой фактор коррекции на основе соотношения сторон micropost (L / D) и соответствующие полимера коэффициент Пуассона V 8 Оно дается.:
(2)
С Т наклона (v) является коэффициент наклона, что включает в себя подходящий параметр а = 1,3, как можно найти в той же статье:
(3)
Это означает, что жесткость исправлена micropost в K корр является продуктом чистого изгибной жесткости к = к изгибу и поправочный коэффициент корропределяется по формуле:
(4)
Таким образом, расчеты клеток сила должна быть выполнена с использованием более совершенной изменение уравнения (1) сейчас читаете:
(5)
Влияние коррекции становится более очевидным, как только типичные значения для размеров micropost используются. Например, 15-микронный пор micropost с круглым поперечным сечением и диаметром 5 мкм из ПДМС основе силиконового каучука приводит к поправочный коэффициент 0,77 и, следовательно, без поправки расчет будет переоценить оказываемое клеток силы на 23%. Это становится еще более тяжелой для microposts с меньшими пропорциями.
Традиционно, micropost анализа изображений также были основаны на идеализированной пучка теории изгиба. В 2005 году группа, которая является пионером в использовании MICROPOST массивы опубликовал программное обеспечение для анализа изображений подходит для анализа micropost 9 программное обеспечение требует лицензии на программное обеспечение, а пользователь должен принять три изображения для каждой позиции. по одному из верхних и нижних плоскостей micropost в режиме передачи в и другой в режиме флуоресценции с окрашенных ячейки. После сравнения верхние и нижние позиции для каждого micropost программное обеспечение определяет вектор силы поля и вычисляет соответствующие параметры, как сила на должность. Другие пакеты программного обеспечения существуют и их принципы анализа кратко упоминается в соответствующих статьях, описывающих их, но эти аналитические программные пакеты, как правило, не является общедоступной. 10,11
Массивы micropost, предназначенные для отображения ячеек сил может быть классифицированы как будучи в ортогональной планировки micropost или гексагональную, последний из которых имеют то преимущество, равноудаленных зазоры между соседними всех microposts. Типичные microposts гаве круглое поперечное сечение и их размеры в диапазоне от 1,0 до 10 мкм в диаметре и от 2 до 50 мкм в длину. 4 Однако microposts с эллиптической или квадратным поперечным сечением также сообщалось. 12,13
Использование силиконовых смесей ПДМС основе как micropost материала позволяет добавлять наночастиц в смеси. Например добавки кобальта нано-стержней обеспечивает магнитную активацию micropost и таким образом дает еще степень свободы для потенциальных экспериментальных образцов. 14 Большинство групп произвести их массивы micropost на плоских жестких материалах, таких как стекло или крышка внутри чашки Петри. Тем не менее, Манн и его коллеги недавно сообщили массив micropost сформированный на раст мембраны. 15 Это позволяет приложению клеточных растягивающих сил в адгезивных клеток при изучении живых клеток внутриклеточное динамические характеристики с точки зрения клеточной сократимости.
Широко используются и наиболее Estabчания способ получения micropost массивов на основе мягкой литографии, как описано в глубокие протоколов Sniadecki и коллег. 16-18 коротких стандартных процессов в чистых помещениях используются для создания микроструктур на вершине кремниевой пластины с использованием SU8 фоторезиста. Это сопровождается копировального процесса, в котором силиконовый каучук отливают над структуры передачи их в формы. На втором этапе эти формы используются для репликации исходной микроструктуры с использованием силиконового каучука на вершине выбранного субстрата. Однако, несмотря на большой и растущего числа публикаций, связанных с их применением, устанавливающих производственный процесс для microposts занимает значительное количество времени, даже для микро-инженерных специалистов; Есть много шагов процесса, которые требуют оптимизации и адаптации к конкретной тестовой среде и макет micropost с получением приемлемого уровня качества.
Коммерческие массивы micropost теперь доступны в готовом-то-использование ("вне-шельф") формат с неизменно высоким качеством. Как таковые, они являются альтернативой сложной и длительной производственного процесса, необходимого для производства на месте. В этой статье коммерчески доступный массив micropost был использован для отображения клеточные силы с помощью одного ярко-микроскопии изображение. Что еще более важно эта статья описывает и документирует полностью функциональное программное обеспечение с открытым исходным кодом под названием MechProfiler, которая доступна для скачивания в виде дополнительного материала к этой рукописи. Активно поддерживается версия программного обеспечения также можно найти на http://www.orthobiomech.ethz.ch.
Сочетание "вне-шельф" анализа и совместимым программным обеспечением для анализа с открытым исходным кодом заметно снижает барьер входа для достижения точных экспериментов TFM. Исследователи не имеют доступа к либо чистых помещений или опыт разработки программного обеспечения может анализировать клеточные силы успешно. Это позволяет пользователю сосредоточиться на mechanosensitivity анализ выход, а не сама технология, и делает измерения силы тяги, доступные для более широкого сообщества. Кроме того, это важный шаг, чтобы проложить путь к полностью автоматической скрининга micropost массивов.
Программное обеспечение MechProfiler анализ процессов изображения в формате TIFF-файл, PNG, BMP и JPG. Изображения могут быть приняты с использованием флуоресценции, фазового контраста или яркие поля световой микроскопии. Автономная программа работает вместе с бесплатным Matlab Compiler Runtime (доступной по адресу: Рисунок 12) и основные алгоритмы позволяет упорядочить обработку изображений, что позволяет пользователю обрабатывать изображения с одной или нескольких ячеек в 1 мин. Кроме того, эти клетки могут быть либо жить или "фиксированной".
Программное обеспечение MechProfiler способен значительно повысить пропускную способность анализа данных, опираясь на воспроизводимость качества коммерческой micropost массивов, более конкретно, по умолчанию & #8220; без отклоняется "положение каждой должности в массиве можно предположить с идеальной сетки (производственные отклонения для сетки в массивах, используемых в данном исследовании были меньше, чем 100 нм).
В короткой открывает выбор файлов изображений для анализа, культуры их интересующей области, определяет сообщения, покрытые клетками, или которые должны быть отброшены, определяет пост позиции, вычисляет отклонения / силы против идеальной сетки, и, наконец, сохраняет все данные клеточные конкретных, с возможностью для экспорта, в том числе в стандартном офисном таблицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. культивирования клеток на Micropost массивов
Примечание: Все шаги должны быть выполнены в кабинете биологической безопасности, чтобы обеспечить стерильность. Объемы приведенные здесь для культивирования клеток Т25 колб. Культуры клеток среднего рецепт и посева клеток плотность оптимизированы для линий рака костных клеток HuO9 и M132.
- Подготовка клеточной культуры для посева на массив micropost.
- Проверка качества клеточной культуры путем размещения культуральной колбы на стандартном оптическом микроскопе. Убедитесь, что клетки показывают типичную морфологию роста и путем оценки, сколько из культуральной колбы дна покрыта. Охватом 70% -80% отражает здоровый рост. Обратите внимание на количество плавающих клеток, как они представляют отмершие клетки и / или заросший культуры.
- Trypsinize клетки путем удаления среды и промыванием 4 мл 1x фосфатным буферным солевым раствором (PBS) буфере. Добавить 0,8 мл 1x трипсин / этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA) и инкубируют при комнатной температуре в клетке дос сместить, который занимает около 2-4 мин. Проверьте процесс с микроскопом, а иногда и нажмите колбу осторожно, чтобы поддержать оплывание.
- Добавьте 5 мл клеточной культуральной среды (модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM), / F12 с 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% пенициллина / стрептавидин (Pen / Strep)), чтобы остановить реакцию, и смыть остаточных клеток, которые еще сидят на дне колбы в. Впоследствии пипетки этой суспензии вверх и вниз несколько раз, чтобы получить однородную смесь. Убедитесь, что пипетки все решения по всей первоначальной площади роста колбы, чтобы получить эффективную оплывание.
- Передача клеточной суспензии в 15 к трубке и мл центрифуге его использовании настольную центрифугу при 0,5 мкг в течение 3 мин.
- Удалить супернатант и повторно приостанавливать осадок клеток в 5 мл среды с помощью пипетки вверх и вниз 5 раз. Убедитесь, чтобы избежать поколение пузырьков, делая так.
- Определить плотность клеток с помощью подсчета клеток камеру и легкий microscoфиз ра. Проверьте клеточной суспензии в счетной камере клеток для сотовых агрегатов и обеспечить, чтобы только отдельные клетки для последующего эксперимента. Внесите снова вверх и вниз несколько раз, если клетки имеют тенденцию образовывать агрегаты для разделения их.
- Развести клеточной суспензии с достаточной среде, чтобы получить клеточный раствор 25000 клеток / мл. Смешайте это хорошо, переворачивая закрытой трубе несколько раз.
- Подготовьте массив micropost для посева клеток.
Критическая Примечание: Не пипетки на массив micropost непосредственно, так как это может нанести вред на microposts, особенно когда нежелательные пузырьки вводятся. Кроме того, убедитесь, что массив micropost никогда не высыхает, как происходит капиллярные силы приводят к рушится из microposts.- Поместите стеклянную подложку с массивом micropost лицевой стороной вверх в скважине 12-луночного планшета с помощью пинцета и влажный это путем добавления 1 мл этанола (99%). Выдержите при комнатной температуре в течение 20-30 сек.
- Развести этаноластупенчатое добавление приблизительно от 1 мл стерильной деионизированной воды (ДИ воды) на стороне скважины и аспирации приблизительно 1 мл, с помощью пипетки передачи или отсасывающего устройства. Повторите этот шаг, по крайней мере в 3 раза.
- Заменить ди-вода с PBS-буфере таким же образом, добавляя и аспирации приблизительно до 1 мл. Повторите этот шаг 3 раза.
- Замените PBS-буфер с добавлением среды и аспирационных примерно 1 мл среды. Повторите этот шаг 3 раза.
- Внесите решение 1 мл клеточной (25000 клеток) в верхней части каждой подготовленный массив micropost. Закрыть мульти-луночный планшет и перенести его на инкубаторе (СО 2 5%, 37 ° С). Пусть клетки придерживаться и расти поверх microposts для 6 -7 часов.
- Проверьте процесс адгезии иногда с помощью света микроскопа. Убедитесь, что большинство клеток появляются разбросаны по нескольким microposts.
2. Крепежные и окрашивания клеток
Примечание: Все действия иОбъемы приведены здесь для одной лунке 12-луночного планшета в. Рекомендуется обрабатывать не более четырех из двенадцати скважин на время, чтобы избежать высыхания колодцев после аспирации любой жидкости, которая приведет к краху microposts.
- Отберите среду из скважины и промыть клетки 2x 1 мл PBS-буфера. Убедитесь, что применить нежный силу при промывании PBS, чтобы удалить сотовый мусора, которые, накопленный в массиве micropost во время инкубации и отсоединить мертвые клетки.
- Зафиксировать клетки с 0,5 мл 3,7% забуференном растворе формальдегида в течение 5 мин.
- Замените раствор формальдегида промывкой micropost массива 2x с 1 мл стерильной дистиллированной воды.
- Пятно клеток с красителем (0,05% кумасси бриллиантовым синим в 50% воды, 40% этанола и 10% уксусной кислоты) в течение приблизительно 90 сек. Вымойте избыток окрашивания решение выключить 2x с 1 мл стерильной дистиллированной воды. Добавить 1 мл DI воды в micropost массив.
- Проверка окрашивания результат с помощью светового микроскопа. Повторите тон окрашивания шаг, если тело клетки слишком слабы, чтобы быть визуализированы.
- Магазин micropost массивы с окрашенных клеток на вершине в холодильнике при 4 ° С. Убедитесь, чтобы держать их под водой на все времена.
3. изображений сотовый
Примечание: Шаг 4 относится только к микроскопов без бесконечности исправлены оптики.
- Добавить 2 мл ДИ-вода в чашку Петри с тонким стеклянным дном для изображения с высоким разрешением.
- Перевести micropost массив, используя пинцет в визуализации блюдо с microposts вверх.
- Поместите изображения чашки Петри на стадии подвижного светового микроскопа.
- Включите компенсации кольцо объектива, используемого для получения изображения, пока число на шкале не представляет собой общую толщину всех материалов вдоль оптического пути, чтобы компенсировать несоответствие в показателях преломления стеклянной подложки, силиконового эластомера и жидкости сверху. Это должно привести к яркому внешнему виду micropostsЯдра.
- Закройте диафрагму на освещение стороне до 50% и удалите фазового контраста кольца из оптического пути благоприятной обычный режим светлого поля.
- Совместите массив micropost что microposts сформировать горизонтальную линию поперек поля наблюдения. Определить начальную точку (например, верхний левый) и переместите блюдо ступенчато Петри по сцене сканирования массива micropost, принимая многочисленные изображения.
- Возьмите все изображения с самой высокой настройке разрешения для камеры с использованием 20X 40X или цели. Цель иметь одну ячейку в центре изображения.
- Развертки по оси через подложку, пока кончики micropost не в фокусе. Используйте тонкую настройку фокусировки колесо микроскопа и поверните ее к упором на micropost нижней около 2-3 мкм.
- Установите стандартную процедуру формирования изображения, принимая ряд тестовых изображений одной секции массива охвативший параметров изображений по одному за раз (например, время экспозиции,настройки диафрагмы, настройки лампы и т.д.). Анализ изображений с MechProfiler и определить подходящий набор параметров для быстрого и надежного анализа.
Анализ 4. Изображение с Open Source Software »MechProfiler"
Примечание: Все функции программного обеспечения могут быть активированы с указательным устройством, используя левую кнопку мыши. Тем не менее, подготовленный оператор будет использовать документированные сочетания клавиш, предназначенные, чтобы быть на левой половине клавиатуры, чтобы позволить эффективную двуручный обработки изображения.
- Начните анализа изображений программное обеспечение MechProfiler и открыть ряд изображений, которые должны быть проанализированы, нажав кнопку "Открыть".
- Вставьте все параметры в разделе "Настройки", заданной разработчиком программного обеспечения. Определить параметры, которые должны быть специально сконфигурирован (т.е. контур порогового и минимальное расстояние) в соответствии с процедурами, описанными подробно в руководстве по программному обеспечению.
- Анализ изображенияс одной на один обрезка их области интересов с помощью "Crop" (нажмите и перетащите с нажатой кнопкой мыши вниз). Двойной щелчок внутри нарисованной прямоугольника, чтобы закончить эту акцию.
- Маркировка каждого видимого клеток контур один за одним, нажав на "Draw клеток очертания" и использовать кросс курсор волос для рисования, включая все microposts клетка, прикрепленных к.
- Откажитесь от любых нежелательных microposts, нажав кнопку "Не сохранять сообщения" и используйте кросс курсор волос для рисования. Приложить все microposts, которые принадлежат к клетке за пределами той части изображения или отклоняются по любой другой причине, но не в клетке, представляющей интерес.
- Запустите программное обеспечение подпрограммы "Найти центроидов" с помощью мыши. Отрегулируйте настройки фильтра рядом с кнопкой «Найти центроидов", пока все microposts не зарегистрировано, который виден по красным крестом в центре. Если настройка фильтра слишком низкие microposts будут игнорироваться, если она слишком высока муltiple позиции будут отмечены для одного micropost. Держите фильтр установка постоянной во время сессии анализа.
- Используйте функцию ручной редактирование "Ручная Edit" для центроидами с несколькими или пропущенных позиций micropost. Используйте мышь кросс волосы, чтобы выбрать micropost в вопросе, нажав и перетащив его поперек. Двойной щелчок внутри прямоугольника и поместите недостающую красный маркер в разделе увеличенное изображение, которое автоматически закрывается. Откажитесь такой micropost, если он находится за пределами нарисованной клеток контура (см шаг 4,5) до начала.
- Найти идеальный micropost сетку путем активации функции "Создать сетку" с помощью мыши. Убедитесь, что положение соответствует с истинным micropost головы, показанной синим кольцом, внутри нарисованной клеток контуром.
- Исправьте неуместны сетки производителя внутри области клеточной где это необходимо, используя соответствующую функцию "Редактировать" Мануэль с помощью мыши. Используйте перекрестие, чтобы выбрать micropost в Куestion нажав и перетащив его поперек. Дважды щелкните в открывшемся прямоугольника и поместите недостающую синий маркер в разделе увеличенное изображение, которое автоматически закрывается.
- Используйте кнопку "Рассчитать" Прогибы щелчком мыши, чтобы получить гистограмму значений отклонения рассчитанных на основе разницы между положение А micropost внутри секции изображения и генерируемого идеальной сетки.
- Сохраните полный анализ, включая таблицы значений с помощью мыши на кнопку "Сохранить".
- Продолжить анализ изображения, нажав на "Сброс Фото" и проанализировать еще один раздел изображения или щелчок мыши на "Следующее изображение", который можно удобно сделать с помощью правой клавиши клавиатуры curser.
5. Анализ данных - Mechanoprofiling
- Откройте файл "results.xls" с электронными таблицами офис программы из папки с анализируемых изображений. Он содержит данные с Альл расчетные значения в том числе всех micropost отклонений и стандартных производных мер, таких как работы (т.е. деформации подложки энергии) анализируемой ячейке.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основным преимуществом описанной методике заключается в его простоте и потенциал для быстрого и эффективного интеграции в повседневную лабораторных работ. Сочетание высокого качества коммерческих массивов датчиков в паре с программным обеспечением с открытым исходным кодом предоставляет информацию о механо-чувствительность, которые иначе необходим доступ к чистой комнате объектов и углубленного знания анализа изображений и разработке программного обеспечения. Рисунок 1 иллюстрирует рабочий предложенного метода. Она начинается с подготовки и посева клеток на массиве micropost. После фиксации и окрашивания клеток массивы micropost готовы к визуализации. Центральная часть методики является анализ изображений с помощью программного обеспечения MechProfiler. Пользователь может начать analyszng изображения сразу после ввода всех необходимых параметров в "Настройки" в GUI. Соответствующий размер пикселя длина, которая представлена в один пиксель и зависит от настроек пользователя. Она нуждается вбудет создан отдельно для каждого используемого увеличения, принимая изображения объектов с известным размером. Пример приведен в дополнительном фиг.9.
Качество изображения является ключевым фактором, поскольку это сильно влияет на процесс анализа. Для достижения высокого качества следует убедиться иметь стабильный и обслуживается регулярно платформу изображений, как показано на рисунке 2. В частности, выравнивание источника света важно, так как смещение вызовет нежелательные тени, которые могут быть проблематичным при анализе изображений. Кроме того, размещение светового микроскопа на вершине таблицы анти-вибрации или пластины является полезным в большинстве лабораторий, поскольку это дает дополнительную устойчивость во время съемки.
Преимущества использования тонкого стекла нижнюю чашку Петри для визуализации включают выше эффективных численных значений диафрагмы, что приводит к более светлое изображение с повышенным разрешением.
При такинг изображения в режиме светлого поля 50% закрытые диафрагмы рекомендуется, так как фокусировка на microposts советы облегчается благодаря окружностей, входящих в хрустящей темным кольцом. Кроме того, в случае б цель имеет компенсационный кольцо, важно, чтобы установить его правильно, чтобы достичь точных показаний силы. Влияние этой функции можно увидеть, сравнивая рисунок 3A и 3B Рисунок. Изображений, которые могут быть быстро проанализированы достигается путем объединения правильную настройку компенсации кольца вместе с оптимального освещения, как показано на рисунке 3C. Сильный контраст между micropost и его окрестности сокращает время анализа, как это ускоряет алгоритм поиска. Пользователи найдут, что только минимальный опыт необходим для достижения изображений, которые могут быть проанализированы с легкостью.
Важно отметить, что вышеупомянутые протоколы преодолеть критический и общий препятствием для быстрого и эффективного интеграции micropost массивов в рутинулабораторная работа. Это препятствие связано с необходимостью контроля качества массива - требование, что это достижимо только путем тщательного и детального экспериментального определения характеристик датчика воспроизводимости, чувствительности и точности. Однако, обратившись к коммерчески доступные массивы micropost это значительная препятствие полностью избежать. 4A и 4B иллюстрируют точность такого массива micropost. Отклонение от положения microposts хорошо под 200 нм и, таким образом сопоставима с "ошибкой" пикселей, который сопровождает камера / объективную комбинацию, в результате размер пикселя 82 нм для используемого установки. Анализ изображений с клетками отклонения microposts демонстрирует, что значения прогиба клеток, введенных существенно выше, чем 200 нм (как показано на фиг.4С и 4D рис), что приводит к удобному сигнала к шуму.
Рисунок 5 иллюстрирующихES различные виды выступлений для microposts в пределах изображения в зависимости от того, что отклоняется или нет. Как уже упоминалось выше, не являющихся отклоняется microposts имеют яркую круглую вид с темным кольцом вокруг них. Их положение может быть определено с помощью преобразования Хафа, который представляет собой метод выделения признаков для анализа цифровых изображений.
Кроме того, это показывает, что Отброшенные microposts на инвертированный микроскоп показать два сталкивается темные фигуры полумесяца (рис 5А). В прямой микроскоп край наконечника micropost и одной темной форме полумесяца должным образом видно, тогда как второй становится трудно обнаружить. Эти характеристики являются основой для расчета позиции ярких поле микроскопа изображений советов от отклоненных microposts, которые были разработаны для этого протокола и был назван "Контур подход".
Фиг.5В является одним из примеров рака костей HuO9ячейка на microposts отображаемого на инвертированный микроскоп (вверху). Анализируемый версия этого образа показывает результаты применяемого подхода контура (снизу). Рисунок 5C было принято, используя тот же массив micropost с прямой микроскоп (вверху). Снова анализировали версии показывает результаты с использованием подхода контура.
Каждый анализ изображений сессия начинается по верификации пользователя параметров в разделе "Настройки" в MechProfiler. Некоторые задаются производителем micropost как micropost размеров массива и жесткости пружины. Другие задаются пользователем, такие как значения для порога контура и минимальной отклонения порога в соответствии с процедурами, изложенными в руководстве по программному обеспечению. Тем не менее, важно отметить, что эти значения должны быть выбраны тщательно и должно быть постоянным для всех изображений в взаимосвязанного набора изображений, чтобы гарантировать сопоставимость. В то время как шаги предварительной обработки для изображения analysiс, как обрезка, которые самоуправления объяснения, лежащие в основе стратегии в для обеспечения таких функций, как "В поисках центроидов", "Генерация сетки" и "Контур" подхода необходимо более подробные объяснения.
Алгоритмическое выявление позиции по умолчанию micropost (как поставляется изготовителем) начинается с помощью "Поиск" Центроиды функцию программного обеспечения. Алгоритм начинается в верхнем левом углу изображения ищете для первого micropost. Впоследствии все другие microposts найдены на основе координат этой первой micropost плюс значения для сетки и micropost размера данной производителем следующего за гексагональной геометрии. Центр тяжести для каждого найденного micropost рассчитывается с помощью преобразования Хафа. Слайдер фильтр рядом с кнопкой командной графического интерфейса позволяет изменять чувствительность этого преобразования. Все найденные microposts отмечены красным крестом и их позиции отличаются суbsequent процессы.
Далее, функция "Создать сетку" приводит к координатам всех microposts советы. Они являются результатом многостадийного процесса. Во-первых функция оптимизации решается в том числе исходные позиции из предварительного выполненной "Найти центроиды" алгоритм по созданию идеального сетку. Во-вторых позиций microposts внутри области клеточной рассчитываются. Microposts с меньшим отклонением, чем определенные в параметре настройки "минимальный порог отклонения" по отношению к идеальной сетки обрабатываются с преобразованием Хью. Все остальные позиции micropost наконечник рассчитываются с использованием подхода, описанного выше контура для отклоненных microposts. Вот программа начинает поиск от первоначального центра тяжести от центра ячейки для круговой кромки (ярко-до темно) в пределах угла 15 ° (рис 5А). После того, как этот край находится круг с диаметром micropost данной устанавливается на тшляпа края с помощью порогового значения контура от настроек в GUI. Это параметр определяет, который используется пиксель серый значение для процесса подгонки. Чем выше это значение, тем больше Место склоняется к светлому micropost центре нижней, что ценят больше он подходит, что круг на темной micropost контуром. После того, как выбрали, что значение должно оставаться постоянным в течение всего анализ изображения в пределах данного исследования, чтобы избежать добавления искусственного отклонение или позвонив отклонения слишком консервативно.
Например, на рисунке 6 иллюстрирует важность принятия решения для соответствующего порогового значения контура. Программное обеспечение позволяет пользователю выбирать в широком диапазоне (от 0,1 до 0,9), чтобы охватить все возможные ситуации физически освещения. Перевод оптической информации в отклоняющих расстояний, приведенных для обоих крайних и более практическое значение в середине приведены на фиг.6В. Тем не менее, обучение пользователей программного обеспечения часто convergE К очень похожие пороговые значения контура, что приводит к сравнимым результатам, как можно видеть на рисунке 6С. Кроме того, с использованием стандартных процедур для окрашивания клеток и визуализации минимизирует риск неправильных пороговых значений контура, которые, как правило, должны остаться постоянным в течение взаимосвязанных наборов изображений.
Для того чтобы продемонстрировать устойчивость метода выбор механо-профилирования Результаты суммированы в рисунке 7. В 7А два результата от рака костных клеток HuO9 и два из M132 сравниваются. Все четыре массивы из той же партии и, следовательно, имеют одинаковые механические свойства. Анализ был проведен с фиксированным набором параметров для минимальной отклонения (0,25 мкм) и порога контура (0,125). Кроме того, два одинаковых комплекта изображений из СДЛ рака костного 2 были переданы два аналитиков без дополнительной информации о настройках параметров (рисунок 7Б). Влияние окрашивания по анализу был испытан съемке рака костей клеток, окрашенных Кумасси синим R. Впоследствии красителя удаляли. После повторного окрашивания кумасси синим G был взят второй набор изображений. 7С иллюстрирует результаты из обеих серий, которые были проанализированы тем же пользователем с одинаковыми значениями для минимального прогиба (0,25 мкм) и порог контура (0,25) ,
Типичным примером прикладного механо-профилирования представлена на рисунке 8А, в котором составлен данные представлены для линий раковых клеток костного HuO9 и M132 после анализа 151 клеток объединенных с каждой из четырех массивов. В этом обзоре все значения индикатора выше для HuO9, чем M132 уже о том, что клетки HuO9 применять более силы, чем M132. Тем не менее, данные анализа изображений содержит большое количество дополнительной информации одноклеточного, которые могут быть извлечены с целью лучше понять Phenotypic поведение клеточной линии и от клетки к клетке изменчивость в пределах данной линии. Представляя результаты для силы на micropost в коробке участка можно обнаружить, что, несмотря на аналогичный минимумов и максимумов, значения данных по-разному распределяются и действительно низкая метастатическим клеточная линия HuO9 клетки, как правило, применяются больше силы, чем очень метастатического M132 линии (рис 8B). Кроме того, по классификации значения силы по отношению к области клеточной оказывается, что средняя сила, действующая на клетке не только повышенным в течение HuO9 клеток по сравнению с M132, но также, что средняя сила за micropost увеличивается, как распространение клетки до средней силы на почтовых течении более стабильное значение (как можно видеть на рисунке 8c). Кроме того, для клеток, покрывающих семь microposts значения практически идентичны, что, вероятно, связано с тем, что они, как правило, появляются в гексагональной формы с одним центральным не-отклоняется micropost независимо от их клеточной линии. Помимо Diffпочтений сократительной, морфологические различия могут быть количественно интересный результат. Например, в отличие от высокоразвитых метастатических клеток M132 было очень мало HuO9 клетки, которые покрыты лишь три microposts. Другие морфологические сопоставления между клеточных линий могут быть сделаны, в том числе распределение области ячейки, представленной на число microposts покрытых. Рисунок 8D иллюстрирует, что два клеточных линий также различаются в динамическом распространения поведения при выращивании на вершине microposts. Короче говоря, mechanoprofile для родительской линии клеток HuO9 показывает, что они, как правило, охватывают большую площадь и применять чуть больше силы, чтобы microposts в то время как в метастатической клеточной линии M132, агрессивный клеток, происходит от HuO9, что характерно охватывает меньше microposts и применяет меньше усилие на micropost , Эти результаты демонстрируют потенциал подхода, основанного ПМФ дискриминационных приложений.
Рисунок 2. Настройка изображений. Стандартный инвертированный микроскоп используется для визуализации клеток на массивах micropost. Установка также содержит камеру микроскопа и ее контроллера, который также может обеспечить функции хранения данных. Большой экран, показанный не является существенным, но все же удобно для длительного изображенийсеансов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Руководство по визуализации micropost. (А) Изображение окрашенных клеток на массиве micropost принято с объективом 40х в режиме светлого поля. Номера отклоняются microposts видны как темные кольца, когда образ. Отброшенные сообщений предположить, эллиптическую форму с обеих темных и ярких субрегионов. Окрашенные клетки, которые покрывают microposts делает их появляются еще темнее к тому, что нет контраст между micropost и клетки. (B) Идентичные снимки, сделанные после регулировки объектива компенсации кольцо и вновь фокусировки. Здесь сердечники microposts становятся, по существу ярче и дать больше контраста. (С) Такую же позицию в образ снова после регулировки оборотовка все параметры освещения с контроллером камеры. Свободно стоящие microposts появляются как яркие круги с темным кольцом. Отброшенные microposts показать отличный полумесяц "тень" вокруг бухты ядра вдоль оси вытягивания. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.>
Рисунок 4. MechProfiler скриншоты анализируемых microposts. (A) Типичный пример пустой micropost массив можно увидеть на этом скриншоте. В microposts расположены в постоянном гексагональной структуры. (Б) гистограмма со значениями отклонения для этих microposts показывает, что все значения ниже 200 нм. (С) Типичный пример для HuO9 кости покрытия раковых клетоки потянув на нескольких microposts. Видно, что количество потянув неоднородна. (D) Гистограмма со значениями отклонения для ячейки HuO9 показывает широкий спектр отклонений, которая возникает из взаимодействия клеток с субстратом micropost. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5. Micropost выступления в ярко-поля освещения и стратегии для расчета свою позицию в изображении. (A) Номера отклоняется microposts появляется как яркий круговой области с темно-наружном кольце. Центр тяжести рассчитывается путем преобразования Хью. Отклоненных microposts показать темные фигуры полумесяца. В зависимости от настройки микроскопа, если microposts лицом Бордовый Источник т (например, инвертированный микроскоп) есть два хорошо видимых форм полумесяца. Если microposts лицом объектив (например, в вертикальном положении микроскопа) только один полумесяц хорошо видно, но также самый край наконечника. В обоих случаях этот подход контура должны быть использованы для расчета наконечник micropost. (Б) Исходное изображение (вверху) с помощью инвертированного микроскопа из клетки костного рака HuO9 и его анализируемого версии (внизу), используя подход, контур. (С) Исходное изображение с того же массива micropost (вверху) с использованием прямой микроскоп и анализируется вариант, снова применяя подход контур (нижний), но с гораздо более низкой пороговой величины контура более подходящий для вызова темной кольцевой край. Пожалуйста, Нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
загрузить / 53350 / 53350fig6.jpg "/>
Рисунок 6. контура Подвод и выбора соответствующего порогового значения. (А) три картинки иллюстрируют те же проанализированы microposts с использованием трех различных пороговых значений контура. Если установлено значение либо слишком низкая (слева) или слишком высокое (справа), чем программное обеспечение подходит синее кольцо, представляющее micropost голову неправильно. Это недооценивает или проскакивает реальную позицию micropost голове. Правильно выбрано пороговое значение позволяет программное обеспечение, чтобы соответствовать, что синее кольцо в форме полумесяца темная область внутри micropost, что формирует через прогибом. (B) график показывает среднее количество отклонения в зависимости от выбранного порога контура для microposts показанных на выше. Это также показывает, что значения для microposts за пределами клеток чертах не влияет, так как фитинг контур не применяется там. (C) иллюстрирует, что график выборапороговое значение в интервале умеренных minimalizes риск переоценки или недооценки micropost прогибов. Разница между значениями выбранных разными обученных пользователей, как правило, меньше, чем 0,05, что приводит к различиям в приемлемых значений отклонения средних. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 7. Тест на устойчивость результатов механо-профиля из разных рак кости клеточных линий; Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение (А) Механо-профилирования результаты четырех идентичных массивов micropost после посева клеток на HuO9 массива 1 и M132 на массиве 3 -. Через четыре дня посева HuO9 на массив 2 и M132 на массив 4. (B) Сравнение результатов мechano профилирование на основе одинаковых наборов изображений после анализа двумя независимыми аналитиками. (С) Сравнение результатов анализа изображений от двух различных серий изображений Первый принято после окрашивания кумасси голубым R и второй после полного удаления красителя и повторного окрашивания Кумасси голубой G., пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры .>
Рисунок 8. механотерапии профилирование линий раковых клеток костного. (А) Сравнение между линиями раковых клеток двух костей HuO9 (низкий метастатический потенциал) и M132 (высокой метастатической) График показывает, что все значения индикатора выше для HuO9 клеточной линии ( Общая N = 302; два независимых комплекта экспериментов, ошибок бар = стандартное отклонение). (В Чонг>) Коробка участок показывает, что применяемые в micropost силы находятся в нижнем диапазоне нано-Ньютона. Тем не менее, HuO9 клетки тянуть больше, чем M132 клеток (Усы представляют минимум и максимум данных). (С) Аналогичный результат может быть виден при сравнении клеток, которые покрывают такое же количество microposts. HuO9 клеток применять более силы, чем M132 клеток. Количество HuO9 клеток, покрывающих три microposts не является представителем и включены только для полноты (бар ошибки = стандартное отклонение). (D), различных дистрибутивов через числа охваченных microposts показывают, что каждая строка клеток костного рака имеет собственную характеристику распространения при взаимодействии с micropost массивов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
ppfig9.jpg "/>
Дополнительное Рисунок 9. Размер пикселя для установки микроскопа обычно определяется с помощью специального микроскопа со шкалой бар на нем; альтернативно макет micropost массив, учитывая производителем могут быть использованы. Например, 15 единиц с 13 микрон (195 мкм общая длина), разделенных 2375 пикселей (установленных с инструментом обработки изображений) приводит к 0,082 мкм / пиксель. Пожалуйста, нажмите здесь Чтобы смотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительное Рисунок 10. Сравнение образов рака кости клетки HuO9, взятой из той же позиции, используя два метода освещения на инвертированный микроскоп; The Dio окрашенных microposts являются зеленый флуоресцентный. (А Режим светлого поля. (Б) Исследуемый я маг принято после переключения на зеленый канал флуоресценции без переориентации. (С) Во-вторых флуоресценции изображение после коррекции фокусировки на очень micropost советы. (D) Наложение обоих каналов освещения Только с целью иллюстрации. (Е) для механотерапии индикаторы профилирования в результатах трех изображений. Несмотря коррекции фокуса полный прогиб не может быть оценена из флуоресцентных изображений. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительный беспроводнойфигура 11. Последовательность Изображение том же положении флуоресцентно окрашенных microposts использованием Dii на прямой микроскоп (А) Светлый поля изображения. Есть три microposts касаясь друг друга на кончике. (Б) той же позиции после переключения на флуоресцентного канала чуть выше головы microposts. (С) Понижение фокальной плоскости до самого кончика microposts. (DE) Последовательные изображения после дальнейшего понижения фокальной плоскости ступенчато к дна microposts. (F) образ microposts после снижения в фокальной плоскости внутри силиконового эластомера подложки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Дополнительное Рисунок 12. Скриншот MechProfiler GUI. Типичный результат анализа от профилирования рака костных клеток HuO9. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эта работа направлена на продвижение поле тяги силовой микроскопии существенно снижая технические и практические барьеры для входа на рынок. Эти барьеры приходят с двух сторон. Прежде всего это многочисленные нетривиальные технические проблемы, которые необходимо преодолеть, чтобы воспроизводимо производство и экспериментально эксплуатацию массив micropost. Во-вторых, это так же нетривиальная потребность в надежном полуавтоматической анализа отдельных сил клеточных - имея в виду, что типичный эксперимент может потребовать анализ сотен или даже тысяч клеток. Описанные выше методы были разработаны, чтобы сделать micropost основе тяги силовой микроскопии доступны в клеточной биологии лабораторий, которые не имеют техническую экспертизу жителя. Датчики и методы анализа, представленные в этой статье, должны позволить неспециалистам с готовностью и точно анализировать сил, создаваемых одиночных клеток.
Помимо доступа к клеточной биологии лAB, по крайней мере среднего качества светлого поля микроскопа, описанные методы требуют несколько дополнительных технических элементов. Здесь большинство пользователей могут выполнять действительные эксперименты тяги силовой микроскопии даже с ограниченным опытом, несмотря на мощности и универсальности техники. Тем не менее есть три важных аспекта в представленном протоколе, который должен быть рассмотрен. Во-первых, необходимо, чтобы гарантировать, что массивы micropost всегда покрыт жидкостью, чтобы избежать их, что распада за счет капиллярных сил. Во-вторых нужно оптимизировать параметры изображения для полученных изображений micropost, которые лучше всего делать путем принятия серии изображений одной и той же позиции массива при изменении времени экспозиции, диафрагмы диафрагмы и положение компенсации кольцо. Важно найти правильный фокальной плоскости для кончика micropost, и этот аспект делает занять некоторое учитывая опыт малогабаритный глубина массивов сенсоров. В-третьих, нужно скачать открыто доступной для анализа изображений программное обеспечение MechProfiler discusseD здесь, для которых подробное руководство пользователя и учебные примеры доступны на сайте загрузки. После некоторого опыта, используя программное обеспечение для анализа примеров, приведенных в руководстве, пользователь должен принять тестовые изображения на установке изображений, которые будут использоваться для того, чтобы настроить подходящие настройки микроскопа. На основании полученных изображений, пороговое значение контура должны быть оптимизированы подобным. Один micropost изображение можно проанализировать обученным пользователем в течение минуты с использованием программного обеспечения MechProfiler открытым кодом независимо от того, содержит ли он одну или несколько ячеек, что позволяет генерировать статистически релевантных результатов (анализ нескольких сотен клеток) в течение нескольких часов ,
Другой аспект, который требует настройки является оптимизация процедуры любой прикладной окрашивания клеток. Когда клетки чрезмерно окрашенных программное обеспечение может не зарегистрировать правильные позиции micropost. С другой стороны, если окрашивание слишком слабы, что требует больших усилий со стороны пользователя для обнаружения"Правда" клеток контур в виде тонких клеточных выступов могут быть пропущены.
Однако, применяя фиксированное протокол процедуры окрашивания клеток и изображений массив диапазон для этой ошибки становится низкой. В ходе этой работы процедуры окрашивания различных клеток были испытаны на основе различных концентраций кристаллическим фиолетовым, в присутствии поверхностно-активных веществ, таких как от Tween 20 или Тритона-X, или комбинации красителей путем добавления эозином. Тем не менее, интенсивность окрашивания, а также ее стабильность существенно варьировать от эксперимента к эксперименту. Только использование Brilliant Blue G, как описано выше показали приемлемый окрашивания клеток надежность в сочетании с достаточно интенсивности по-прежнему видеть тонкую клеточную схему, но без вмешательства в развитой подхода контура.
В общем, есть варианты, чтобы изменить подарил технику. Например, комбинируя методы ярко-полевых представленные здесь с флуоресцентной микроскопии окрашивания органеллкак ядра или сети актина нитей, которые могут предоставить дополнительную информацию об основной клеточных процессов в контексте механики клеток. Кроме того, с помощью длинной цепью диалкиловые carboxycyanines (DII или DIO) в microposts стали флуоресцентные. 14 Тем не менее, важно контролировать каждый отклонение от представленной техники. В дополнительные цифры 10 и 11 иллюстрируют рис потенциальных ловушек. Изображения, полученные из Кумасси синий G окрашенных NIH-3T3 фибробластов в зеленой флуоресценции канала (рис 10b и 10с) с помощью инвертированного микроскопа представить основные micropost телам, но не их советы, ведущие к неисправной анализа положения (рис 10E). Несмотря на все усилия, чтобы переориентировать после переключения из режима светлого поля (рис 10А) советы micropost не могут быть отображены, которые могут быть из-за поглощения сигнала флуоресценции по клеточной пятно. Это в отличие от IMAГЭС, принятые с желтой флуоресцентной канала прямой микроскоп (рис 11B-11F) где множество четкие изображения могут быть получить по оси. Здесь пользователь должен убедиться, что изображение взято с фокальной плоскостью на самом кончике (рис 11C), а не где-то ближе к нижней micropost избежать вызова неисправные значения отклонения.
Следует отметить, что существуют также технические ограничения для micropost анализов. Например, точность обнаруженного отклонения зависит от качества оптической схемы. Микроскопы часто оптимизированы для флуоресцентной визуализации, в котором светочувствительность подключенной камеры имеет более высокий приоритет, чем большим количеством пикселей. Естественно, это приводит к изображениям с большим размером пикселей. Кроме того, следует отметить, что светлого поля изображения не могут определить, является ли сотовые выступы достигают нижней подложки. Тем не менее, коммерческие массивы micropost были протестированы с использованием конфокальноймикроскопия. Было установлено, что клетки, кажется, принять двоичный покрытие, что способствует адгезии только на кончиках micropost и не для остальной части массива micropost. Другим фактором, происходит от позиционной ошибки массива micropost, который, как было показано, чтобы быть 0,2 мкм. Вместе с данной жесткости пружины 2,8 мкм Н.Н. / это приводит к ошибке в силовом считывания 0,6 NN. Еще одно ограничение для micropost анализов вытекает из того факта, что применяемые силы из microposts совместно несколькими клеток не может быть определена. Таким образом, только изолированные одиночные-клетки могут быть проанализированы. Конкретный ограничение на представленной протокола происходит от правильного применения чувствительной контура подхода, который требует определенного количества кадров для пользователя, чтобы получить достоверные результаты. Кроме того, для более быстрого анализа пользователь должен получать изображения в котором матрица micropost выровнена с образованием горизонтальной или вертикальной линии вдоль края области наблюдения. Despitе тот факт, что программный алгоритм для нахождения microposts в гексагональной геометрии сетки не ограничивается углом поворота по визуализации microposts более 5 ° от оси затрудняют обрезать на раздел изображения, не содержащей неполные microposts, который затем приводит в провал попытки функции "Создать сетку". В таком случае пользователь может использовать встроенную функцию вращения, прежде чем начать анализировать micropost позиции.
Описанный метод был в основном применяется для характеристики двух клеточных линий рака кости, родительской клеточной линии по имени HuO9 и получены высокой метастатической линии номинированные M132. В этом контексте более шестисот изображения одноклеточные были приняты в режиме яркого поля и проанализированы с помощью программного обеспечения MechProfiler. Добыча последующие данные показали, что родительская клеточная линия HuO9 оказывает немного больше силы и, как правило, охватывает более microposts на ячейку, чем клеток от метастатического клеточной линии M132. Однако клеткине синхронизированы, и поэтому на разных этапах клеточного цикла в момент фиксации, которая, вероятно, внесли свой вклад в широком диапазоне результатов. Принимая образы живые клетки в течение периодов времени до 24 часов, было установлено, что после внесения многие клетки остаются на их исходное положение, тогда как другие мигрируют, распространение, отключите и снова мигрируют с различными скоростями (см дополнительные видео). Это указывает на то, что механический профиль клетки часто не постоянна и может значительно варьироваться в зависимости от популяции клеток или даже в пределах одной клетки в зависимости от ее текущей деятельности. Еще одним фактором может быть, что в массиве micropost клетка принудительного выполнения отдельных шагов миграции для достижения другой micropost, которая в отличие от классического МТФ, где клетки придерживаться плоских поверхностей и может мигрировать с минуту шагов. Тем не менее, для того, чтобы проанализировать эти маленькие шаги необходимо предпринять флуоресцентные изображения координаторов адгезии, что требует доступа к очень продвинутой мicroscopes и высоко сложные программное обеспечение для анализа изображений. Тем не менее, распределение механических профилей в рамках более крупных популяций до сих пор часто является определяющей характеристикой клеточной линии. Таким образом, метод с высокой пропускной который позволяет характеристика большого числа клеток является существенным. Ручной процесс визуализации и программное обеспечение с открытым доступом, представленные здесь таит огромный потенциал для расширения, чтобы полностью автоматические системы микроскопа.
В целом надежный подход тяги силовой микроскопии представлены, что легко может быть усыновлен в стандартной клеточной биологии лаборатории. Весь рабочий процесс от посева клеток на анализе изображений является простым и эффективным. В то время как протоколы, описанные здесь, являются полностью функциональными, улучшения продолжаются адаптировать алгоритмы анализа, чтобы иметь возможность также обрабатывать массивы с micropost ортогональных макеты и разработки процедур, которые упрощают анализ последовательности изображений из изображений живых клеток. В контексте с результатами для рака костей элементная литийопределяет, подходы, описанные здесь, могут быть использованы для скрининга клеток из клинических биопсии для того, чтобы установить, является ли такие анализы могут провести прогностическое значение, позволяя врачам предсказать метастатического потенциала биопсии клеток больных раком костного. Такой анализ будет влиять на терапевтических стратегий. Другие потенциальные области применения относятся к тестирование фармацевтически активных соединений на механически активных клеток, таких как клетки гладких мышц или кардиомиоцитов, потенциально оказать помощь в создании эффективности лекарственного средства в или токсичности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm |
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
- Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
- Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
- Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
- Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
- Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
- Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
- Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
- Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
- Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
- Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
- Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311 (2007).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
- Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).
