Introduction
Mekanik-duyarlı hücre bazlı deneyler mekaniği hücre biyolojisi oynayabileceği role yansıtan geniş bir uygulama yelpazesi ile, yapışık hücrelerin araştırmak için izin verir. Bu uygulamalar genellikle hücre içi süreçleri ya da tam hücreli davranışını sürücü altında yatan mekanizmalar odaklanın. Bir yandan, bu tür ekstra hücresel matris bileşiminin ya da matris sertlik gibi dış çevre faktörleri önemli ölçüde bir hücrenin mekanik ve biyolojik tepkiyi etkiler. 1, aynı farmasötik olarak aktif bileşiklerin çoğu sınıflarının kullanımından sonra gözlenebilir, etkileri olan vardır genellikle hücre kültür modelleri kullanılarak karakterize edilmiştir. 2 tür iskeleti yapısı ve fonksiyonu değişiklikler ile ilişkili hücre fenotipi işaretli değişiklikleri uyarabilir spontan veya deneysel genetik mutasyonların neden olduğu gibi diğer taraftan genotipik özellikleri üzerinde. 3 Bu örnekler vardır Birçok olası birkaçkonular hangi hücrelerin mekanik fenotiplendirilmesi ilgili olduğunu ve tüm bu yararlı micropost dizileri ile incelenmiştir.
Bu yazının yazıldığı, yaklaşık 200 makaleler hücre micropost etkileşimini anlatan yayınlanmıştır. Bu eserler micropost saptırma ilkeleri teorik yönlerini yanı sıra kendi imalatı pratik talimatlar tartışmak. Hücreler ve esnek micropost dizilerin etkileşimini anlatan ilk makale, sürekli yumuşak yüzeylerde Tan ve ark nanonewton ölçekli hücre kasılma, tahmin etmek için kullanılır, klasik çekme kuvvet mikroskobu (TFM) aksine 2003. 4'te Tan ve arkadaşları tarafından yayımlandı. silikon elastomerden yapılmış çok yakın aralıklı dikey kirişler kullanılarak bir yöntem açıklamıştır. Bu tekniğin başlıca avantajları, iki ana özelliklerinden ortaya çıkmaktadır. Tutarken İlk hücre görünür substrat sertliği değiştirmek için yalnızca tek bir micropost boyutlarını değiştirmek gerekiyorAksi takdirde sürekli ve böylece yüzey topoloji ve kimya farklılıkları kaçınarak substrat bileşimi. İkinci microposts discretely bireysel odak yapışıklıklar sırasına kuvvet ve mekansal kararları ile analiz edilebilir ve standart TFM tarafından benzer analizler doğasında olan analitik zorlukları azaltabilir bireysel yaylar gibi hareket ederler.
Bugün micropost dizileri için uygulama aralığı büyük ölçüde birkaç tek hücreler için kuvvetlerin sadece haritalama aşıyor. Örneğin, Akiyama bir böcek kas gücünü bağımsız mikro robot geliştirmek amacıyla, bir micropost dizisi için bir harekete geçirici olarak güve tırtıl bir izole dorsal damar dokusu kullanımını bildirir. 5
Bununla birlikte, microposts en yayınlanmış başvurular enfeksiyon ya da kanser gibi tıbbi durumların çalışmalara yoğunlaşmıştır. Örneğin, micropost diziler Neisseria gonorrh ve paketlenmiş tip IV pili kuvvet nesil incelemek için kullanılmıştır. Sinyal kaskadları enfeksiyon artırılması ile ilişkili 6 Diğerleri hücre iskeleti hedefleyen ilaç bileşikleri ile tedavi meme kanseri hücrelerini incelemek için microposts kullandık OEA kolonileri. 7
Bir micropost sapması genellikle hücrenin varsayarak bir uç yük ile bir konsol için klasik ışın teorisi kullanılarak tarif edilir ancak micropost çok uç takılır. Bir saptırma ö neden İşte uygulanan kuvvet F micropost yönettiği "bükülme sertliği" k bağlıdır ve hesaplanır:
(1)
E, I, L ve varlık Young modülü, sırasıyla atalet ve kiriş uzunluğunun alan anı ile. Alt tabaka eğilmesi ac alınmadığı Ancak, bu denklemden sonuçlar sadece ışın kesme beri iş ve hem de eğilme kuvvetlerin genel yaklaşım vermeksaymak. Microposts tipik polidimetilsiloksan (PDMS) gibi yumuşak malzemelerden yapılmış olması dikkate alındığında bu faktörlerin dahil edilmesi gereken silikon kauçuk tabanlı. . Schoen ve arkadaşları micropost (L / D) ve karşılık gelen polimerin Poisson Oranı v oranına göre bir düzeltme faktörü olduğunu göstermiştir 8 O ile verilir.:
(2)
T eğim (v) aynı maddede bulunabilir gibi uydurma parametre a = 1.3 içeren bir devirme katsayısı olma ile:
(3)
Bu bir micropost en düzeltilmiş sertlik k corr saf eğilme sertliği k = k viraj ürün ve düzeltme faktörü corr demektirtarafından verilen:
(4)
Bu nedenle, hücre kuvvet hesaplamaları şimdi okuma denklem (1) daha rafine varyasyon kullanılarak yapılmalıdır:
(5)
Düzeltme etkisi kısa sürede micropost boyutları için tipik değerler kullanılır gibi daha belirgin hale gelir. Örneğin, dairesel bir kesite ve PDMS bazlı silikon lastikten yapılmış 5 um'lik bir çapa sahip bir 15-mikronluk bir uzun micropost 0.77 bir düzeltme faktörü yol açar ve bu nedenle, düzeltilmemiş hesaplama% 23 tarafından uygulanan kuvvetleri hücre olduğundan fazla olacaktır. Bu daha şiddetli küçük boy oranları ile microposts için olur.
Geleneksel olarak, micropost görüntü analizi de idealize kiriş eğilme kuramına dayalı olmuştur. 2005 yılında MICR kullanımına öncülük grupOPOST diziler micropost analizi için uygun bir görüntü analiz yazılımı yayınlanan 9 yazılımı yazılım lisans gerektirir ve kullanıcı her pozisyon için üç görüntüleri almak zorundadır.; iletim modu ve lekeli hücre floresan modunda başka biri micropost üst ve alt uçakları birer. Her biri için üst ve alt pozisyonları karşılaştırarak sonra yazılım bir kuvvet vektör alanı belirler ve yazı başına kuvvet gibi ilgili parametreleri hesaplar micropost. Diğer yazılım paketleri var ve bunların analizleri prensipleri kısaca bunları açıklamak gelen maddelerde belirtilen, ancak bu analitik yazılım paketleri genellikle kamuya açık değildir. 10,11
Eşleme hücre kuvvetleri için tasarlanmış micropost dizileri tüm komşu microposts arasında eşit mesafeli boşlukların avantajına sahip olan ikinci bir ortogonal micropost düzeni veya altıgen biri olmak ya da sınıflandırılabilir. Tipik microposts habir dairesel geçiş kısmına ziyaretinde ve boyutları oval ya da kare kesitli microposts de rapor edilmiştir, ancak uzunluğu 50 um ila 1,0 um çapında 10 um ve 2. 4 arasında değişir. 12,13
Micropost malzemesi olarak PDMS bazlı silikon karışımlarının kullanılması karışımı içine nano-tanecikleri ilave sağlar. Kobalt nano çubuklar ekleyerek Örneğin micropost bir manyetik aktivasyon sağlayan ve böylece potansiyel deneysel tasarımlar özgürlük başka derecesini verir. 14 Çoğu grup kapak cam gibi veya Petri kabı içinde düz sert yüzeylerde kendi micropost dizileri üretmek. Bununla birlikte, Mann ve arkadaşları son bir gerilebilir zar üzerinde oluşturulmuş bir dizi micropost bildirmiştir. 15, hücre kontraktilite açısından canlı hücre sub-hücresel dinamik yanıtları okurken bu yapışık hücreler hücre germe güçlerine uygulanmasını da mümkün kılar.
Yaygın olarak kullanılan ve çoğu estabSU8 fotorezist ile bir silikon gofret üstüne mikro üretmek için kullanılan temiz oda, kısa, standart işlemlerde SNIADECKI ve ark. 16-18 arasında derinlemesine protokoller de tarif edildiği gibi micropost dizileri yapmak için yayımlanır işlemi, yumuşak litografi dayanmaktadır. Bu silikon kauçuk kalıplara aktarılması yapılar üzerinde döküm edildiği bir kopyalama işlemi ile takip edilir. İkinci bir aşamada, bu kalıplar, seçilen bir alt-tabaka üzerine bir silikon kauçuğun kullanımım başlangıç mikro çoğaltmak için kullanılır. Ancak microposts için bir üretim sürecini kuran kendi uygulamasıyla ilgili yayınlar, büyük ve artan sayıda rağmen mikro mühendislik uzmanları için bile zaman önemli miktarda alır; kabul edilebilir bir kalite düzeyini elde etmek için belirli laboratuar ortamında ve micropost düzeni optimizasyon ve adaptasyon gerektiren birçok işlem basamakları vardır.
Ticari micropost dizileri hazır t artık mevcutsürekli yüksek kalite ile o-kullanım ("off-the-raf") biçimi. Bu nedenle onlar bünyesinde üretimi için gerekli olan karmaşık ve uzun üretim sürecinin bir alternatiftir. Bu yazıda, bir ticari olarak temin edilebilir micropost dizisi, tek bir aydınlık alan mikroskopi görüntü kullanılarak selüler kuvvetleri haritasını hazırlamak için kullanıldı. Daha da önemlisi, bu makalede açıklanan ve bu yazının tamamlayıcı malzeme olarak yüklenebilir MechProfiler adında bir tam fonksiyonlu açık kaynak yazılımlar, belgelemektedir. Yazılımın bir aktif tutulan versiyonu da http://www.orthobiomech.ethz.ch adresinde bulunabilir.
Bir "off-the-raf" tahlil ve uyumlu bir açık kaynak analiz yazılımı kombinasyonu belirgin doğru TFM deneyler gerçekleştirmek için giriş engel düşürür. Temiz oda tesisleri veya yazılım geliştirme uzmanlığı ya erişimi olmayan araştırmacılar başarıyla hücresel güçleri analiz edebilirsiniz. Bu mechanos odaklanmak için bir kullanıcı sağlayanensitivity tahlil çıktı ziyade teknoloji kendisi ve daha geniş bir topluluk için kullanılabilir çekiş gücü ölçümleri yapar. Ayrıca, bu micropost diziler tam otomatik tarama doğru yolunu açmak için önemli bir adımdır.
MechProfiler analiz yazılımı dosya biçimi tiff, png, bmp ve jpg görüntüleri işler. Görüntüler floresan, faz kontrast ya da parlak alan ışık mikroskobu kullanılarak alınabilir. Başına bir program (mevcut: Şekil 12) ücretsiz Matlab Derleyici Runtime ile birlikte çalışır ve temel algoritmaları yaklaşık 1 dakika içinde tek veya birden fazla hücreleri ile görüntüleri işlemek için kullanıcı sağlayan aerodinamik görüntü işleme, izin verir. Ayrıca, bu hücreler ya yaşayan olabilir ya da "sabit".
MechProfiler yazılım ölçüde kaliteli ticari micropost diziler tekrarlanabilirlik dayanarak veri analizi verimini artırmak mümkün, daha spesifik olarak, varsayılan & #8220 non-deflected "dizisindeki her yazının konumunu ideal ızgara karşı kabul edilebilir (bu çalışmada kullanılan dizilerde ızgara imalat sapmalar az 100 nm idi).
Kısacası birinde, ilgilenilen bölgeye onları ekinler, analiz için görüntü dosyaları bir seçim açar hücreler tarafından kapsanan mesajları tanımlar veya atılması gereken sonrası pozisyonları belirler deplasmanlar / İdeal ızgara karşı güçlerini hesaplar ve nihayet Standart ofis-tabloya dahil, ihracat için bir olasılık tüm hücre özel verileri kaydeder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Micropost Dizileri 1. Kültürleme Hücreler
Not: Tüm adımlar sterilite sağlamak için bir biyogüvenlik kabini içinde yapılmalıdır. Burada verilen miktarlar T25 hücre kültürü şişeleri içindir. Hücre kültürü ortamı tarifi ve hücre tohum yoğunluğu, kemik kanseri hücre çizgileri HuO9 ve M132 için optimize edilmiştir.
- Bir micropost dizisi üzerine tohumlama için hücre kültürü hazırlayın.
- Standart ışık mikroskobu kültür şişesi koyarak hücre kültürü kalitesini kontrol edin. Hücreler kaplıdır ne kadar kültür şişesi alt tahminine göre tipik bir büyüme ve morfoloji göstermektedir emin olun. % 70 -80% A kapsama sağlıklı bir büyüme oranını yansıtır. Onlar ölü hücreleri ve / veya büyümüş kültürünü temsil olarak hücrelerin yüzen miktarına dikkat edin.
- 4 mi 1x Fosfat ile orta ve yıkama kaldırarak Hücreleri tripsinize edin salin (PBS) tampon tamponlu. Hücre kadar oda sıcaklığında 0,8 ml 1 x tripsin / etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave edin ve inkübeyaklaşık 2-4 dakika sürer s sökülmüş. Mikroskop ile süreci kontrol ve bazen yerinden oynatmamaya desteklemek için hafifçe şişeyi hafifçe vurun.
- 5 ml hücre kültür ortamı (Dulbecco tadil edilmiş Eagle ortamı (DMEM)% 10 cenin sığır serumu (FBS ile / F12),% 1 penisilin / streptavidin (Pen / Strep)), reaksiyonu durdurmak için hala oturup bakiye hücrelerini yıkamak için ekleme balona en altta. Daha sonra homojen bir karışım elde etmek için yukarı ve aşağı birkaç kez bu süspansiyonu pipetle. Etkili bir yerinden oynatmamaya kazanmak için balonun orijinal büyüme alanı boyunca tüm çözümler pipetle emin olun.
- 15 ml'lik bir tüpe, hücre süspansiyonu aktarın ve 3 dakika boyunca 0,5 x g'de bir masa üstü santrifüj kullanılarak da santrifüj.
- Süpernatantı ve yukarı pipetleme ve 5 kat aşağı 5 ml ortamda hücre pelet yeniden askıya. Bunu yaparken kabarcıklarının oluşumunu önlemek için emin olun.
- Bir hücre sayımı odacığı ve bir ışık mikroskobik kullanılarak hücre yoğunluğu belirlemekpe. Hücre agrega için hücre sayım odasında hücre süspansiyonu kontrol ve sonraki deney için tek tek hücrelere sahip sağlamak. Pipet hücreleri onları ayırmak için agrega oluşturmak üzere tekrar ve birkaç kez aşağı eğilimi varsa.
- 25.000 hücre / ml hücre solüsyonu elde etmek için yeterli bir ortam maddesi ile bir hücre süspansiyonu ile seyreltilir. Kapalı tüpü birkaç kez ters yüz edilerek iyice karıştırın.
- Hücre tohumlama için micropost dizisi hazırlayın.
Kritik Not: Bu potansiyel microposts zarar verebilecek doğrudan gibi istenmeyen kabarcıklar tanıtıldı, özellikle micropost dizisi üzerine pipetle etmeyin. Ayrıca, micropost dizisi asla kılcal kuvvetler microposts çöken yol olarak oluşan kurur emin olun.- Bir çift cımbız kullanarak bir 12 oyuklu plaka iyi yüzü yukarı bakacak şekilde ve 1 ml etanol (% 99) eklenmesi ile ıslatın micropost dizisi ile cam substratın yerleştirin. 20-30 saniye boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
- Etanol seyreltinde tarafında yaklaşık 1 ml steril deiyonize su (DI su) ilave edilmesi ve bir transfer pipeti veya aspirasyon cihazı kullanılarak yaklaşık olarak 1 ml aspire aşamalı olarak gerçekleştirilebilir. Bu adımı en az 3 kez tekrarlayın.
- Ekleme ve yaklaşık olarak 1 ml aspire aynı şekilde PBS-tamponu ile DI-su değiştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Ekleme ve yaklaşık ortam 1 ml aspire ortam ile PBS-tampon değiştirin. Bu adımı 3 kez tekrarlayın.
- Hazırlanan her micropost dizinin üstünde pipetle 1 ml hücre solüsyonu (25.000 hücre). Çok-yuvalı plaka yakın ve bir kuluçka transfer (CO 2 5%, 37 ° C). Hücreler yapışır ve 6 -7 saat microposts üstünde büyümek edelim.
- Bir ışık, bir mikroskop kullanarak bazen yapışma sürecini inceleyin. Hücrelerin en Birden microposts yayılmış görünür olduğunu kontrol edin.
2. Tespit ve Boyama Hücreleri
Not: Tüm adımları veBurada verilen miktarlar 12-çukurlu bir plaka tek bir oyuk içindir. Bu microposts çökmesi ile sonuçlanır herhangi bir sıvı, bir aspirasyon sonra kuyuların Bir kurumasını önlemek için bir seferde on iki kuyu dörtten fazla işleme sokulması tavsiye edilmektedir.
- Kuyudan aspire orta ve yıkama hücreler 1 ml PBS tamponu ile 2x. Inkübasyon sırasında micropost dizisi üzerinde biriken hücre debrisini uzaklaştırmak için ve ölü hücreleri ayırmak için PBS ile yıkama sırasında hafif bir kuvvet uygulamak için emin olun.
- 5 dakika boyunca 0.5 ml% 3.7 tamponlu formaldehit solüsyonu ile hücrelerin sabitleyin.
- 1 ml steril DI su ile micropost dizi 2x yıkayarak formaldehit çözüm değiştirin.
- Yaklaşık 90 sn için (% 50 su,% 40 etanol ve% 10 asetik asit içinde% 0.05 Coomassie Brilliant Blue) boya ile hücrelerin Leke. 1 ml steril DI su ile 2x kapalı aşırı boyama çözüm yıkayın. Dizi micropost 1 ml distile su ekleyin.
- Bir ışık mikroskobu kullanılarak boyama sonucu kontrol edin. Tekrarlama tHücre gövdesi görüntülenmiştir çok sönük ise o adımı boyanarak.
- 4 ° C 'de bir buzdolabında üzerine boyanan hücreler ile mağazası micropost dizileri. Her zaman su altında tutmak için emin olun.
3. Hücre Görüntüleme
Not: Adım 4 sadece sonsuzluk düzeltilmiş optik olmadan mikroskoplar için de geçerlidir.
- Yüksek çözünürlüklü görüntüleme için ince bir cam alt kısma sahip bir Petri kabı, 2 ml DI-su ilave edilir.
- Microposts yukarı bakacak şekilde görüntüleme çanak içine bir cımbız kullanarak micropost dizi aktarın.
- Işık mikroskobu bir hareketli sahnede görüntüleme Petri kabı yerleştirin.
- Ölçekte sayı cam alt tabaka, silikon elastomer ve üstünde sıvı kırılma indeksleri uyumsuzluğu telafi etmek için optik yol boyunca tüm malzemelerin toplam kalınlığı temsil dek görüntüleme için kullanılan lensin tazminat halkasını çevirin. Bu microposts parlak bir görünüm gitmelidirçekirdekler.
- Aşağı% 50 aydınlatma tarafında iris kapatın ve sıradan bir parlak alan modu sağlayan optik yol herhangi bir faz kontrast halkaları çıkartın.
- Microposts gözlem tarlada yatay bir çizgi oluşturacak micropost dizi aynı hizaya getirin. Bir başlangıç noktası (örneğin, sol üst) tanımlar ve sayısız görüntüleri çekerken micropost dizisi tarayarak sahne üzerinde Petri kabı adım adım hareket ettirin.
- 20X veya 40X objektif kullanarak kamera için en yüksek çözünürlük ayarı ile tüm görüntüleri çekin. Görüntünün merkezinde tek bir hücreyi hedefliyoruz.
- Micropost ipuçları odak kadar madde boyunca z ekseni boyunca hareket ettirin. Mikroskop ince ayar odak tekerleğini kullanın ve yaklaşık 2-3 um için micropost alt odaklanarak doğru çevirin.
- (Bir seferde görüntüleme parametreleri tek doğru süpürme tek dizi bölümünün test görüntülerinin serisini alarak standart bir görüntüleme prosedürü oluşturulması, örneğin, maruz kalma süresi,iris ayarı, lamba ayarları vb.) MechProfiler görüntüleri analiz ve hızlı ve güvenilir bir analiz için uygun bir parametre setini belirler.
Açık Kaynak Yazılım "MechProfiler" 4. Görüntü Analizi
Not: Tüm yazılım fonksiyonları sol fare düğmesini kullanarak bir işaretleme cihazı ile aktif hale getirilebilir. Ancak, eğitimli operatör verimli iki elle görüntü işleme etkinleştirmek için klavyenin sol yarısında olacak şekilde tasarlanmıştır belgelenmiş kısayol tuşlarını kullanabilirsiniz olacaktır.
- Görüntü analiz yazılımı MechProfiler başlatın ve "Aç" tıklayarak analiz edilmesi gerekir görüntülerin bir dizi açın.
- Yazılım geliştiricisi tarafından verilen "Ayarlar" bölümüne tüm parametreleri yerleştirin. Özel yazılım el kitabında ayrıntılı olarak tarif edilen prosedürlere göre (örneğin, kontur eşiği ve minimal mesafe) yapılandırılmalıdır parametreleri belirleyin.
- Görüntüyü analizs birer-one "Kırp" seçeneğini kullanarak, ilgi alanına bunları kırparak (tıklayın ve fare düğmesi ile sürükleyin basılı). Çizilmiş dikdörtgenin içine çift tıklayınız Bu eylemi tamamlamak için.
- "Hücre hatlarını çizin" ve hücre bağlı olduğu tüm microposts dahil çizim için çapraz saç imleci kullanın tıklayarak her görünür hücre anahat tek-tek işaretleniyor.
- "Sil Mesajlar" linkine tıklayarak istenmeyen microposts atın ve çizim çapraz saç imleci kullanın. Görüntü bölümü dışında bir hücreye ait veya başka herhangi bir nedenle değil, ilgi hücre tarafından deflected tüm microposts sarmalar.
- Yazılım alt yordamı fare tıklaması ile "Sentroidler Find" başlayın. Hemen yanında kendi merkezinde kırmızı bir çarpı görünür tüm microposts kayıtlı kadar "Sentroidler Bul" düğmesi, ayarı filtreyi ayarlayın. Filtre ayarı çok ise çok yüksek mu eğer düşük microposts, göz ardı edilecektirltiple pozisyonları tek bir micropost için işaretlenir. Bir analiz oturumu sırasında sürekli ayar filtreyi tutun.
- Birden veya cevapsız micropost pozisyonları ile centroids manuel düzenleme fonksiyonu "Manuel Düzenle" kullanın. Tıklatarak ve karşıdan karşıya sürükleyerek söz konusu micropost seçmek için fare çapraz saç kullanın. Dikdörtgenin içine çift tıklayın ve otomatik olarak kapanır büyütülmüş görüntü bölümünde, eksik kırmızı işaret yerleştirmek. Çizilmiş hücre anahat dışında ise böyle bir micropost atın devam etmeden önce (adım 4.5).
- Bir fare tıklaması ile "Izgara üret" fonksiyonunu aktive ederek ideal bir micropost ızgara bulun. Pozisyon çizilmiş hücre anahat içinde mavi bir halka ile gösterilen gerçek micropost kafası, tekabül emin olun.
- Bir fare tıklaması ile gelen "Manuel Edit" fonksiyonunu kullanarak gerekli hücre alanı içinde herhangi bir yanlış ızgara makinesi düzeltin. Qu micropost seçmek için çapraz saç kullanıntıklatarak ve karşıdan karşıya sürükleyerek Sorusuna. Görünen dikdörtgenin içine çift tıklayın ve otomatik olarak kapanır büyütülmüş görüntü bölümünde, eksik mavi işaret yerleştirmek.
- Bir micropost görüntü bölümü içindeki pozisyon ve oluşturulan ideal bir ızgara arasındaki fark esas alınarak hesaplanan sapma değerleri bir histogram almak için fare tıklaması ile renkli "Hesapla sehim" kullanın.
- "Kaydet" konulu bir fare tıklaması ile değerlerin tablolar dahil olmak üzere komple bir analiz kaydedin.
- "Görünüm Reset" ve uygun doğru klavye curser tuşu kullanılarak yapılabilir "Next Image", başka bir görüntü bölümü veya klik analiz tıklayarak ya görüntü analizi devam edin.
5. Veri Analizi - Mechanoprofiling
- Analiz görüntüleri ile klasörden bir ofis elektronik tablo programı ile dosya "results.xls" açın. Bu al veri içeriyoranaliz hücrenin bütün micropost sapması ve bu tür çalışmaların (yani, alt tabaka deformasyon enerjisi) gibi standart önlemler dahil olmak üzere türev l hesaplanan değerler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Açıklanan tekniğin ana avantajı rutin laboratuvar çalışmaları içine hızlı ve etkin entegrasyonu için sadeliği ve potansiyeli yatıyor. Açık kaynak yazılım ile eşleştirilmiş yüksek kalitede ticari sensör dizileri kombinasyonu olur, aksi takdirde görüntü analizi ve yazılım geliştirme bilgisine temiz oda tesislerine ve derinlemesine erişimi gerektirir mekano-hassasiyeti hakkında bilgi vermektedir. 1 sunulan yöntemin iş akışını gösterir Şekil. Bu micropost dizisi üzerine hücreleri hazırlanması ve ekim başlar. Hücrelerin sabitlenmesi ve boyama sonra micropost dizileri görüntüleme için hazırdır. Tekniğin merkezi kısmı MechProfiler yazılımını kullanarak görüntü analizidir. Bir kullanıcı derhal GUI "Ayarlar" ilgili tüm parametrelerin girdikten sonra görüntüleri analyszng başlayabilirsiniz. İlgili piksel boyutu, tek bir piksel tarafından temsil ve kullanıcının kurulum bağlıdır uzunluğudur. GerekliBilinen boyutu ile nesnelerin görüntülerini alarak her kullanılan büyütme için ayrı ayrı kurulacak. Bir örnek, ek Şekil 9'da verilmiştir.
Kuvvetle analiz sürecini etkiler olarak Görüntü kalitesi önemli bir faktördür. Özellikle Şekil 2'de görüldüğü gibi tek istikrarlı ve rutin bakım görüntüleme platformu olduğundan emin olmanız gerekir, en yüksek kaliteyi elde etmek için, ışık kaynağının hizalama analiz ederken sorunlu olabilir, istenmeyen gölgeler neden olacaktır hiza kadar önemlidir görüntüler. O görüntüleme sırasında ek istikrar sağlar Dahası, bir anti-vibrasyon masa veya plaka tepesinde ışık mikroskobu yerleştirerek en laboratuvarlarda faydalıdır.
Görüntüleme için ince bir cam alt Petri kabı kullanmanın avantajları artan çözünürlük ile parlak görüntüler çevirir yüksek etkili sayısal açıklık değerleri içerir.
Ne zaman takimicroposts ipuçları odaklanan kolaylaştırılmış olarak% 50 kapalı iris nedeniyle net koyu halka olarak görünen çevrelerine tavsiye edilir parlak alan modunda görüntüleri ng. Kullanılan objektif bir tazminat halkası vardır durumda Üstelik, doğru ayarlamak için doğru kuvvet okumalarını sağlamak için gereklidir. Bu özelliği etkisi Şekil 3A ve Şekil 3B karşılaştırılarak görülebilir. Hızlı bir şekilde Şekil 3C'de gösterildiği gibi, en uygun aydınlatma ile birlikte dengeleme halkasının doğru ayarı birleştirerek elde edilir analiz edilebilir Görüntüler. Bu arama algoritması hızlandırır bir micropost ve çevresi arasındaki güçlü kontrast analiz süresini azaltır. Kullanıcılar sadece asgari deneyim kolaylıkla analiz edilebilir görüntüleri elde etmek için gerekli olduğunu göreceksiniz.
Önemlisi, yukarıdaki protokoller rutin haline micropost dizilerin hızlı ve etkin entegrasyon eleştirel ve ortak engeli aşmaklaboratuvar çalışması. Sadece sensör tekrarlanabilirliği, hassasiyet ve doğruluk titiz ve ayrıntılı deneysel karakterizasyonu tarafından ulaşılabilir olduğunu bir talep - Bu engel dizi kalite kontrol ihtiyacından kaynaklanıyor. Bununla birlikte, ticari olarak temin edilebilen micropost dizileri dönerek bu oldukça büyük bir engel tam. Kaçınılması Şekiller 4A ve 4B, bir micropost dizi doğruluğu göstermektedir edilir. Microposts pozisyon sapması iyi 200 nm altında kullanılan kurulum için 82 nm'lik bir piksel boyutunda sonuçlandı kamera / objektif kombinasyonu eşlik eden "piksel hatası" böyle karşılaştırılabilir gibidir. Microposts saptırma hücreleri ile görüntü analizi gürültü oranı rahat bir sinyal verilmesine yol (Şekil 4C ve Şekil 4D'de gösterildiği gibi), bir hücre-uygulanan sapma değerleri esas olarak daha yüksek, 200 nm olduğunu gösterir.
Şekil 5, illustrates bir görüntü içinde microposts için maçta farklı türde o bükülmesi olup olmadığını bağlı. Olmayan bükülmüş microposts Yukarıda sözü edildiği gibi çevrelerinde koyu halka ile, parlak bir görünüme sahiptir, dairesel. Pozisyonları dijital görüntü analizi için bir özellik ekstraksiyon tekniği bir Hough dönüşümü kullanılarak belirlenebilir.
Bundan başka, bir inverted mikroskop ile yönü değiştirilmiş microposts koyu yarım ay şekiller (Şekil 5A) karşı karşıya iki gösterdiği açıkça görülür. Ikincisi tespit etmek zorlaşır ise dik bir mikroskop micropost ucu ve bir koyu yarım ay şeklindeki kenar düzgün görebilir. Bu özellikler, bu protokol için geliştirilmiştir ve "Kontur Yaklaşımı" seçildi deflected microposts, ipuçları ve parlak bir alan mikroskobu görüntüleri konumlarını hesaplamak için temel oluşturur.
Şekil 5B, bir HuO9 kemik kanseri bir örnektirinvert mikroskop (üst) görüntülü microposts hücre. Bu görüntünün analiz versiyonu uygulanan kontur yaklaşımı (alt). Şekil 5C, dik bir mikroskop (üst) ile aynı micropost dizisi kullanarak alındı sonuçlarını gösterir. Yine analiz versiyonu kontur yaklaşımı kullanılarak elde edilen sonuçları göstermektedir.
Her görüntü analizi oturumu MechProfiler "Ayarlar" bölümünde parametreleri bir kullanıcı doğrulama ile başlar. Bazı micropost dizi boyutları ve yay sabiti gibi micropost üreticisi tarafından verilmektedir. Diğerleri gibi kontur eşiği ve yazılım kılavuzunda ayrıntılarıyla prosedürlere uygun bir asgari sapma eşiği için değerler olarak kullanıcı tarafından tanımlanır. Ancak, bu değerlerin dikkatle seçilmeli ve karşılaştırılabilirliği garanti altına almak için görüntülerin birbiriyle kümesi içindeki tüm görüntülerin sürekli olması gerektiğini dikkate almak önemlidir. Görüntü analysi ön işlem adımları Oysas "Finding ağırlık merkezi" gibi yazılım fonksiyonları "Izgara Generate" ve "Kontur Yaklaşımı" daha detaylı açıklamalar gerek altında yatan stratejileri kendi kendini açıklayan, kırpma gibi, vardır.
Varsayılan micropost pozisyonu Algoritmik algılama (imalatçı tarafından teslim gibi) "bulma sentroidler" yazılım fonksiyonu kullanılarak başlar. Algoritma ilk micropost ararken bir görüntünün sol üst köşesinde başlar. Daha sonra diğer tüm microposts altıgen geometri aşağıdaki üreticisi tarafından verilen ızgara ve micropost boyutu için ilk micropost koordinatları artı değerlere dayalı bulunur. Her bulundu micropost için ağırlık merkezi, bir Hough dönüşümü kullanılarak hesaplanır. GUI komut düğmesinin yanındaki filtre kaydırıcı bu dönüşümün hassasiyetini ayarlayarak sağlar. Bulunan tüm microposts kırmızı bir çarpı ile işaretlenmiş ve pozisyonları su için belirtilmiştirbsequent işlemler.
Sonra, "Izgara Oluştur" fonksiyonu tüm microposts ipuçları koordinatlarına yol açar. Bir çok aşamalı bir süreç ile ilgili sonuçları. İlk bir optimizasyon fonksiyonu ideal bir ızgara kurmak için önce idam "sentroidler Find" algoritma başlangıç pozisyonları dahil çözülmüştür. İkinci hücre alanı içinde microposts pozisyonları hesaplanır. İdeal şebekeye ayar parametresi "Asgari sapma eşiği" göreli tanımlanan daha az sapma ile Microposts bir Hugh dönüşüm ile işlenir. Diğer tüm micropost ucu pozisyonları bükülmüş microposts için yukarıda tarif edilen kontur yaklaşımı kullanılarak hesaplanır. İşte yazılım (Şekil 5A bakınız) uzak (koyu parlak) dairesel kenar hücre merkezine 15 ° 'lik bir açı içinde ilk sentroidinden aramaya başlar. Bu kenar verilen micropost çapa sahip bir daire bulunduğunda t takılmıştırGUI ayarlarından kontur eşik değeri kullanarak şapka kenarı. Bu parametre, piksel gri değeri uygun işlem için kullanılan belirler. Yüksek bu değer uydurma parlak micropost merkeze doğru eğilir daha düşük daha koyu micropost anahat o daireyi uyan daha değer olduğunu. Bir kez tüm resim yapay sapma ekleyerek veya çok konservatif defleksiyonlara çağıran önlemek için, belirli bir çalışma içinde analizleri değeri sabit kalması gerektiğini seçilen.
Örneğin, Şekil 6, uygun bir kontur eşik değeri için karar önemini göstermektedir. Yazılım kullanıcı tüm fiziksel olarak mümkün aydınlatma durumları kapsayacak şekilde geniş bir yelpazede (0.9 0.1) için seçim yapmanızı sağlar. Her iki uç ve ortada daha pratik bir değer için verilen kıvrılma mesafelere optik bilgi çevirisi Şekil 6B'de verilmiştir. Ancak, eğitimli yazılım kullanıcıları genellikle converge çok benzer kontur eşik değerleri, Şekil 6C'de görüldüğü gibi benzer sonuçlara yol açar. Ayrıca, hücre boyama ve görüntüleme için standart prosedürler kullanılarak genel görüntü birbiriyle setleri için içinde sabit kalmalıdır geçersiz kontur eşik değerleri, riskini en aza indirir.
Yöntemin sağlamlığını göstermek amacıyla mekano-profil sonuçları bir seçim Şekil 7 de özetlenmiştir. Şekil 7A, iki kemik kanseri hücreleri HuO9 sonuçları ve M132 iki karşılaştırılır içinde. Dört dizileri aynı üretim serisi vardır ve bu nedenle benzer mekanik özelliklere sahiptir. Analiz minimal sapma (0.25 mikron) parametreleri sabit bir set ile ve kontur eşik (0.125) uygulandı. Buna ek olarak, SaOS 2 kemik kanserinden görüntüleri iki özdeş setleri parametre ayarları (bakınız Şekil 7 hakkında daha fazla bilgi vermeden iki analistler verildiB). Analiz boyama etkisi Daha sonra, boya çıkarıldı ve Coomassie Blue R ile boyanmış, kemik kanseri hücrelerinin görüntü alınarak test edilmiştir. Coomassie Blue G ile yeniden boyama sonrası görüntü bir ikinci resim alınmıştır. Şekil 7C minimum sapma (0.25 um) için aynı değerlere sahip aynı kullanıcı tarafından analiz edildi, her iki dizi, elde edilen sonuçları ve kontur eşiğini gösterir (0.25) .
Uygulanan mekano-profil tipik bir örneği, derlenen veri dört dizinin her havuzlanmış 151 hücreleri analiz ettikten sonra, kemik kanseri hücre çizgileri HuO9 ve M132 sunulmuştur, burada Şekil 8A, sunulmuştur. M132 için şimdiden HuO9 hücreleri M132 daha fazla kuvvet uygulamak belirten daha bu genel olarak tüm gösterge değerleri HuO9 yüksektir. Bununla birlikte, resim analizi ile ilgili verileri daha iyi anlamak için phen çıkarılan edilebilir ek olarak bir kez hücre bir bilgi büyük miktarda içerirBelirli bir satır içinde otypic hücre çizgisi davranışı ve hücreden hücreye değişkenliği. Bir kutu arsa micropost başına kuvvet sonuçlarını sunarak, bir benzer asgari ve azami rağmen, veri değerleri farklı dağıtılır ve aslında HuO9 hücreleri son derece metastatik M132 hattı daha fazla güç uygulamak eğilimindedir düşük metastatik hücre hattı (bakınız Şekil bulur 8B). Ayrıca, hücre alanına göre kuvvet değerleri kategorize tek hücre başına ortalama kuvvet sadece M132 için değil, aynı zamanda micropost artar ortalama kuvvet hücrelerinin yayılmasını olarak post ulaştığı ortalama kuvvet kadar karşılaştırıldığında HuO9 hücreleri için yüksek olmadığını bulur (Şekil 8C'de görülebilir) daha kararlı bir değer. Ayrıca yedi microposts kapsayan hücreler için değerler nedeniyle tipik merkezi bir altıgen şeklinde görünen gerçeği muhtemelen, hangi hemen hemen aynıdır olmayan deflected kendi hücre hattının micropost bağımsız. Apart diff'tenerences kasılmasındaki, morfolojik farklılıklar ilginç bir sonuç ile ölçülebilir. Yüksek düzeyde metastatik M132 hücrelerinin aksine Örneğin sadece üç microposts kapsamında çok az HuO9 hücre vardı. Hücre hatları arasında diğer morfolojik karşılaştırmalar kaplı microposts sayısı ile temsil edilen hücre alanının dağılımı dahil olmak üzere, yapılabilmektedir. 8D microposts en büyüdüğü zaman, iki hücre hatları da, dinamik yayılma davranışının farklı olduğunu göstermektedir Şekil. Kısacası, ebeveyn hücre hattı için mechanoprofile HuO9 tipik karakteristik az microposts kapsar fazla alanı kapsayacak ve metastatik hücre hattı M132, HuO9 türemiş saldırgan hücre ise microposts biraz daha kuvvet uygulamak olduğunu ortaya koymaktadır ve micropost başına daha az kuvvet uygular . Bu sonuçlar ayrımcı uygulamalar için TFM temelli yaklaşımın potansiyelini göstermektedir.
Şekil 2. Görüntüleme Ayarı. Standart inverted mikroskop micropost diziler üzerinde görüntüleme hücreleri kullanılır. Kurulum ayrıca veri depolama fonksiyonlarını sağlayacak bir mikroskop kamera ve denetleyici içerir. Gösterilen büyük ekran gerekli değildir, ancak yine de uzun bir görüntüleme için uygun olanoturumları. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Micropost görüntüleme için Şekil 3. Kılavuz. Parlak alan modunda 40X objektif ile çekilen bir micropost dizisinde boyanan hücrelerin (A) görüntü. Görüntülü zaman Olmayan deflected microposts koyu halkaları görünür. Seken mesajlar koyu ve parlak alt bölgeler hem bir eliptik şekil varsayıyorum. Microposts kapağı Vitray hücreler onları micropost ve hücre arasında hiçbir karşıtlık olduğunu noktaya bile daha koyu görünmesini yapar. (B) Özdeş görüntüler mercek tazminat halkasını ayarlayarak ve yeniden odaklama sonra alınan. İşte microposts çekirdekleri ölçüde parlak hale gelir ve daha fazla kontrast verir. (C) rla ma k sonra tekrar görüntüsü aynı pozisyonting Kameranın kumanda ile tüm aydınlatma parametreleri. Özgürce ayakta microposts koyu halka ile parlak daireler olarak görünür. Seken microposts çekerek eksen boyunca bight çekirdek etrafında farklı bir yarım ay "gölge" gösterir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.>
Şekil 4. analiz microposts arasında MechProfiler ekran. (A) boş tipik bir örneği, micropost dizi bu ekran görülebilir. Microposts sabit bir altıgen bir desende tanzim edilmektedir. (B) bu microposts için sapma değerleri histogram tüm değerler 200 nm altında olduğunu göstermektedir. Bir HuO9 kemik kanseri hücresi kaplaması için (C), tipik bir örneğive birden fazla microposts çekilmesi. Bu çekme miktarı, heterojen olduğu görülebilir. (D) HuO9 hücresi için sapma değerleri ile histogram micropost substrat ile hücrelerin etkileşimi kaynaklanan sapmaların geniş spektrumunu göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Micropost parlak alan aydınlatma görünüşleri ve bir görüntü içinde konumlarını hesaplamak için stratejiler. (A) Sigara deflected microposts koyu dış halka ile parlak dairesel bir alan olarak görünür. Centroid bir Hough dönüşümü ile hesaplanır. Deflected microposts koyu yarım ay şekilleri göstermektedir. Microposts ligh yüz eğer mikroskop kurulumuna bağlı t kaynağı (örneğin, ters mikroskop) iki iyi görünür yarım ay şekilleri vardır. Microposts lensi yüz (örneğin, dik mikroskop) tek yarım ay iyi görünür ama aynı zamanda uç çok kenarıdır. Her iki durumda da çevre yaklaşımı micropost ucu hesaplamak için kullanılır. Bir HuO9 kemik kanseri hücre ve kontur yaklaşımı kullanarak analiz versiyonu (alt) ters çevrilmiş bir mikroskop kullanarak (B) bir orijinal görüntü (üst). (C) dik bir mikroskop ve yeniden kontur yaklaşımı (alt) uygulayarak analiz sürümünü kullanarak aynı micropost dizisi (üst) Orijinal görüntü ama karanlık halka şeklinde kenar çağırmak için daha uygun çok daha düşük kontur eşik değeri. Ile Lütfen Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.
/ 53.350 / 53350fig6.jpg "upload />
Kontur yaklaşımı ve uygun eşik değeri seçiminde 6. Şekil. (A), üç ekran üç farklı kontur eşik değerleri kullanılarak aynı analiz microposts göstermektedir. Değer ayarlanırsa, ya çok düşük (solda) veya (sağ) yazılım hatalı micropost başını temsil mavi halka uyuyor daha çok yüksek. Bu hafife ve micropost kafasının gerçek konumunu aşma distorsiyonları göstermekte. Bir doğru seçilmiş eşik değeri sapması yoluyla oluşturan micropost karanlık içinde alan şeklinde yarı-moon mavi halkayı sığdırmak için yazılım sağlar. (B) grafik yukarıda gösterilen microposts için seçilen kontur eşiği bağımlı sapma ortalama miktarını gösterir. Aynı zamanda kontur uydurma orada uygulanan olmadığından hücre anahat dışındaki microposts değerleri etkilenmez olduğunu göstermektedir. (C) grafik seçerek göstermektedirılımlı bir aralık içinde bir eşik değeri aşırı ya da hafife micropost deplasmanlar riskini minimalizes. Farklı eğitimli kullanıcılar tarafından seçilen değerler arasındaki fark ortalama sapma değerleri kabul edilebilir farklar sonuçlanan 0.05, daha normal azdır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 7. Farklı kemik kanseri hücre hatları mekano-profil sonuçları için Sağlamlık testi; Hata çubukları, bir standart sapmasını temsil (A) Mekanik-profil dizide 3 dizinin 1. ve M132 üzerinde HuO9 hücreleri tohumlama sonra dört özdeş micropost diziler sonuçları -. Dört gün sonra dizi 4. (B) üzerine dizinin 2 ve M132 üzerinde HuO9 tohumlama m sonuçlarının karşılaştırılmasıiki bağımsız analistler tarafından analiz sonrası görüntülerin aynı setleri dayalı echano-profil. İlki Koomassie Mavi R ve Coomassie Mavi G. ile komple boya çıkarılması ve yeniden boyanması sonra ikinci ile boyandıktan sonra alınan farklı görüntü serisi iki görüntü analiz sonuçlarının (C) Karşılaştırma tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için .>
Şekil 8. kemik kanseri hücre çizgilerinin Mekanik-profil (A)., Iki kemik kanseri hücre çizgileri HuO9 arasında karşılaştırma (düşük metastaz potansiyeli) ve M132 (yüksek düzeyde metastatik) grafiktir tüm gösterge değerleri (HuO9 hücre hattı için yüksek olduğunu göstermektedir Toplam N = 302; İki bağımsız deney seti, hata çubuğu = standart sapma). (B trong>) kutu arsa micropost başına uygulanan kuvvetler alt nano Newton aralığında olduğunu göstermektedir. Ancak, HuO9 hücreleri M132 hücreleri (Whiskers veri minimum ve maksimum temsil) daha çekin. (C) benzer bir sonuç microposts aynı sayıda kapak hücreleri karşılaştırılarak görülebilir. HuO9 hücresi M132 hücrelerden daha fazla kuvvet uygulamayın. Üç microposts kapsayan HuO9 hücrelerin sayısı temsilcisi ve sadece bütünlüğü (hata bar = standart sapma) dahil değildir. (D) kapalı microposts numaraları arasında farklı dağılımlar micropost dizileri ile etkileşim, her kemik kanseri hücre hattının kendi yayılma özelliğine sahip olduğunu göstermektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
ppfig9.jpg "/>
Ek Şekil 9. mikroskop kurulumu için piksel boyutu genellikle bunun üzerine bir ölçek çubuğu ile özel bir mikroskop lamı kullanılarak belirlenir; alternatif üretici tarafından verilen micropost dizisi düzeni kullanılabilir. Örneğin, (bir görüntü işleme aracı ile kuruldu) 2375 piksel bölünmesiyle 13 mikron (mikron toplam uzunluğu 195) ile 15 adet 0.082 götürür mm / pxl. tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Ek Şekil, bir inverted mikroskop ile, iki aydınlatma teknikleri ile aynı konumdan alınan HuO9 kemik kanseri hücresinin görüntü 10. karşılaştırması; dio lekeli microposts yeşil floresan bulunmaktadır. (A aydınlık alan modu. (B) i yeşil floresan kanal geçtikten sonra alınan mage Analiz yeniden odaklanma olmadan. (C) çok micropost ipuçları odaklanan düzelttikten sonra ikinci floresan görüntü. Her iki aydınlatma kanallarının (D) Bindirme açıklama amacıyla yalnızca. (E), üç görüntüleri sonuçları gibi göstergeler Mekanik-profilleme. Tam sapma floresan görüntüleri tahmin edilemeyen odak düzelterek rağmen. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Fidik bir mikroskop DII kullanılarak floresan lekeli microposts aynı pozisyonu şekil 11 görüntü dizisi (A) parlak-alan görüntüsü.; ucunda birbirine değen üç microposts vardır. (B) hafifçe microposts 'başlarının üstünde floresan kanala geçtikten sonra aynı pozisyon. Microposts çok ucu odak düzlemi indirilmesi (C). (DE) ayrıca microposts 'dibe doğru odak düzlemi adım adım düşürdükten sonra ardışık görüntüler. (F) silikon elastomer substrat içinde odak düzlemi düşürdükten sonra microposts İmajının. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Ek Şekil MechProfiler GUI 12. Screenshot. Bir HuO9 kemik kanseri hücresinin profilleme Tipik analiz sonucu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışma esas olarak giriş teknik ve pratik engellerin düşürerek çekiş kuvvet mikroskobu alanını ilerletmek istiyor. Bu engeller iki taraftan geliyor. Öncelikle çoğaltılabilir imalatları ve deneysel bir micropost dizisi komisyon için aşılması gereken çok sayıda önemsiz olmayan teknik zorluklar bulunmaktadır. Tipik bir deney yüzlerce veya hücrelerin hatta binlerce analizini gerektirebilir akılda tutarak - İkincisi, benzer olmayan önemsiz tek hücre güçlerinin güvenilir bir yarı otomatik analizi için ihtiyaçtır. Yukarıda açıklanan teknikler yerleşik mühendislik uzmanlığı yok hücre biyolojisi laboratuvarlarında içinde micropost tabanlı çekiş kuvvet mikroskopisi erişilebilir hale getirmek için geliştirildi. Bu makalede sunulan sensörler ve analiz teknikleri olmayan uzmanlar kolayca ve doğru bir tek hücre tarafından uygulanan kuvvetleri analiz için izin vermelidir.
Apart hücre biyolojisi l erişimdenen az orta dereceli parlak alan mikroskobu ile ab, anlatılan yöntemler birkaç ek teknik elemanlar gerektirir. İşte çoğu kullanıcı tekniğin güç ve çok yönlülük rağmen, hatta sınırlı tecrübesi ile geçerli çekiş kuvvet mikroskopisi deneyler gerçekleştirebilirsiniz. Yine de dikkate alınmalıdır sunulan protokolünde üç kritik yönleri vardır. İlk olarak, micropost dizileri her zaman çöküşü bu kılcal kuvvetlerden ötürü olduğuna önlemek için sıvı ile örtülü olduğundan emin olmak için gereklidir. İkincisi iyi pozlama süresi, iris diyafram ve tazminat halka pozisyonunu değiştirerek Aynı dizi pozisyonunun görüntülerin dizi alınarak yapılır edinilen micropost görüntüler için görüntüleme parametrelerini optimize etmek gerekiyor. Bu micropost ucu için doğru odak düzlemi bulmak önemlidir ve bu yönü sensörü dizilerin küçük boyutlu derinliği verilen biraz tecrübe sürer. Açıkça erişilebilir görüntü analiz yazılımı MechProfiler Tartışılan indirmeniz gerekir üçüncüsüBurada d olan ayrıntılı kullanım kılavuzu ve eğitim örnekleri indirme sitesi mevcuttur. Uygun mikroskop ayarlarını yapılandırmak üzere kılavuzda sağlanan örnekleri analiz yazılımı kullanarak bazı deneyimden sonra, kullanıcı görüntüleme kurulumu test görüntüleri kullanılacak almalıdır. Elde edilen görüntüler göre, kontur eşik değeri Benzer optimize edilmelidir. Tek bir micropost görüntü birkaç saat içinde (hücre yüzlerce analizi) istatistiksel olarak ilgili sonuçlar üretilmesini sağlayan, bağımsız olarak, bir ya da daha fazla hücre ihtiva olmadığı açık kaynak MechProfiler yazılımı kullanılarak bir dakika içinde eğitimli bir kullanıcı tarafından analiz edilebilir .
Bazı ayar gerektiren başka bir yönü herhangi uygulamalı hücre boyama işleminin optimizasyonu olduğunu. Hücreler aşırı lekeli zaman yazılım doğru micropost pozisyonları kayıt başarısız olabilir. Boyama çok silik ise Öte yandan bir tespit kullanıcı tarafından daha fazla çaba gerektirirİnce hücre çıkıntıları olarak "gerçek" hücre anahat atlanabilir.
Ancak, hücre boyama ve dizi görüntüleme işleminin sabit protokol uygulayarak bu hata için aralık kabul edilebilir ölçüde düşük olur. Bu çalışma sırasında, farklı hücre boyama işlemleri kristal mor, Tween 20 veya Triton-X ya da, Eozin ekleyerek bir boya birleşimi gibi surfaktanların varlığında çeşitli konsantrasyonlarda göre test edilmiştir. Bununla birlikte, deney önemli ölçüde değişmiştir boyamanın yoğunluğu yanı sıra istikrar deneme. Yukarıda açıklandığı gibi Brillant Blue G Sadece kullanımı hala ince hücre anahat görmek için yeterli şiddette ancak gelişmiş kontur yaklaşımı ile müdahale etmeden kombine kabul edilebilir bir hücre boyama sağlamlığını gösterdi.
Genel olarak, sunulan teknik değiştirmek seçenekler vardır. Floresan mikroskopi boyama organellerin ile burada sunulan parlak alan tekniklerini birleştirerek ÖrneğinHücre mekaniği bağlamında yatan hücre süreçleri hakkında ek bilgi sağlayabilir nükleus veya aktin filament ağı gibi. Bundan başka, kullanarak uzun zincirli dialkil carboxycyanines (DII veya DIO) microposts flüoresan hale gelir. 14 Bununla birlikte, sunulan tekniği ile, her bir sapmanın kontrol etmek önemlidir. Ek Şekil 10 ve Şekil 11 potansiyel tuzaklar göstermektedir. Ters bir mikroskop kullanılarak yeşil floresan kanal (Şekil 10B ve 10C) ve Coomassie Blue G lekeli NIH 3T3 fibroblast hücre çekilen görüntüleri hatalı pozisyon analizi (Şekil 10E) giden ana micropost organları değil, onların ipuçlarını sunmak. Hücre leke ile floresan sinyalinin emilimi nedeniyle olabilir aydınlık alan modu micropost ipuçları görüntülü edilemez (Şekil 10A), geçtikten sonra yeniden odaklanabilmek için en iyi çaba rağmen. Bu ima tersidirdik bir mikroskop (Şekil 11 B-11F) sarı floresan kanal ile çekilen ges olup, burada birden fazla net görüntüler z ekseni boyunca elde olabilir. İşte kullanıcı görüntü hatalı sapma değerlerini çağıran önlemek için micropost altına yere daha yakın çok uç (Şekil 11C) de odak düzlemi ile çekilen ve emin olmak gerekir.
Bu micropost deneyleri için teknik sınırlamalar olduğu not edilmelidir. Örneğin, bir tespit sapma doğruluğu optik kurulum kalitesine bağlıdır. Mikroskoplar genellikle bağlı kameranın ışık hassasiyeti piksel sayıda daha yüksek bir önceliğe sahip olduğu floresan görüntüleme için optimize edilmiştir. Doğal olarak, bu daha büyük bir piksel boyutuna sahip görüntülere yol açar. Ayrıca, hücre çıkıntılar alt tabaka dibe ulaşması halinde parlak alan görüntüleri tespit edemez unutulmamalıdır. Bununla birlikte, ticari micropost dizileri konfokal kullanılarak test edilmiştirmikroskopi. Bu hücreler, micropost dizinin geri kalanı için micropost uçları sadece yapışma teşvik eder ve bu ikili kaplama kabul gibi olduğu tespit edilmiştir. Bir diğer faktör, 0.2 um olduğu gösterilmiştir micropost tadını konumsal hatanın ortaya çıkmıştır. Birlikte 2.8 nN / um verilen yay sabiti ile bu 0.6 nN kuvvet okuma-out bir hata yol açar. Micropost deneyleri için başka bir sıkıntı çok hücre tarafından paylaşılan microposts uygulanan kuvvetler tespit edilemez olduğu gerçeğinden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle, sadece izole edilmiş tek hücreleri analiz edilebilir. Sunulan protokol için özel bir sınırlama güvenilir sonuçlar elde etmek için kullanıcıya eğitim belirli bir miktar gerektirir hassas kontur yaklaşımının doğru uygulama, türemiştir. Micropost Dizi, bir yatay ya da gözlem alanında kenarı boyunca dikey bir çizgi oluşturacak şekilde hizalanmış bir vaziyette bulunur Ayrıca, daha hızlı bir analiz için kullanıcının görüntü almalıdır. Despite altıgen bir ızgara geometri içindeki microposts bulmak için bir yazılım algoritması fazla 5 ° eksen dışı bir dönme açısı ile microposts görüntülenmesine sınırlı olmadığı tam olmayan microposts, daha sonra yol içeren olmadan zor bir görüntü bölümü kırpmak hale aslında "Izgara Oluştur" fonksiyonu bir başarısız için. Böyle bir durumda kullanıcı micropost pozisyonları analiz başlamadan önce entegre döndürme işlevini kullanabilirsiniz.
Tarif edilen yöntem esas olarak iki kemik kanseri hücre çizgileri, HuO9 adlı bir parental hücre çizgisi ve M132 cinsinden türetilmiş yüksek düzeyde metastatik hattı karakterize etmek için uygulanmıştır. Bu kapsamda yüz altı üstü tek hücreli görüntüleri parlak bir alan modunda çekilen ve MechProfiler yazılımı kullanılarak analiz edildi. Sonraki veri madenciliği ebeveyn hücre hattı HuO9 biraz daha kuvvet uygular ve tipik metastatik hücre hattının M132 hücrelerin daha fazla hücre başına microposts kapsadığını ortaya koymuştur. Ancak hücrelermuhtemel sonuçların geniş katkıda tespitin anında, hücre döngüsünün farklı aşamalarında bu nedenle senkronize ve değil. 24 saat varan süreler boyunca canlı hücre görüntüleri alarak, başkalarının, formayı kesmek göç ve farklı hızlarda (ek videoları görmek) ile tekrar göç oysa yayıldıktan sonra birçok hücre onların ilk pozisyonda kalmasını bulunmuştur. Bu hücrenin mekanik profil genellikle sabit değildir ve bir hücre nüfusu üzerinde, hatta mevcut aktivitesine bağlı olarak tek bir hücre içinde büyük ölçüde değişebilir gösterir. Başka bir faktör hücre hücreleri düz yüzeylere yapışır ve dakika adımlarla geçirebilirsiniz klasik TFM, aksine başka micropost ulaşmak için ayrık göç adımları gerçekleştirmek için zorlanan bir micropost dizisinde bu olabilir. Ancak, bu küçük adımlar analiz etmek için çok ileri m erişimi gerektirir, fokal adezyon noktalarının floresan görüntüleri çekmek için gerekliicroscopes ve son derece ayrıntılı görüntü analiz yazılımı. Bununla birlikte, daha büyük nüfus içindeki mekanik profillerin dağılımı çoğu hala bir hücre hattının bir belirleyici özelliğidir. Bu nedenle hücrelerin geniş bir sayısı karakterize etmekte, yüksek verimli bir metot gereklidir. Burada sunulan manuel görüntüleme işlemi ve açık erişim yazılımı tam otomatik mikroskop sistemleri için ölçekleme için büyük bir potansiyel barındırır.
Özetle sağlam çekiş kuvvet mikroskopisi yaklaşımı standart bir cep biyoloji laboratuarında kolayca adoptable olduğu sunulmuştur. Görüntü analizi, hücre tohumlama işleminden itibaren tüm iş akışı, basit ve etkilidir. Burada anlatılan protokoller tamamen işlevsel olsa da, gelişmeler de canlı hücre görüntüleme görüntü dizilerinin analizi basitleştirmek dik düzenleri ve gelişmekte olan prosedürleri ile micropost dizileri idare edebilmek için analiz algoritmaları adapte devam etmektedir. Kemik kanseri hücre li sonuçları bağlamındanes, burada tarif edilmiş olan yaklaşımlar bu tür tahliller, kemik kanseri hastalarından biyopsi hücrelerin metastaz potansiyeli tahmin klinisyenlerin sağlayarak, prognostik değer tutabilir olup olmadığını tespit etmek için klinik biyopsilerinden ekran hücreleri kullanılabilir. Böyle bir deney tedavi stratejileri etkileyecektir. Diğer potansiyel uygulamalar, potansiyel olarak, ilacın etkinliğinin veya toksisitesinin tesis edilmesine yardımcı olarak, düz kas hücreleri ya da kardiyomiyositlerde gibi mekanik olarak aktif hücreler üzerinde test farmasötik olarak aktif bileşiklerle ilgilidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T25 cell culture flasks | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| Medium DMEM/F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 ml centrifuge vials | Sarstedt | 62.554.502 | |
| Micropost array pre-coated with Collagen I/Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1/FN | Micropost dimensions: Ø=6.4 µm, l=18.2 µm; grid=13 µm, kcorr=2.87 nN/µm |
| Ethanol abs p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12-well plate | Nunc | 150628 | |
| Formalin solution, neutral buffered 10% | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie blue |
| Methanol ACS p.A. | Merck | 1.06009 | |
| Acetic acid | Sigma | 695092 | |
| Glass bottom dish | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | 35 mm diameter, aperture 22 mm |
| T-100 Eclipse | Nikon | n/a | Inverted microscope |
| D3-L3 | Nikon | n/a | Camera controler |
| DS Fi2 | Nikon | Camera |
References
- Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
- Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
- Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
- Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
- Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
- Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
- Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
- Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
- Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
- Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
- Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311 (2007).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
- Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).
