Introduction
A型流感病毒（IAV）的条目是与病毒的受体对靶细胞1的质膜的结合将启动一个多步骤的过程。的受体IAV是唾液酸其存在于大量的各种糖蛋白和糖脂的。 IAV的血凝素（HA）蛋白质，其存在于病毒包膜结合唾液酸，从而介导附着病毒颗粒到靶细胞2的质膜。病毒进入经由网格蛋白介导的内吞作用的细胞，而且还可选条目途径，如巨吞，已经描述3-6。 HA与唾液酸之间的相互作用似乎是足够用于介导两个，附着并触发病毒颗粒7的内化。然而，替代的条目受体已经提出和它们在IAV条目角色目前正在研究1,8,9。
姜黄素rently，均努力确定涉及在病毒的生命周期，与显影急需新的抗病毒疗法10-12中的目的宿主因素。病毒进入将是针对IAV增长，以阻断病毒感染，在其最早的点了有利的一步。测量IAV进入不同阶段的实验是挑战，因为通常大量的病毒都需要检测发来的病毒。此外，检测范围的变化病毒内容只线性由于缺乏病毒复制。这强调了需要检测灵敏度高。
我们在这里介绍的测定法允许附加的病毒的检测在细胞表面以及检测内化病毒的有关细胞相关病毒的总量。使用生物素化的野生型病毒能够通过染色STV-Cy3和读出用流式细胞仪测量方便。生物素化病毒是冷结合到细胞s到允许附件，但阻止病毒颗粒的内化。可将细胞固定，透，并用STV-Cy3的测量附加的病毒。从细胞外，附着病毒体的信号可以如果一个封闭步骤是固定在其中的细胞与非标记的链霉（STV）之前应用废止。在下一步骤中，以下附着生物素化IAV的，温度被转移到37℃和病毒颗粒的内化被允许发生。内化颗粒免受STV结合从而使预算外和细胞内的病毒之间的歧视。
每个实验条件下，四个样品是必需的：“0分钟”：第一个样品，标记为“0分钟”，是在细胞表面以测量冷结合的病毒。 '0分钟+ STV'：第二样品，标为“0分钟+ STV'，给出了实验的基线信号强度。附加的病毒被阻止机智相比于“0分钟”样品H STV和信号下列染色STV-Cy3标记应该是低得多。 '30分钟'：第三样品，'30分钟'包含附着和内在病毒由于温度偏移至37℃30分钟。 '30分钟+ STV“：第四个样品，'30分钟+ STV”措施病毒的细胞内部分。在30分钟培养期之后将STV封闭步骤被应用。其结果是，在细胞表面的病毒颗粒通过STV绑定留下可用于与STV-Cy3的染色只内在病毒。内化病毒的相对量可被计算为内化的病毒（在'30分钟+ STV测定“样品）由病毒的总量（由'30分钟描述划分'样品）的比例。
作为对照，我们建议包括模拟感染的细胞。以下模拟感染的细胞的STV-Cy3的染色的信号给出了背景所得从染色方案。为IAV附件的控制是预处理细胞细菌神经氨酸酶（NA）的。 NA切割开来细胞糖蛋白的唾液酸，从而从细胞表面除去附着受体。叠氮化钠（SA）是一种强效的代谢抑制剂，并由此阻止细胞内吞作用13。用叠氮化钠处理的细胞应该是病毒结合阳性阴性用于内化。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
用活病毒工作时，利用层流罩和适当的生物防护：注意开始之前。在这里，我们描述了适用于文化的流感病毒株A / WSN / 33的生长条件。感染复数（MOI）和温育时间可以根据所用的病毒株而不同。
1.制备生物素标记的A / WSN / 33病毒
- 种子的Madin-Darby犬kindey（MDCK）细胞分化成使用Dulbecco氏改良的Eagle培养基（DMEM），补充有10％FBS和1％青霉素-链霉素（青霉素/链霉素）一个T175 cm 2的烧瓶中。培养细胞在37℃，直到大约70％融合为止。
- 感染前，去除培养基，并通过添加足够大的体积，以覆盖细胞单层洗涤细胞用磷酸盐缓冲盐水（PBS，pH7.0-7.3）。
- 删除PBS和感染细胞用A / WSN / 33与10 -4的MOI。稀释病毒的PBS辅以0.02毫克镁离子，0.01毫克钙</ SUP>，0.3％牛血清白蛋白（BSA）和1％青霉素/链霉素（感染-PBS）中。使用的4 ml的接种物用于T175 cm 2的烧瓶中。
- 孵育细胞1小时，在37℃。通过吸和吸量管10的10ml DMEM补充有0.3％BSA，20mM的HEPES和1％青霉素/链霉素到烧瓶中除去接种物。
- 孵育细胞，在37℃约3天，直至细胞病变效应（CPE）是可见的，然后收获上清液。 CPE可以被识别为上舍入细胞随后脱离和单元 14的死亡。
- 旋上清液在450×g离心5分钟，以去除细胞碎片。上清转移到一个新的猎鹰管和重复此步骤一次。丢弃粒料。
- 转移上清液入超速离心管和底层上清液用5毫升30％蔗糖的稀释在NTE缓冲液（10mM的Tris [pH为7.4]，100mM NaCl的，1mM EDTA）中。超速离心之前平衡管和填充用PBS达到30毫升结束卷。自旋supernatants在112398×g离心（对应于25000转的SW28转子）90分钟在超速离心机。
- 小心地吹打除去上清液，并在250微升PBS浸泡病毒颗粒一夜之间在4℃。悬浮颗粒吹打向上和向下。测量纯化病毒的Bradford试验15蛋白含量。
- 使用生物素化试剂盒来产生生物素化A / WSN / 33。遵循制造商的指令。
- 简言之，添加生物素的适量纯化病毒，并培育2小时在冰上。病毒转移到超速离心机管和填充管与PBS达到30毫升结束卷。旋病毒以112389×g离心在超速离心机90分钟。通过移液除去上清液，加入250微升PBS。颗粒浸泡过夜，在4℃。分装和存储保存在-80℃下的生物素化病毒在那里将是稳定至少24个月。
注意：这可能有助于确定生物素化的p的滴度IAV按标准斑块检测赔偿。但是，应该指出的是，随后的协议只会测量生物素化的病毒颗粒。其余unbiotinylated粒子由于不完全的生物素化将通过噬菌斑测定法，但不要在附接/内化测定法测量的信号向感染滴度。
2.确定生物素化的病毒将所需量
注：在被执行的连接/内化测定法中，以确定生物素化的病毒感染的样品的所有细胞所需的时间量是重要的。
- 培养，并根据制造商的说明trypsinize A549细胞。计数使用细胞室中的细胞。移液器200000 A549细胞成流式细胞仪深井管。旋3分钟，在450×g下。除去上清液，重悬沉淀用200微升PBS。凉爽的细胞在冰上进行10分钟。
- 制备bioti的5倍连续稀释nylated病毒股票感染PBS。
- 旋管含有细胞在4℃下3分钟，在450×g下。除去上清液，重悬沉淀用100微升含有病毒的感染PBS。由于模拟控制利用感染PBS没有生物素化病毒。冰上孵育管1小时。
- 旋管在4℃下3分钟，在450×g下。在200微升PBS弃上清，重悬沉淀。重复此步骤一次。
- 为固定，旋管在4℃下3分钟，在450×g下。在100微升3.7％多聚甲醛（PFA）的弃上清，重悬沉淀。下室温温育10分钟。然后，重复在2.4中描述的洗涤步骤）。
- 对于透化，旋管在4℃下3分钟，在450×g下。在100微升PBS弃上清，重悬沉淀含有0.5％的Triton X-100。孵育6分钟，在室温。然后，重复在2.4中描述的洗涤步骤）。
- 旋管在4℃下3分钟，在450×g下。除去上清，重悬佩尔等在50μl的2％BSA在PBS中稀释含有STV-Cy3标记。 （请注意，STV-Cy3标记的适当的浓度应在实验开始前测定开始用浓度为1：200和测试2倍稀释到1：2400。在我们手中，稀释为1：1,000证明是最佳的。）
- 孵育1小时在黑暗中在室温。然后，在2.4重复洗涤步骤描述，但重悬在200μl2％BSA在PBS中稀释的沉淀。
- 通过流式细胞仪16分析样品。门上的Cy3阳性人群。选择产生的Cy3阳性细胞在A549人口的最大数量的生物素化病毒的最低浓度。
3.确定链霉的所需量
注：阻断从细胞外病毒导出的信号的效率决定的测定法的检测范围。因此，废除将STV-Cy3的信号尽可能是重要的。钍Ë需要STV的所需量取决于所使用的生物素化的病毒原液（在第2测定）的量。
- 按照步骤2.1-2.4，但使用在第2测定病毒浓度。
- 制备STV的五倍连续稀释稀释在含有2％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS中。
- 旋管在4℃下3分钟，在450×g下。在50微升STV稀释除去上清液，重悬沉淀。由于模拟控制使用含有PBS 2％BSA和0.1％叠氮化钠无STV。孵育管在冰上30分钟。然后，在2.4重复洗涤步骤描述。
- 按照步骤2.5-2.9。用于内化测定法中，选择STV的最低浓度造成的Cy3信号（相对于样品在其中没有STV是本）的一个强烈的块。对于这一点，可以使用CY3阳性细胞或Cy3的信号的平均荧光强度的百分比。理想情况下，STV处理的样品的Cy3的信号应尽可能靠近将信号从模拟感染细胞成为可能。
4.安装/国际化分析
注：确保在开始试验之前，准备好所有的试剂。对于在结果部分（模拟感染的细胞，神经氨酸苷酶预先处理的细胞和叠氮化钠处理的细胞）呈现三个对照组小改建为协议是必需的。
- 准备每片含20万的A549细胞16深井管。旁边的实验装置包括4个管中，有3个控制的条件下，每个都需要4个试管：假感染的细胞，神经氨酸酶（NA）-pretreated细胞和叠氮化钠处理的细胞。每个组由4个管标记为“0分钟”，“0分钟+ STV'，'30分钟'，'30分钟+ STV'。
- 旋管在4℃下3分钟，在450×g下。在200微升PBS弃上清，重悬沉淀。
- 旋管在4℃以450×g的。除去上清，重悬佩尔等在200含有0.3％BSA的20mM HEPES和1％青霉素 - 链霉素（孵育培养基）的DMEM微升。育30分钟，在37℃。
注：对于神经氨酸苷酶控制：使用细菌的神经氨酸酶（ 如唾液酸酶来自霍乱弧菌），在200亩/ ml的浓度稀释在孵化培养基悬浮细胞。 - 旋管在4℃下3分钟，在450×g下。在200微升PBS弃上清，重悬沉淀。 10分钟在冰上向下重复此步骤一次，然后冷却试管。
- 旋管在4℃下3分钟，在450×g下。除去上清液，重悬沉淀在100μl生物素化病毒（使用在第2稀释感染PBS确定的病毒浓度）。孵育1小时在冰上。然后，在2.4重复洗涤步骤描述。
注：对于模拟感染控制：使用感染PBS没有病毒。为叠氮化钠控制：使用病毒稀释在感染-PBS中补充有0.1％的叠氮化钠。 - 临cessing在冰上感染后的样品的：
- 对于“0分”样本，按照步骤2.5和存储样品在4°C，直到其他样品是固定的。
- 为'0分钟+ STV的样品，旋管在4℃下3分钟，在450×g下。除去上清，重悬沉淀于50μlSTV（使用第3节中所确定的浓度）稀释在含有2％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS（以防止内在化，同时处理的样品）。冰上孵育30分钟。按照步骤2.4-2.5和存储样品在4℃。
- 为'30分钟'的样品，旋管在4℃下3分钟，在450×g下。在200微升含有2％BSA的PBS弃上清，重悬沉淀。孵育30分钟，在37℃。按照步骤2.4-2.5和存储样品在4℃。
注：对于叠氮化钠控制：使用PBS补充有2％BSA和0.1％叠氮化钠的30分钟温育在37℃。 - 为'30分钟+ STV的样品旋管在4℃下3分钟，在450×g下。在200微升含有2％BSA的PBS弃上清，重悬沉淀。孵育30分钟，在37℃。然后，旋管在4℃下3分钟，在450×g下。除去上清，重悬沉淀于50μlSTV（使用第3节中所确定的浓度）稀释在含有2％BSA和0.1％叠氮化钠的PBS（以防止内在化，同时处理的样品）。冰上孵育30分钟。按照步骤2.4-2.5和存储样品在4℃。
注：对于叠氮化钠控制：使用PBS补充有2％BSA和0.1％叠氮化钠的30分钟温育在37℃。
- 按照步骤2.6-2.8，并用流式细胞仪分析样品。确定的Cy3阳性细胞的每一个样品中的百分比。
- 计算附着百分比病毒和内病毒的相对量。
- 要计算附加的病毒的量，使用的Cy3 POSITI的百分比已经门控细胞或Cy3的信号的平均荧光强度。为了比较，设置未处理的细胞为100％（图4B）。
注意：附加的病毒的百分比是由“0分钟”示例说明。 - 为了计算内化的病毒数量，采取的“30分钟+ STV”样本的比例的“30分钟”样品（图5B）。
注意：正如上面提到的，可以使用的Cy3阳性门控细胞或Cy3的信号的平均荧光强度的百分比。
- 要计算附加的病毒的量，使用的Cy3 POSITI的百分比已经门控细胞或Cy3的信号的平均荧光强度。为了比较，设置未处理的细胞为100％（图4B）。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
甲卡通描述四个不同的实验条件下显示在图1代表性实验的结果在图2给出- 。5。在“0分钟”样品，生物素化的病毒是冷结合到靶细胞可以通过STV-Cy3的染色进行可视化（图1和2）。时（在“0分钟+ STV”样品）一个封闭步骤被应用，病毒在细胞表面不能再由STV-Cy3的染色检测。其结果是，在“0分钟+ STV”样品的信号强度被大大减少相比，“0分钟”样品（图1和2）。在将温度升高至37℃，附加的病毒被吸收到细胞中（“30分钟”样品）。内化的病毒是不阻断与未标记STV这导致了较少急剧下降的信号强度中的＆＃敏感8220;在其中没有STV阻挡施加30分钟+ STV“样本相对于”30分钟“的样品（图1和2）。
作为对照，我们使用的模拟感染，NA处理和SA处理。 图3显示的Cy3阳性细胞的百分比在第4所述模拟感染的细胞得到的背景信号强度进行实验和作为阴性对照的所有实验条件病毒附着（图4）。另外一个控制病毒附着与细菌表达的NA治疗。 NA去除唾液酸，受体为IAV附着，从细胞表面上的糖蛋白，从而减少了病毒的结合到靶细胞17。 如图4，用 NA处理强烈相比，未经处理的细胞大约90％废除IAV附件。至于内部，我们用SA作为对照。 SA TR eatment迅速耗尽细胞内ATP水平，从而抑制能源消耗过程，如细 胞内吞作用13。细胞的SA的过程中和病毒颗粒的感染抑制内化后孵育。内化的病毒（图5中示出）的相对量是从约10％提高到45％，通过在37℃下，在未经处理的细胞30分钟。然而以下水杨酸处理，相对内化病毒的百分率是这两个15％左右，将细胞孵育0和30分钟，在37℃。这表明的确，SA降低有效摄取病毒颗粒进入细胞。
图1原理测定的。卡通说明附接/内化测定法的原理。=“_空白”>点击此处查看该图的放大版本。
图2.代表结果IAV附着和国际化。（A）直方图显示Cy3的信号未处理细胞的信号强度。显示的是“0分”，“0分+ STV”，“30分钟”和“30分钟+ STV”样本。 （ 二）从A Cy3的阳性细胞的百分比，请点击此处查看该图的放大版本。
图为附件和内在包括控制代表性的结果。 荣>的Cy3阳性A549细胞的下列指示处理百分比。显示的是模拟感染，及时治疗，NA处理和SA处理的细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
图由神经氨酸酶抑制4.病毒的附件。 （ 一）直方图显示的“0分”样本Cy3的信号强度。显示是未处理的细胞（蓝色）和两个对照样品：模拟感染和NA处理的细胞（在红色和橙色，分别）。从A的Cy3阳性细胞所示的（B）的百分比是模拟，未处理的和从“0分钟”样品NA处理的细胞。对于未经处理的细胞的值设定为100％。COM /文件/ ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图5.抑制病毒的内化通过叠氮化钠（SA）的（A）的直方图表示的“30分钟”的Cy3的信号强度和“30分钟+ STV”从未经处理的样品（在红色和橙色，分别）和SA-处理过的（在蓝色和绿色分别）细胞。 （B）后的0和30分钟的未处理和SA处理的细胞相对内在病毒的比例。 请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
我们的协议描述测量病毒的附件和内在化流式细胞仪的一种简单的方法。它允许使用标记的野生型病毒其模拟更加紧密病毒感染相比，使用的病毒样颗粒（VLP）组成。尽管我们的协议进行了优化，以测量附件IAV和内在它可以很容易地适用于其他病毒。此外，如流式细胞术，用于读出，共染色可以很容易地添加到协议如以下击倒的目的蛋白质或过表达来测试表达水平。因此，该测定允许根据个体需要的协议的修改。值得注意的是，该测定也可以用于一系列时间点来测量病毒内化随时间，将获得的动力学信息而执行。这可能是特别重要的，如果在测定要适于不同的病毒具有未知的内化动力学。
豪版本，应该指出的是，检测的窗口是相对小的发生上的线性标尺的附件或内化的差异，由于缺乏病毒复制。要增强信心，减少我们建议，包括控制噪声（ 如控制上述）和几个重复。而示出的结果描绘一个代表性实验中，我们观察到在不同的实验一致性好：例如，为了进行固定，Cy3的阳性细胞的百分比从60-80％不等;对于内化病毒，我们获得的值40-60％之间不等。
前测定开始时，滴定使用的试剂如STV，STV-Cy3和生物素化的病毒的量的工作浓度是重要的。请注意，试剂和孵育时间的量可以根据所使用的细胞系和病毒株而不同。为了最大限度地提高检测的窗口，细胞的阳性病毒依恋百分比吨应尽可能的高，在“0分钟，”30分钟“样品（取决于使用的生物素化病毒的量），并尽可能低的”0分钟+ STV“样品（取决于STV的使用量）。此外，噪声可以通过离心分离期间保持所述细胞在4℃下，并通过与冰冷的PBS洗涤降低。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
这项工作是由瑞士国家科学基金会（31003A_135278）海面温度的赠款支持。 MOP是一个博士生津贴从安盛研究基金的受益人。我们感谢帕特里夏·尼格的帮助， 图1的设计。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
