Abstract
הבידול של spermatids העכבר הוא תהליך קריטי אחד לייצור תא מין זכרי פונקציונלי עם הגנום שלם כדי להיות מועבר לדור הבא. עד כה, מחקרים מולקולריים של מעבר מורפולוגיים זה כבר הקשו על ידי חוסר שיטה המאפשרת הפרדה נאותה של צעדים החשובים אלה של בידול spermatid לניתוחים שלאחר מכן. הניסיונות קודמים בgating התקין של תאים אלה באמצעות cytometry זרימה ייתכן שהיו קשים בגלל עלייה מוזרה בקרינת ה- DNA בspermatids עובר שיפוץ הכרומטין. המבוססים על התבוננות זו, אנו מספקים פרטים של זרימה פשוטה cytometry תכנית, המאפשרים טיהור שחזור של ארבע אוכלוסיות של spermatids עכבר קבוע עם אתנול, המייצג כל מדינה אחרת בתהליך שיפוץ הגרעיני. העשרת אוכלוסייה אישרה באמצעות סמני צעד ספציפי וקריטריונים מורפולוגיים. Spermatids המטוהר יכול לשמש להגנומי וproteomIC ניתוחים.
Protocol
טיפול בבעלי חיים היה בהתאם לועדת טיפול בבעלי החיים ושימוש Université de שרברוק.
1. Tube הכנה
- היום לפני מיון תא, להוסיף 1-2 מיליליטר של סרום שור עוברי חום מומת (FBS) עד 5 צינורות עגולים תחתון מיליליטר פוליפרופילן, ועד 15 מיליליטר ו -50 מיליליטר צינורות חרוטי פוליפרופילן.
צעד קריטי: ודא שכל צינור המשמש בפרוטוקול הוא מצופה.
הערה: ציפוי FBS מונע בתאי נבט מלהידבק לקירות צינור. - לאט לאט לערבב O / N על ידי היפוך על 4 מעלות צלזיוס למעייל הצינורות אחידות באמצעות הכתף.
- למחרת, להסיר FBS מצינורות מצופים באמצעות אחסון.
- * צעד קריטי: ודא שצינורות עגולים תחתון פוליפרופילן 5 מיליליטר ו -15 ו -50 מיליליטר הצינורות המשמשים להכנת תא (פרוטוקול הצעדים 2.1-2.11) הם רוקנו לחלוטין של FBS למנוע פנינג (כלומר, סטייה מדויקת של הזרמים בצד). להשתמש pipet P200 להסיר FBS.
- השאר נפח שייר קטן של FBS (על 100-200 μl) בפוליפרופילן 5 מיליליטר עגול צינורות תחתון המשמשים לאיסוף תאים מטוהרים.
- * צעד קריטי: ודא שצינורות עגולים תחתון פוליפרופילן 5 מיליליטר ו -15 ו -50 מיליליטר הצינורות המשמשים להכנת תא (פרוטוקול הצעדים 2.1-2.11) הם רוקנו לחלוטין של FBS למנוע פנינג (כלומר, סטייה מדויקת של הזרמים בצד). להשתמש pipet P200 להסיר FBS.
2. תא הכנה
- להקריב עכבר אחד גברים בהרדמה באמצעות O 2 / isoflurane (אינדוקציה 5% ולאחר מכן שמרו על 2%) ואחריו CO 2 מחנק.
- בלו וdecapsulate שני האשכים ובררו עם מספריים קטנים ב500 μl מיון חיץ לתוך צינור 1.5 מיליליטר.
- תאי נבט סומק מtubules seminiferous ידי pipetting למעלה ולמטה העדין בצינור 1.5 מיליליטר, ראשון עם טיפ μl קטוע 100-1,000, ולאחר מכן עם קצה 100-1,000 μl שלם.
- להסיר שאריות וגושים אחרים צעד סינון אחד באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר ולאסוף תסנין לתוך קודם צינור חרוטי 50 מיליליטרiously מצופה FBS בשלב 1.
- שטוף את המסנן פעם אחת עם המיון עד נפח כולל של 3 מיליליטר ותסנין העברה לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר המצופה בעבר בשלב 1 חיץ.
- להוסיף 16 μl של 50 מ"מ EDTA pH 8 למיליליטר של השעיה תא (48 μl ל3 מיליליטר) כדי להשיג ריכוז סופי של 0.8 מ"מ EDTA.
- כדי לתקן תאי נבט, לאט להוסיף 3 כרכים של אתנול 100% קרים כקרח באמצעות pipet 10 מיליליטר עם תסיסה עדינה (מערבולת במהירות נמוכה), אשר יפיק השעיה חלבית.
צעד קריטי: הוספת אתנול לאט לאט הוא חיוני וחשוב לשמירה על שלמות תא ההכנה. אנחנו ציינו כי בנוסף מהירים של אתנול גורם תמוגה תא וכתוצאה מכך לירידה גדולה של מיון יעילות. להשעית תא 3 מיליליטר, 9 מיליליטר של אתנול יש להוסיף בכ 1 דק '. - דגירה תאים על קרח למשך 15 דקות עם ערבוב מדי פעם על ידי היפוך.
- ההשעיה צנטריפוגה התא ב 800 XG במשך 5 דקות ולהסיר ברורsupernatant.
- בעדינות resuspend תאי נבט הקבוע ב 2 מיליליטר של חיץ מיון.
- הוסף 4 μl של צבע SYTO16 DNA (פתרון 1 מ"מ בDMSO) ודגירה של לפחות 30 דקות (מוגנות מפני אור).
הערה: תוצאות המיון הטובות ביותר מתקבלות באמצעות SYTO16 שכן הוא צבע DNA חדיר שמשולב בקלות לתוך הגרעינים דחוסים מאוד של spermatids.
סדרן 3. תא הגדרה
הערה: הנה, 4-לייזר (ננומטר 405 - סגולה, 488 ננומטר - הכחול, 561 ננומטר - ננומטר צהוב-ירוק, 633 - אדום) 20-פרמטר סדרן תא BDFACSAria III משמש. תוכנת BD FACSDiva 6.1.3 משמשת כדי לחזות ולנתח את הנתונים. ההגדרות עשויות להשתנות בהתאם לסוג של סדרן בשימוש.
- לעקר את סדרן FACS ידי הפעלת 70% אתנול כנוזל נדן במהלך הליך כיבוי fluidics (תפריט "Cytometer" בתוכנה) לפני המיון. בחר "Cytometer" בסרגל הכלים של התוכנה ולבחור "sh fluidicutdown ". בצע את השלבים שהוזכרו על ידי התהליכים.
- הכן ולסנן 1x PBS עם מסנן 0.22 מיקרומטר כדי לחסל את כל גבישים ומזהמים. מלא את מיכל הנדן לקו הריתוך העליון בצד הפנימי של הטנק.
- הפעל את התוכנה ולהתחבר. התחל סדרן FACS להתחמם הלייזרים לפחות 30 דקות לפני המיון. להפעיל שני תהליכי הפעלת fluidic כדי לשטוף את אתנול מfluidics. בחר "Cytometer" בסרגל הכלים של התוכנה ובחר "הפעלת fluidic". בצע את השלבים שהוזכרו על ידי התהליכים.
הערה: זו משחזרת fluidics עם נוזל נדן רגיל (1x PBS). - נקה את בלוק המיון וצלחות סטייה במים מזוקקים ומייבש אותם ביסודיות. Sonicate זרבובית 100 מיקרומטר להציב צינור של מים מזוקקים למשך 2 דקות באמבט sonication. נגב את הזרבובית ביסודיות.
- הכנס את זרבובית 100 מיקרומטר לתוך תא הזרימה ולהפוך את כיוון השעון ידית נעילה-חרירים ל -12עמדת שעות. הגדר את לחץ הנדן עד 20 psi.
- הפעל את הזרם ולהתאים את המשרעת להשיג ערכי יעד לתדר (כ -30), ירידה של 1 (כ -150) וגאפ (סביב 12) ולהקים דפוס breakoff אגל יציב (טיפות כמה לווין). כבה את הנחתה.
- ודא שהזרם ישר ופוגע במרכז aspirator הפסולת על ידי שינוי הזווית של בלוק הסוג. הערה: זרבובית 130 מיקרומטר ב 10 psi גם נבדקה ולא נמצאים הבדל ברור נמצא.
- עיכוב הגדר לייזר ל0 ל-77.39 הכחולים, לאדומים, 37.33 לסגולים ו-39.85 ללייזרים צהובים-ירוקים.
- אזורי סט קנה מידה ל1.14 ל1.0 הכחול, לאדום, 0.75 לסגול ו0.96 ללייזרים צהובים-ירוקים.
- באמצעות מיון מבחן (בחלון "צד הזרם" של התוכנה), לוודא שזרמי הצד אינם מלבים. בחלון "צד הזרם", להתאים את מחווני המתח של כל זרם בצד, כך שהם פגעו בmiddlדואר של צינור איסוף מבחן. אם זרם המרכז הוא לא חזק, להתאים את nd 2, 3 rd, ו -4 הגדרות ירידה ה כדי להגביל את הזרם המרכזי.
- התחל התקנת Cytometer ויישום המעקב (CS & T) בתוכנה (תפריט "Cytometer").
- השתמש בחרוזי ההתקנה ומעקב cytometer בירידה של 1 לμl 350 כדי להפוך את האפיון והמעקב של ביצועי cytometer באמצעות הוראות יצרן.
- צא יישום CS & T. להחיל הגדרת CS & T, לוודא הפרמטרים הזרם עדיין לאפשר דפוס breakoff אגל יציב, ולהפעיל את כפתור ספוט המתוק כמתואר בהוראות יצרן (ב" חלון Breakoff ").
- לייעל את הערך זרוק העיכוב באמצעות חרוזי ניאון (ראה טבלה של חומרים).
- התקן את צינורות האיסוף בבעל. פתח את הדלת לחסום סוג. בחלון "צד הזרם", להפעיל מתח ולאחר מכן בחר "סוג מבחן "ולחץ על לחצן aspirator המגירה כדי לפתוח את המגירה ויש להם גישה לצינורות האיסוף.
- לייעל את זרמי הצד ולכן הם הולכים למרכז של הצינור. התאם ערכים ומחוונים בהתאם לצורך.
- סגור את הדלת לחסום סוג ולוודא להתאים את חיוג מיקרומטר להשיג נקודת חרוז הבהירה במרכז. מגירה בטל פסולת, סוג מבחן ומתח. הסר את צינורות האוסף.
- לייעל את עיכוב הירידה בהתאם להוראות יצרנים.
- בקצרה, לנער בקבוקון חרוז במרץ ולדלל 1 טיפה של חרוזים ב 0.5 מיליליטר של PBS.
- שימוש בהוראות יצרנים, להגדיר את עיכוב הירידה באמצעות תבנית ניסוי טיפת העיכוב זמינה בתוכנה. לחלופין, השתמש בתכונת Auto גלילת העיכוב להגדיר את עיכוב הירידה.
- טען את השפופרת של חרוזי ניאון ולהתאים את קצב הזרימה עד שיעור הסף הוא ~ 3,000 ל- 4,000 אירועים / שני. הגדר את דיוק סוג ל" ראשוני "ואחרוןly ל" מנגינת פיין "בחלון" פריסת מיין ". בחר את המסנן האופטי ולמיין חרוזים. התאם את העיכוב בגלילה עד ~ 100% מסודרים משמאל.
הערה: שלב זה הוא קריטי כדי לוודא שתאים מסוג הריבית לזרם צד. חרוזים והמסנן האופטי המשמשים להשגה קרובה לסטייה טיפת 100%.
- הנח ND מסנן FSC 1.5 (צפיפות ניטראלית) בקצה השמאלי של בלוק גלאי FSC. הגדר את הארכת החלון עד 2.00 מייקרו-שני ואת קנה המידה פינת FSC ל1.00 (בכרטיסייה "הלייזר" בחלון "Cytometer").
- לפני טעינת צינור מדגם, מקום בשורת מסנן מדגם של 50 מיקרומטר בסוף קו המדגם, כדי למנוע בצעדים כבדים. כדי לעשות זאת, בחר באפשרות "שנה סינון לדוגמא" בתפריט "Cytometer".
- בדוק את הרכב נוזל המדגם כדי להשיג הפרדה טובה בלי ללבות בין זרם צד ולמנוע את התאים יידבקו לpolypropyleצינורות ne.
- טען את צינור המדגם, להדליק את צלחות הסטייה ובחר "סוג המבחן" עם המגירה סגורה. תראה זרמי צד אם הפרדה מתרחשת בלי יותר מדי פנינג.
הערה: פנינג הוא כנראה עקב ריכוז גבוה של חלבון במאגר המדגם.
- טען את צינור המדגם, להדליק את צלחות הסטייה ובחר "סוג המבחן" עם המגירה סגורה. תראה זרמי צד אם הפרדה מתרחשת בלי יותר מדי פנינג.
- טען את צינור המדגם לתוך מכשיר FACS. בחר תסיסה מדגם של 300 סל"ד וטמפרטורת מדגם של 4 מעלות צלזיוס. בחר "רוכשת את הנתונים" ב" רכישת לוח המחוונים ".
- במידת צורך, לדלל את המדגם כדי להשיג קצב אירוע מתאים למקסימום של 5,000 אירועים / שניות (בקצב זרימה מקסימאלי של 3.0). בהחלט מכבד את הגבולות האלה כדי לשמור על טוהר התאים הממוינים.
- כדי לנתח ולמיין את התאים, לייעל את ערך סף FSC לחסל פסולת בלי להתערב עם האוכלוסייה של עניין. בסולם לוגריתמים, להתאים את המתח של גלאי צינור צילום מכפיל (PMT) עם מסנן 530/30 על מנת להפוך אתבטוח שאות הקרינה מכלל האוכלוסייה מתאימה בקנה המידה, ושער על האוכלוסייה החיובית (איור 1, שער 1).
- לייצר קדימה פיזור-אזור / פיזור-שטח צד (FSC-) עלילה (SSC-) של האוכלוסייה החיובית SYTO16 ולהתאים את FSC-לכ 110 V בקנה המידה ליניארי, וSSC-לכ -150 V בקנה מידת לוגריתמים כדי להמחיש את כל האירועים תוך נטרול תאים מאוד גדולים ואגרגטים תא.
- ב" מיין פריסה "החלון, להגדיר את" מיין Precision מצב "ל" טוהר 4-דרך" (מסכת תשואה: 0, מסכה טוהר: 32 מסכה שלב,: 0). בחר באפשרות "רציף" מתפריט "אירועי יעד" למיון רציף.
- להוסיף אוכלוסיות למיין בתחום המתאים לצינורות (ב" מיין פריסה "החלון). אוכלוסיות מקום עם תדרים גבוהים יותר באמצע ואלה עם תדרים נמוכים בקצוות. הגדר את צלחות המתח עד 2500 V. במיון, לשמור t אוסף המדגםubes על קרח.
4. מיון תא
- מייד לפני המיון, תאי סינון באמצעות מסנן 50 מיקרומטר פוליפרופילן 5 מיליליטר מצופה בעבר סיבוב צינור תחתון.
- שטוף את המסנן בהרחבה עם 1-2 מיליליטר של חיץ מיון.
- תאי נבט מיין קבועים באמצעות סדרן תא 488 ננומטר מצויד לייזר הבא תכנית gating המפורטת באיור 1. לאסוף את השברים מטוהרים בצינורות עגולים תחתון 5 מיליליטר פוליפרופילן המצופה בעבר בסעיף 1 על קרח.
- ודא ש100-200 μl של FBS נשמר בצינורות האיסוף, כדי למנוע הידבקות של התאים הממוינים לקיר הצינור.
- ודא כי ריכוז SYTO16 הוא להרוות כדי למנוע תנודות הקרינה במהלך תקופת המיון. SYTO16 הוא להרוות כאשר אין וריאציה נוספת של עוצמת מכתים תא ב488 פרמטר (מכתים DNA) אלקסה פלואוריד בגרפיקה המיון. במידת צורך, להוסיף 1 μl שלSYTO16 לצינור המיון להגיע לרוויה.
- הצג את האירועים הכולל על גרפי המציג את הפרמטרים הבאים: מספר האירועים לעומת אלקסה פלואוריד 488-A.
- בחר את תאי צביעת DNA החיוביים עם שער 1, כפי שמוצג באיור 1.
- תאי תצוגה מהשער 1 בגרפי באמצעות SSC-לעומת FSC-כפרמטרים
- בחר את התאים עם שער 2, כהראה באיור 1.
- תאי תצוגה משער 2 בגרפי באמצעות FSC-vs אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
- בחר תאים עם שער 5 ושער 6 בשער 2 גרפיים, כהראה באיור 1.
- להציג בנפרד שער 5 ושער 6 בגרפיקה באמצעות אלקסה פלואוריד 488-W לעומת אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
- spermiogenesis בחר צעדים 1-9 spermatids על גרפי שער 5 וspermiogenesis צעדים 10-12 spermatids על גרפיקת 6 השער, כפי שהראה באיור 1.
- לְהַצִיגתאים מהשער 1 בגרפי באמצעות FSC-vs אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים
- בחר תאים עם שער 3 ושער 4, כהראה באיור 1.
- להציג בנפרד שער 3 ושער 4 בגרפיקה באמצעות אלקסה פלואוריד 488-W לעומת אלקסה פלואוריד 488-כפרמטרים.
- spermiogenesis בחר צעדים 13-14 spermatids על גרפי שער 3 וspermiogenesis צעדים 15-16 spermatids על גרפי שער 4, כהראה באיור 1.
- תאי תצוגה מהשער 1 בגרפי באמצעות SSC-לעומת FSC-כפרמטרים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
אסטרטגית gating שימוש עם cytometry הזרימה
איור 1 מייצג את אסטרטגית gating המשמשת בcytometry הזרימה למיין ארבע אוכלוסיות spermatid טהורות ביותר. בקצרה, תאים עם מכתים DNA חיובי (אלקסה פלואוריד 488-A) נבחר ראשון עם שער 1. Spermatids מspermiogenesis מרתיע 1-12 נבחרים (שער 2) על מגרש נקודה מראה granulosity (SSC-) לעומת גודל (FSC -A) מהשער 1. אז, spermatids מspermiogenesis צעדים 1-9 וspermiogenesis צעדים 10-12 ניתן להפריד אחד מהשני על פי הווריאציה של עוצמת מכתים DNA (גייטס 5 ו -6). Spermatids מspermiogenesis צעדים 13-14 ו15-16 נבחר ישירות מהתאים מוכתמים חיובי על גודל עלילת נקודה מראה (FSC-A) לעומת צביעת DNA (אלקסה פלואוריד 488-A) (גייטס 3 ו -4). כל האוכלוסיות מסודרים הם הגדירו מחדש עם אלקסה פלואוריד 488-W לעומת כתמי 488-נקודת אלקסה פלואוריד כדי להגדיל טוהר IR.
אימות של תכנית הטיהור על ידי מיקרוסקופ epifluorescence
איור 2 מייצג מכתים DAPI של אוכלוסיות המיון של spermatids ידי cytometry זרימה. Spermiogenesis צעדים 1-9 spermatids להציג את הגרעין העגול בצורה האופיינית לspermatids העגול וגרעין בצורה סגלגלה של צעד spermiogenesis 9 spermatids. Spermiogenesis צעדים 10-12 spermatids להראות גרעין מתארך בצורת וו גדול. Spermiogenesis צעדים יש 13-14 ו15-16 spermatids גרעין בצורה דומה, אך שונה במקצת בעוצמת כתמי DNA, שאיפשר מיונם. צעדי הבידול וטוהר של אוכלוסיות מיון השונות גם הובררו באמצעות סמנים ביולוגיים ספציפיים, כמתואר במחקר קודם 9. טוהר של אוכלוסיות spermatid מיון מתואר בטבלה 1.
אוהל "FO: לשמור-together.within עמודים =" 1 ">
איור 1. אסטרטגית gating מפורטת כדי למיין אוכלוסיות spermatid ultrapure. ייצוג סכמטי של אסטרטגית gating משמשת כדי למיין spermiogenesis צעדים 1-9 spermatids, על שלבים 10-12 spermatids, על שלבים 13-14 spermatids וצעדי 14-16 spermatids בו זמנית עם ננומטר 488 מצויד לייזר סדרן תא. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
spermatids הממוין איור 2. ויזואליזציה של spermatids מסודר על ידי epifluorescence. הם cytospined בשקופיות מיקרוסקופ, מוכתם עם DAPI ודמיין באמצעות מיקרוסקופ epifluorescence עם המסננים המתאימים לDAPI ומצויד בCA CCDMera. תאים מוצגים בקנה מידה אפורה הפוכה. בר = 20 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
| סוג התא שנצפה ברוב | טוֹהַר | מספר משוער של תאים (8 מיון HR) | מזהמים | |
| אוכלוסיית 1 | צעדים 1-9 spermatids | 99-100% | 4,000,000 | שלב 10 spermatids |
| אוכלוסייה 2 | צעדים 10-12 spermatids | 95-98% | 1,000,000 | Spermatocytes |
| Population 3 | צעדים 13-14 spermatids | 99-100% | 800,000 | Spermatocytes, על השלבים 1-9 spermatids |
| אוכלוסייה 4 | צעדים 15-16 spermatids | 98-100% | 1,500,000 | Spermatocytes |
אוכלוסיות ממוין spermatid והמזהמים שלהם: טבלה 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
תאי זרע ראשוניים תמיד היו מאתגרים ללמוד בהתחשב במורכבות של אפיתל seminiferous, כמו גם ההצלחה המוגבלת של תרבות במבחנה. במהלך השנים, גישות רבות כדי לטהר תאי נבט ממינים שונים פותחו. טכניקות שקיעה באמצעות טיהור הכבידה עם Percoll או הדרגתיים אלבומין בסרום שור בדרך כלל מספקות תשואה טובה של תאים נבטי שלמים, אבל חוסר הגדרה ראויה בין כמה סוגי תאים כמו תאי tetraploid meiotic וspermatids 10. יתר על כן, טכניקות אלה דורשים מכשירים מיוחדים (לעתים קרובות תוצרת בית), שעשויה לא להיות זמין למעבדות רבות, אשר הופכת אותם קשים לשחזר בלי ניסוי וטעייה מסורבלים. שיטות אלה הן גם זמן רב, רגיש מאוד לתנודות ונוחות כמנגנון בדרך כלל שמר על 4 מעלות צלזיוס כדי לשמור על כדאיות תא. כאשר מוצלח, שיטות שקיעה עם זאת לספק כמה מיליון ג החי המטוהראמות לאוכלוסייה. עם זאת, רמת העשרה הנמוכה תא שניתן להשיג הוא החסרון העיקרי של שיטות אלו כפי שרק לעתים רחוקות מגיעים טוהר יותר מ 80-90%. במקרים מסוימים, זיהום של 10-20% מסוגי תאים אחרים הוא הווה כאשר נמדדו על ידי ה- DNA, RNA או חלבון תוכן, המייצג את המכשול עיקרי לניתוחים מולקולריים.
כאשר מבקש לשפר את טוהר של אוכלוסיות תאים, חלק מהחוקרים בשילוב שקיעת כובד לשיטות אחרות. אחת הגישות יעילות ביותר הוא להשתמש בעכברים בוגרים להגביל את המספר של אוכלוסיות תאים שונות המייצגות שלבים מאוחר יותר. אפשר לנצל את הגל הראשון של יצירת תאי זרע ולקבל הכנת תא המכילה תאים נבטי עד שלב התמיינות נתון המבוסס על המראה הרציף לאחר לידה. עם זאת, גישה משולבת זו דורשת יותר חיות כדי לפצות על הכמות המוגבלת של חומר מוצא ועדיין לא פותרת את חוסר definition של שיטות שקיעה. בנוסף, גישה זו לא יכולה להיות כמעט הגישה בקשה לסוגי תאים אחר כך כגון spermatids, אבל משמשת בעיקר לspermatogonia וspermatocyte העיקרי. יתר על כן, יש כמה עדויות לכך שהגל הראשון של יצירת תאי זרע עלול נמל תאים בעלי תכונות שונות מעט מזה של האפיתל הרכיבה על אופניים של עכברים בוגרים 11,12.
סנכרון ויטמין יצירת תאי הזרע שימש גם כדי לשפר את טיהור תא נבטי כנוהל זה מצמצם את מספר השלבים הנוכחיים באשכים של בעלי חיים שטופלו. עם זאת, הליך זה היה בעיקר משמש לסנכרון יצירת תאי זרע בחולדות, בהצלחה מסוימת דיווחה בעכברי 13,14. מהניסיון שלנו, ויטמין סנכרון בעכברים הוא זמן רב, לעתים רחוקות נותן תוצאות לשחזור ומייצר תופעות לוואי מזיקות העלאת חשש היושרה הסלולרית של האפיתל seminiferous.
טיהורr קבוצות השתמשו בהצלחה cytometry זרימה לטהר תאי נבט מעכבר 15-18. עם זאת, אף אחד מהם דיווח טיהור של אוכלוסיות spermatid עבר צעדי spermatids העגולה. אסטרטגית gating שלנו מאפשרת לטהר ארבע אוכלוסיות תאי הפלואידים נקיות במיוחד מייצגות את שלבים בידול חשובים ניתנים למחקרים מולקולריים. המגבלה העיקרית של השיטה המתוארת במאמר זה עשויה להיות התשואה המוגבלת של תאים ממוינים. הרמה הגבוהה של טוהר מתקבלת במידה מסוימת על חשבון מספר התאים ממוינים. עם זאת, לוודא כי תנאי מיון הם אופטימליים, הוספנו כמה עצות קריטיות לפרוטוקול. כל עצות הטכניות אלה במטרה להגדיל או המספר או טוהר spermatids מסודרים. לדוגמא, השימוש בFBS מצופה צינורות במהלך מיון מאוד מפחית את האובדן של תאים שמקלים על הצינורות. כמו כן, ריכוז באמצעות להרוות של SYTO16 עוזר להפחית את הווריאציות של עוצמת מכתים DNA וכתוצאה מכך populat היציב יותריונים כפי שניתן לראות על מגרשי FACS ותשואה טובה יותר וטוהר spermatids ממוין על פני תקופה מיון 8 שעות. בנוסף, העצות טכניות הניתנות להגדרת סדרן FACS בהחלט לסייע להגביר את היעילות הכוללת של מיון על ידי הימנעות קבקבי תא או זיהום צולב באיסוף צינורות. לחלופין, ניתן להרחיב שערים כדי להגדיל את מספר התאים ממוינים, סופו של דבר וכתוצאה מכך ירידה קטנה בטוהר אוכלוסייה, שיכול להיות מקובל על חלק ממחקרים. יתר על כן, בתאי נבט קבוע אתנול מוכתם בSYTO16 הם יציבים מאוד על 4 מעלות צלזיוס וניתן למיין עבור שעות יותר מ -8 עם התאמות gating מוגבלות ופיקוח. סופו של דבר, יכולים להיות נקוו כמה ימי מיון לקבלת מספר מספיק של תאים לכל יישום.
spermatids זרימה מסודרים מתקבל כפי שמתואר כאן יכול לשמש למגוון רחב של ניסויים. ה- DNA מהתאים אלה יכולים בקלות להיות חילוץ באמצעות ערכות טיהור DNA הגנומי מסחריות והפגיןלהיות באיכות ראויה לPCR ניתוחים 9 ורצף הדור הבא (מידע לא מוצג). spermatids מסודרים יכול לשמש גם לחלבון מנתח 9 שבו ביצענו כמה immunoblots נגד סמנים בשלב מסוים כדי לאשר את טוהר הגבוה של spermatids מסודרים. אנו מאמתים את השלמות הסלולרית של spermatids המיון ומצאנו כי הגרעין והציטופלסמה של כל האוכלוסיות יישארו ללא שינוי. עם זאת, מצאנו שיעור של צעדים 13-14 spermatids וחלק קטן יותר מצעדים 15-16 spermatids שחסרות השוטון שלהם (מידע לא מוצג). לפיכך, אוכלוסיות תאי נבט טהורות ביותר מסודרים שימוש בגישה זו מתאימות לניתוח proteomic וגנומי, כמו גם יישומים אחרים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות לד"ר לאוניד וולקוב ואריק Bouchard לייעוץ הטכני שלהם בנוגע למיקרוסקופיה epifluorescence.
תמיכה כלכלית
ממומן על ידי המכון הקנדי לבריאות מחקר (מענק # MOP-93,781) לGB
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
