Abstract
La différenciation des spermatides de souris est un processus critique pour la production d'un gamète mâle fonctionnel avec un génome intact à être transmis à la génération suivante. Jusqu'à présent, les études moléculaires de cette transition morphologique ont été entravés par l'absence d'une méthode permettant une séparation adéquate de ces étapes importantes de la différenciation des spermatides pour des analyses ultérieures. Les tentatives précédentes pour bon déclenchement de ces cellules en utilisant la cytométrie de flux ont peut-être été difficile en raison d'une augmentation particulière de la fluorescence de l'ADN dans les spermatides subissant remodelage de la chromatine. Partant de ce constat, nous fournissons des détails d'un simple, cytométrie de flux système, permettant la purification reproductible de quatre populations de spermatides de souris fixes avec de l'éthanol, représentant chacun un état différent dans le processus de remodelage nucléaire. L'enrichissement de la population est confirmée en utilisant des marqueurs spécifiques étapes et critères morphologiques. Les spermatides purifiés peuvent être utilisés pour la génomique et de protéomiqueic analyse.
Protocol
Les soins des animaux était en conformité avec la protection des animaux et l'utilisation comité Université de Sherbrooke.
1. Préparation du tube
- Le jour avant le tri de cellules, ajouter 2.1 ml de sérum bovin foetal inactivé par la chaleur (FBS) à 5 ml polypropylene tubes à fond rond et à 15 ml et 50 ml polypropylene tubes coniques.
Étape critique: Veiller à ce que chaque tube utilisé dans le protocole est revêtu.
Remarque: Un revêtement FBS empêche les cellules germinales de coller aux parois du tube. - Mélangez lentement O / N par inversion à 4 ° C pour enduire en utilisant les tubes uniformément un rotateur.
- Le lendemain, retirez FBS de tubes revêtus par décantation.
- * Étape critique: Veiller à ce que les 5 ml polypropylène tubes à fond rond et les 15 et 50 ml tubes utilisés pour la préparation cellulaire (protocole étapes 02.01 à 02.11) sont complètement vidés de FBS pour empêcher Fanning (ie, la déviation imprécise des courants latéraux). Utilisez une pipette P200 pour enlever les FBS.
- Laisser un petit volume résiduel de FBS (environ 100-200 pi) dans la 5 ml polypropylène ronde des tubes inférieurs utilisés pour collecter les cellules purifiées.
- * Étape critique: Veiller à ce que les 5 ml polypropylène tubes à fond rond et les 15 et 50 ml tubes utilisés pour la préparation cellulaire (protocole étapes 02.01 à 02.11) sont complètement vidés de FBS pour empêcher Fanning (ie, la déviation imprécise des courants latéraux). Utilisez une pipette P200 pour enlever les FBS.
2. Préparation des cellules
- Sacrifier souris mâle sous anesthésie utilisant O 2 / isoflurane (induction à 5% puis maintenu à 2%), suivie par asphyxie au CO2.
- Accise et décapsulent deux testicules et émincer avec de petits ciseaux dans 500 pi de tampon de tri dans un tube de 1,5 ml.
- Rincer les cellules germinales à partir de tubes séminifères par douce pipetage de haut en bas dans le tube de 1,5 ml, d'abord avec une pointe de 100-1.000 pi tronquée, puis, avec une pointe 100-1000 ul intacte.
- Enlever les débris et bouquets par la première étape de filtration utilisant un tamis cellulaire de 40 um et de recueillir filtrat dans les 50 ml coniques prev tubeiously enduit avec du FBS à l'étape 1.
- Laver le filtre une fois avec le tri tampon jusqu'à un volume total de 3 ml et le transfert filtrat dans le tube de 15 ml conique préalablement revêtu à l'étape 1.
- Ajouter 16 ul d'EDTA 50 mM pH 8 par millilitre de suspension cellulaire (48 pi pour 3 ml) de façon à obtenir une concentration finale de 0,8 mM d'EDTA.
- Pour fixer les cellules germinales, ajouter lentement 3 volumes de glace-froid 100% d'éthanol en utilisant une pipette de 10 ml avec une légère agitation (vortex à basse vitesse), qui va produire une suspension laiteuse.
Étape cruciale: en ajoutant lentement de l'éthanol est crucial et important de préserver l'intégrité de la préparation cellulaire. Nous avons constaté que l'addition rapide de l'éthanol provoque la lyse des cellules a entraîné une diminution importante de l'efficacité du tri. Pour une suspension de cellules 3 ml, 9 ml d'éthanol, il convient d'ajouter à environ 1 min. - Incuber les cellules sur de la glace pendant 15 minutes avec mélange occasionnel par inversion.
- Centrifugeuse suspension de cellules à 800 g pendant 5 min et retirez le clairsurnageant.
- Resuspendre doucement les cellules germinales fixes dans 2 ml de tampon de tri.
- Ajouter 4 pi de l'ADN SYTO16 colorant (solution à 1 mM dans le DMSO) et incuber pendant au moins 30 min (abri de la lumière).
Remarque: Les meilleurs résultats sont obtenus en utilisant de tri SYTO16 car il est un colorant d'ADN perméable qui peut être facilement incorporée dans les noyaux fortement compactées de spermatides.
3. trieur de cellules Set Up
Remarque: Ici, un 4-laser (405 nm - violet, 488 nm - bleu, 561 nm - jaune-vert, 633 nm - rouge) 20-paramètre BDFACSAria III trieur de cellules est utilisée. Le logiciel BD FACSDiva 6.1.3 est utilisé pour visualiser et analyser les données. Les paramètres peuvent varier en fonction du type de trieur utilisé.
- Stériliser le trieur FACS en exécutant 70% d'éthanol comme fluide de gaine pendant la procédure fluidique d'arrêt (menu "cytomètre" dans le logiciel) avant le tri. Sélectionnez «cytomètre" dans la barre d'outils du logiciel et choisissez "sh fluidiqueutdown ". Suivez les étapes mentionnées par les processus.
- Préparer et un filtrage 1x PBS avec un filtre de 0,22 um afin d'éliminer tous les cristaux et les contaminants. Remplir le réservoir de la gaine à la ligne de soudure supérieure à l'intérieur de la cuve.
- Lancez le logiciel et connectez-vous. Commencez le trieur FACS pour réchauffer les lasers pendant au moins 30 min avant le tri. Exécutez deux processus de démarrage fluidiques pour débusquer l'éthanol à partir de la fluidique. Sélectionnez «cytomètre" dans la barre d'outils du logiciel et choisissez "démarrage fluidique». Suivez les étapes mentionnées par les processus.
Note: Ceci restaure fluidique avec le fluide de gaine normale (1x PBS). - Nettoyez le bloc de tri et les plaques de déviation avec de l'eau distillée et séchez-les soigneusement. Soniquer une buse de 100 pm placée dans un tube de l'eau distillée pendant 2 min dans un bain de sonication. Essuyez soigneusement la buse.
- Insérez la buse de 100 um dans la cellule d'écoulement et tournez le levier de verrouillage dans le sens horaire buse à la 12position h. Régler la pression de la gaine à 20 psi.
- Tournez sur le flux et ajuster l'amplitude d'obtenir des valeurs cibles pour la fréquence (environ 30), baisse de 1 (environ 150) et Gap (environ 12) et d'établir un modèle de gouttelette breakoff stable (quelques gouttes satellites). Éteignez atténuation.
- Assurez-vous que le flux est droite et frappe le centre de l'aspirateur de déchets en changeant l'angle du bloc de tri. Remarque: Une buse de 130 um à 10 psi a également été testé et aucune différence évidente n'a été trouvée.
- Définit le délai laser à 0 pour la -77,39 bleu, pour le rouge, 37.33 pour la violette et -39,85 pour les lasers jaune-vert.
- Définir les zones d'échelle à 1,14 pour le 1.0 bleu, pour le rouge, de 0,75 pour la violette et de 0,96 pour les lasers jaune-vert.
- Utilisation d'un Tri de test (dans la fenêtre "Side Stream" du logiciel), assurez-vous que les flux secondaires ne sont pas Fanning. Dans la fenêtre "Side Stream", régler les curseurs de tension de chaque courant latéral de façon à frapper le middle de tube de collecte de test. Si le flux de centre est pas étanche, ajuster la 2 ème, 3 ème et 4 ème paramètres de chute pour limiter le flux de centre.
- Démarrez le Setup cytomètre et le suivi (CS & T) application dans le logiciel (menu "cytomètre").
- Utilisez la configuration et le suivi des perles cytomètre à 1 goutte par 350 pi d'automatiser la caractérisation et le suivi de la performance cytomètre en utilisant les instructions du fabricant.
- Quittez l'application CS & T. Appliquer paramètre CS & T, assurez-vous que les paramètres de flux permettent encore un motif de gouttelettes breakoff stable, et tourner sur le bouton Sweet Spot comme décrit dans les instructions du fabricant (dans la fenêtre "sécable").
- Optimiser la valeur de retard Goutte utilisant des billes fluorescentes (voir le tableau des matériaux).
- Installez les tubes de prélèvement dans le support. Ouvrez la porte du bloc sort. Dans la fenêtre "Side Stream", allumer la tension puis sélectionnez "Sorte de test "et cliquez sur le bouton Aspirateur tiroir pour ouvrir le tiroir et avoir accès à des tubes de prélèvement.
- Optimiser les flux secondaires alors ils vont dans le centre du tube. Réglez les valeurs et les curseurs au besoin.
- Fermez la porte du bloc de tri et assurez-vous de régler la molette de micromètre pour obtenir le point le plus lumineux de perles au centre. Tiroir à déchets Désélectionner, trier et la tension test. Retirer les tubes de prélèvement.
- Optimiser le retard de chute selon les instructions du fabricant.
- En bref, secouer vigoureusement cordon flacon et diluer 1 goutte de perles dans 0,5 ml de PBS.
- En utilisant les instructions du fabricant, définir le délai de dépôt en utilisant le modèle de l'expérience Retard baisse disponible dans le logiciel. Vous pouvez également utiliser la fonction Auto Delay déplacer pour définir le délai de baisse.
- Chargez le tube de perles fluorescentes et ajuster le débit jusqu'à ce que le taux de seuil est ~ 3.000 à 4.000 événements / seconde. Réglez la précision de sorte à "initiale" et finaleLy à «peaufiner» dans la fenêtre «Trier de mise en page". Sélectionnez le filtre optique et de tri des perles. Régler le retard Dérouler jusqu'à ~ 100% sont classifiées vers la gauche.
Remarque: Cette étape est essentielle pour faire en sorte que les cellules d'intérêt sorte dans un courant latéral. Les billes et le filtre optique sont utilisés pour obtenir un écart proche de gouttelette de 100%.
- Placez un ND (densité neutre) filtre FSC 1.5 à l'extrémité gauche du bloc de détecteur de FSC. Réglez l'extension de la fenêtre à 2.00 ms et la mise à l'échelle FSC Zone à 1,00 (dans l'onglet "laser" dans la fenêtre "cytomètre").
- Avant de charger le tube de l'échantillon, placer une ligne de filtration de l'échantillon de 50 um à la fin de la ligne de prélèvement pour éviter l'agglutination. Pour ce faire, sélectionnez "Changer le filtre échantillon» dans le menu «cytomètre".
- Testez la composition de l'échantillon de fluide pour obtenir une bonne séparation sans attiser entre les flux de côté et d'empêcher les cellules de coller à la polypropètubes NE.
- Chargez le tube d'échantillon, tourner sur les plaques de déviation et sélectionnez "sorte de test" à tiroir fermé. Regardez les flux secondaires si la séparation se produit sans trop de Fanning.
Remarque: Fanning est probablement due à une concentration élevée de protéine dans le tampon d'échantillon.
- Chargez le tube d'échantillon, tourner sur les plaques de déviation et sélectionnez "sorte de test" à tiroir fermé. Regardez les flux secondaires si la séparation se produit sans trop de Fanning.
- Chargez le tube d'échantillon dans l'instrument FACS. Sélectionner un échantillon agitation de 300 tours par minute et à une température de 4 ° C de l'échantillon. Sélectionnez "Acquérir les données" dans le "Tableau de bord de l'acquisition».
- Si nécessaire, diluer l'échantillon d'atteindre un taux d'événement approprié pour un maximum de 5000 événements / sec (à un débit maximal de 3,0). Respecter strictement ces limites de façon à maintenir la pureté des cellules triées.
- Pour analyser et trier les cellules, d'optimiser la valeur de seuil de FSC pour éliminer les débris sans interférer avec la population d'intérêt. Dans échelle logarithmique, ajuster la tension du détecteur tubes photo-multiplicateurs (PMT) avec le filtre de 530/30 afin de faireen sorte que le signal de fluorescence de la population totale à l'intérieur de l'échelle correspond, et porte sur la population positive (Figure 1, la porte 1).
- Produire un Forward Scatter-zone (FSC-A) / Side Scatter-zone (SSC-A) parcelle de la population positive SYTO16 et ajuster la FSC-A à environ 110 V sur une échelle linéaire, et le SSC-A à environ 150 V en échelle logarithmique de visualiser tous les événements tout en excluant de très grandes cellules et les agrégats cellulaires.
- Dans la fenêtre «Trier Layout", réglez le "Mode Tri précision" à "la pureté 4-way" (masque de Rendement: 0, Pureté Masque: 32, Phase Mask: 0). Sélectionnez «Continu» dans le menu «Événements cibles" pour le tri continue.
- Ajouter populations à trier dans le domaine correspondant aux tubes (dans la fenêtre "Trier Layout"). La place populations avec des fréquences plus élevées dans le milieu et ceux avec des fréquences inférieures aux extrémités. Réglez les plaques de tension à 2.500 V. Pendant le tri, garder le prélèvement de l'échantillon tUBE sur la glace.
4. Tri cellulaire
- Immédiatement avant le tri, les cellules de filtrage utilisant un filtre de 50 um dans un 5 ml précédemment enduite polypropylène tube rond en bas.
- Laver le filtre abondamment avec 1-2 ml de tampon de tri.
- Cellules germinales Trier fixe utilisant un trieur de cellules laser équipé 488 nm suivant le schéma de déclenchement détaillé dans la figure 1. Recueillir des fractions purifiées dans 5 ml tubes en polypropylène à fond rond préalablement enduits à l'article 1 sur la glace.
- Assurez-vous que 100-200 pi de FBS est maintenue dans les tubes de prélèvement pour éviter le collage des cellules triées à la paroi du tube.
- Assurez-vous que la concentration de SYTO16 sature pour éviter les fluctuations de fluorescence au cours de la période de tri. SYTO16 sature lorsqu'il n'y a pas de variation en outre intensité de coloration des cellules à l'Alexa Fluor 488 paramètre (coloration de l'ADN) dans les graphiques de tri. Si nécessaire, ajouter 1 pl deSYTO16 au tube de tri pour atteindre la saturation.
- Afficher les événements au total sur un graphique affichant les paramètres suivants: nombre d'événements vs Alexa Fluor 488-A.
- Sélectionner les cellules à coloration positive de l'ADN avec une porte, comme représenté sur la figure 1.
- Afficher les cellules de la porte du 1 sur un graphique en utilisant SSC-A vs FSC-A en tant que paramètres
- Sélectionnez les cellules avec Gate 2, comme le montre la figure 1.
- Afficher les cellules de Gate 2 sur un graphique en utilisant FSC-A vs Alexa Fluor 488-A en tant que paramètres.
- Sélectionnez les cellules avec Porte 5 et 6 porte sur Gate 2 graphique, comme le montre la figure 1.
- Afficher séparément Porte 5 et 6 porte sur des graphiques en utilisant Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A en tant que paramètres.
- Sélectionnez spermiogenèse étapes 1-9 spermatides sur le graphique Porte 5 et spermiogenèse étapes 10-12 spermatides sur la grille 6 graphiques, comme le montre la figure 1.
- Affichageles cellules de la porte du 1 sur un graphique en utilisant FSC-A vs Alexa Fluor 488-A en tant que paramètres
- Sélectionnez les cellules avec les entrées 3 et 4, comme le montre la figure 1.
- Afficher séparément Porte 3 et la porte 4 graphiques utilisant Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor 488-A en tant que paramètres.
- Sélectionnez spermiogenèse étapes 13-14 spermatides sur le graphique Porte 3 et spermiogenèse étapes 15-16 spermatides sur le graphique porte 4, comme le montre la figure 1.
- Afficher les cellules de la porte du 1 sur un graphique en utilisant SSC-A vs FSC-A en tant que paramètres
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stratégie d'entrée sont utilisés avec la cytométrie en flux
Figure 1 représente la stratégie de déclenchement utilisé dans la cytométrie en flux pour trier quatre populations de spermatides très pures. Brièvement, les cellules dont la coloration de l'ADN positif (Alexa Fluor 488-A) sont d'abord sélectionné avec la Porte 1. Spermatides de spermiogenèse steps 1-12 sont sélectionnés (Gate 2) sur un tracé de points montrant la granulosité (SSC-A) vs taille (FSC -A) de la porte 1. Ensuite, à partir de la spermiogenèse spermatides les étapes 9.1 et la spermiogenèse les étapes 10 à 12 peuvent être séparés les uns des autres en fonction de la variation de l'intensité de coloration de l'ADN (portes 5 et 6). Spermatides de spermiogenèse étapes 13-14 et 15-16 sont sélectionnés directement à partir de cellules colorées positivement sur un tracé de points montrant la taille (FSC-A) vs coloration de l'ADN (Alexa Fluor 488-A) (Portes 3 et 4). Toutes les populations triées sont redéfinis avec Alexa Fluor 488-W vs Alexa Fluor taches 488-A pour augmenter la dot ir pureté.
Validation du système de purification par microscopie à épifluorescence
La figure 2 représente la coloration DAPI des populations triées de spermatides par cytométrie de flux. La spermiogenèse étapes 1-9 spermatides afficher la forme ronde typique noyau des spermatides rondes et le noyau de forme ovale de l'étape de la spermiogenèse 9 spermatides. La spermiogenèse étapes 10-12 spermatides montrent une grande élongation noyau en forme de crochet. Spermiogenèse étapes 13-14 et 15-16 spermatides ont un noyau de forme similaire, mais diffèrent légèrement en intensité de la coloration de l'ADN, ce qui a permis leur tri. Les étapes de la différenciation et de la pureté des différentes populations triées ont également été déterminés en utilisant des biomarqueurs spécifiques comme décrit dans une étude précédente 9. La pureté des populations triées spermatides est représenté dans le tableau 1.
tente "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figure 1. Stratégie de déclenchement détaillée pour trier les populations ultra-pure de spermatides. Représentation schématique de la stratégie de déclenchement utilisé pour trier spermiogenèse étapes 1-9 spermatides, les étapes 10-12 spermatides, les étapes 13-14 spermatides et les étapes 14-16 spermatides simultanément avec un 488 nm laser-équipée trieur de cellules. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Visualisation des spermatides triés par épifluorescence. Spermatides triées sont cytospined sur des lames de microscope, colorées avec du DAPI et visualisées en utilisant un microscope à épifluorescence avec les filtres appropriés pour DAPI et équipés d'un capteur CCD caMera. Les cellules sont présentés dans l'échelle de gris inversée. Bar = 20 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
| Type de cellules observée dans la majorité | Pureté | Nombre approximatif de cellules (8 h de tri) | Contaminants | |
| Population 1 | Étapes 1-9 spermatides | 99 à 100% | 4000000 | Étape 10 spermatides |
| Population 2 | Les étapes 10-12 spermatides | 95-98% | 1000000 | Spermatocytes |
| Population 3 | Les étapes 13-14 spermatides | 99 à 100% | 800000 | Spermatocytes, spermatides étapes 1-9 |
| Population 4 | Les étapes 15-16 spermatides | 98-100% | 1500000 | Spermatocytes |
Tableau 1: Trier populations de spermatides et leurs contaminants.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Les cellules de la spermatogenèse ont toujours été difficiles à étudier étant donné la complexité de l'épithélium séminifère, ainsi que le succès limité de la culture in vitro. Au fil des ans, de nombreuses approches pour purifier les cellules germinales à partir de diverses espèces ont été développés. En utilisant des techniques de purification sédimentation par gravité avec des gradients de Percoll ou d'albumine bovine de sérum fournissent un bon rendement des cellules germinales intactes, mais manquent de définition appropriée entre certains types de cellules telles que des cellules et des spermatides 10 tétraploïdes méiotiques. En outre, ces techniques nécessitent des dispositifs spéciaux (souvent faits maison) qui peuvent ne pas être facilement disponibles pour de nombreux laboratoires, ce qui les rend difficiles à reproduire sans procès lourd et erreurs. Ces méthodes sont aussi beaucoup de temps, très sensibles aux vibrations et gênant que l'appareil est habituellement maintenue à 4 ° C pour maintenir la viabilité des cellules. En cas de succès, les méthodes de sédimentation cependant fournir plusieurs millions c direct purifiéeaunes par la population. Cependant, le faible niveau d'enrichissement en cellules qui peut être obtenue est le principal inconvénient de ces techniques où il atteint rarement plus de 80 à 90% de pureté. Dans certains cas, une contamination de 10 à 20% par rapport à d'autres types cellulaires est présente quand elle est mesurée par l'ADN, l'ARN ou la teneur en protéine, ce qui représente un obstacle majeur à des analyses moléculaires.
Lorsque l'on cherche à améliorer la pureté des populations de cellules, certains chercheurs ont combiné sédimentation par gravité pour les autres méthodes. L'une des approches les plus efficaces est d'utiliser la souris immature pour limiter le nombre de populations de cellules différentes représentant les étapes ultérieures. On peut profiter de la première vague de la spermatogenèse et d'obtenir une préparation de cellules contenant les cellules germinales jusqu'à un stade donné de différenciation basée sur leur apparence séquentielle après la naissance. Cependant, cette approche combinée nécessite plus d'animaux pour compenser la quantité limitée de matériau de départ et pourtant ne résout pas le manque de Definition des méthodes de sédimentation. En outre, une telle approche ne peut pas être appliqué pratiquement pour les cellules types ultérieurs tels que spermatides, mais est principalement utilisé pour les spermatogonies et spermatocytes primaires. En outre, il existe des preuves que la première vague de la spermatogenèse peut abriter des cellules avec des propriétés légèrement différentes de celles de l'épithélium de vélo de souris 11,12 maturité.
Vitamine A la synchronisation de la spermatogenèse a été également utilisé pour améliorer la purification des cellules germinales que cette procédure se rétrécit le nombre de stades présents dans les testicules d'un animal traité. Toutefois, cette procédure a été principalement utilisé pour synchroniser la spermatogenèse chez les rats, avec un certain succès rapportés chez des souris 13,14. De notre propre expérience, la vitamine A chez la souris est la synchronisation du temps, donne rarement des résultats reproductibles et produit des effets secondaires nocifs suscitant des inquiétudes quant à l'intégrité cellulaire de l'épithélium séminifère.
Other groupes ont utilisé avec succès la cytométrie en flux pour purifier les cellules germinales de souris 15-18. Cependant, aucun d'entre eux a rapporté la purification de populations spermatides dernières spermatides ronds étapes. Notre stratégie de déclenchement permet de purifier quatre populations de cellules haploïdes hautement purifiés représentant étapes de différenciation importants se prêtent à des études moléculaires. La principale contrainte de la méthode décrite dans le présent document peut être le rendement limité de cellules triées. Le niveau élevé de pureté est quelque peu obtenu au détriment du nombre de cellules triées. Cependant, pour vous assurer que les conditions de tri sont optimales, nous avons ajouté quelques conseils essentiels pour le protocole. Tous ces conseils techniques visent à augmenter soit le nombre ou la pureté de spermatides triés. Par exemple, l'utilisation de tubes revêtus de FBS pendant tri considérablement réduit la perte des cellules qui adhèrent aux tubes. En outre, la concentration en utilisant la saturation des SYTO16 permet de réduire les variations d'intensité de coloration de l'ADN résultant en populat plus stableions comme on le voit sur les parcelles FACS et un meilleur rendement et la pureté de spermatides triés sur une période tri de 8 heures. En outre, les conseils techniques fournis pour le FACS trieuse set-up certainement aider à augmenter l'efficacité globale du tri en évitant les sabots de cellules ou la contamination croisée dans les tubes de collecte. En variante, les portes peuvent être développées pour augmenter le nombre de cellules triées, qui résulte en une faible diminution de la pureté de la population, ce qui peut être acceptable pour certaines études. En outre, les cellules germinales fixés à l'éthanol colorées avec SYTO16 sont très stables à 4 ° C et peuvent être triées pour plus de 8 heures avec des ajustements de déclenchement limitées et la supervision. En fin de compte, plusieurs jours de tri peuvent être mis en commun pour obtenir un nombre suffisant de cellules pour toutes les applications.
Spermatides de débit triés obtenus comme décrit ici peuvent être utilisés pour une variété d'expériences. L'ADN de ces cellules peut facilement être extrait en utilisant des kits de purification d'ADN génomique et a démontré commerciauxpour être de qualité appropriée pour la PCR et le séquençage analyse 9 de la prochaine génération (données non présentées). Spermatides triées peuvent également être utilisés pour la protéine analyses 9 où nous avons effectué plusieurs immunoblots contre des marqueurs spécifiques au stade de confirmer la grande pureté des spermatides triés. Nous avons vérifié l'intégrité cellulaire des spermatides triés et constaté que le noyau et le cytoplasme de toutes les populations restent intacts. Cependant, nous avons trouvé une proportion d'étapes 13-14 spermatides et une plus petite proportion des étapes 15-16 spermatides qui manquent leur flagelle (données non présentées). Ainsi, les populations de cellules germinales très pures triés à l'aide de cette approche sont adaptés aux analyses protéomiques et génomiques, ainsi que d'autres applications.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Les auteurs tiennent à remercier le Dr Leonid Volkov et Éric Bouchard pour leurs conseils techniques concernant microscopie à épifluorescence.
Aide financière
Financé par les Instituts de recherche en santé (subvention # MOP-93781) GB canadiennes
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
