Abstract
Fare spermatidler farklılaşması sağlam bir genomu olan bir fonksiyonel erkek gamet üretimi için bir kritik işlem sonraki kuşağa olmaktır. Şimdiye kadar, bu morfolojik geçiş moleküler çalışmalar daha sonraki analizler için spermatid farklılaşma bu önemli adımlardan yeterli ayrılmasını sağlayan bir yöntem olmaması nedeniyle sekteye oylandı. Akış sitometri kullanılarak bu hücrelerin düzgün gating de önceki girişimler için kromatin yenileme geçiren spermatidler DNA floresan kendine özgü bir artış zor olabilir. Bu gözleme dayanarak, biz etanol ile sabit fare spermatid dört popülasyonlarının tekrarlanabilir arıtılmasını sağlayan düzeni sitometri basit bir akış ayrıntıları, her nükleer yeniden şekillenme sürecinde farklı bir durumu temsil. Nüfus zenginleştirme aşaması özgü işaretleri ve morfolojik kriterler kullanılarak teyit edilir. Saflaştırılmış genomik spermatidler ve proteom için kullanılabiliric analizleri.
Protocol
Hayvan bakım Université de Sherbrooke hayvan bakımı ve kullanımı komitesi ile uyumlu idi.
1. Tüp Hazırlığı
- Hücre sıralama bir gün önce, 5 ml'lik bir polipropilen yuvarlak tabanlı tüpe ısı ile inaktive edilmiş fetal büyükbaş hayvan serumu (FBS) ile 1-2 ml ekleyin ve 15 ml ve 50 ml polipropilen konik tüplere.
Kritik adım: protokolünde kullanılan her tüp kaplı olduğundan emin olun.
Not: FBS kaplama boru duvarlarına yapışmasını germ hücrelerine önler. - Yavaş yavaş tüpler aynı şekilde bir rotator ile kaplamak için, 4 ° C'de ters çevirme ile O / N karıştırın.
- Ertesi gün, boşaltılarak kaplanmış tüpler FBS çıkarın.
- * Kritik adım: 5 ml polipropilen yuvarlak dipli tüpler ve hücre hazırlanması için kullanılan 15 ve 50 ml tüpler (protokol 2.11 2.1 adımları) tamamen havalandırmak (yan akımlarının, yani belirsiz sapma) önlemek için FBS boşalttı emin olun. FBS kaldırmak için bir P200 pipetlemeyin kullanın.
- Yuvarlak 5 ml polipropilen saflaştırılmış hücreleri toplamak için kullanılan alt tüpler içinde FBS (yaklaşık 100-200 ul) küçük bir kalıntı hacmi bırakın.
- * Kritik adım: 5 ml polipropilen yuvarlak dipli tüpler ve hücre hazırlanması için kullanılan 15 ve 50 ml tüpler (protokol 2.11 2.1 adımları) tamamen havalandırmak (yan akımlarının, yani belirsiz sapma) önlemek için FBS boşalttı emin olun. FBS kaldırmak için bir P200 pipetlemeyin kullanın.
2. Hücre Hazırlanması
- O CO 2 boğulma ardından 2 / izofluran (daha sonra% 2 oranında muhafaza% 5 indüksiyon) ile anestezi altında tek erkek fare Kurban.
- Tüketim ve açarlar hem testis ve 1.5 ml tüp içine tampon sıralama 500 ul küçük bir makas ile kıyma.
- Sağlam bir 100-1,000 ul ucu ile daha sonra seminifer ilk kesik 100-1,000 ul ucu ile 1.5 ml tüp nazik yukarı ve aşağı pipetleme tübüllerinde, ve gelen yıkayın germ hücreleri.
- 40 mikron hücre süzgeç kullanılarak bir filtrasyon adım enkaz ve kümeleri çıkarın ve 50 ml konik tüp prev içine süzülen toplamakiously Aşama 1 FBS kaplanmıştır.
- Daha önce 1. adımda kaplı 15 ml konik tüp içine toplam 3 ml hacminde ve transfer filtrata kadar tampon sıralama ile bir kez filtreyi yıkayın.
- 0,8 mM EDTA nihai bir konsantrasyon elde etmek üzere, 50 mM EDTA hücre süspansiyonu mililitre başına pH 8 (3 ml 48 ul) 16 ul ekle.
- Germ hücreleri düzeltmek için, yavaş yavaş süt süspansiyon üretecek hafif ajitasyon ile 10 mi pipeti (düşük hızda vorteks) kullanılarak buz-soğuğu% 100 etanol içinde 3 hacim ekleyin.
Kritik adım: yavaşça etanol ilave hücre hazırlama bütünlüğünü korumak için çok önemli ve çok önemlidir. Biz etanol hızlı ekleme etkinliğini sıralama önemli bir düşüşe neden hücre lizizine neden olduğunu kaydetti. 3 ml hücre süspansiyonu için, etanol, 9 ml, yaklaşık 1 dakika içinde ilave edilmelidir. - Ters çevirme ile ara sıra karıştırma ile 15 dakika süreyle buz üzerinde inkübe hücreleri.
- Santrifüj hücre 5 dakika boyunca 800 xg'de süspansiyon ve net çıkarmaksüpernatant.
- Yavaşça tampon sıralama 2 ml sabit germ hücreleri tekrar süspansiyon.
- SYTO16 DNA boyası (DMSO içinde 1 mM çözelti) 4 ul ekleyin ve (ışıktan korunarak), en az 30 dakika inkübe edilir.
Not: iyi sıralama sonuçları kolayca spermatidlerin yüksek oranda sıkıştırılmış çekirdekler dahil edilen geçirgen bir DNA boya olduğu SYTO16 kullanılarak elde edilir.
3. Hücre Ayırıcı Kurma
Not: Burada, bir 4-Lazer (405 nm - menekşe, 488 nm - mavi, 561 nm - sarı-yeşil, 633 nm - kırmızı) 20-parametre BDFACSAria III hücre sıralayıcı kullanılır. BD FACSDiva 6.1.3 yazılımı veri görselleştirmek ve analiz etmek için kullanılır. Ayarları kullanılır sıralayıcı türüne bağlı olarak değişebilir.
- Fluidik kapatma prosedürü (yazılımında "Sitometre" menüsü) sıralama öncesinde sırasında kılıf sıvısı olarak% 70 etanol çalıştırarak FACS sıralayıcı sterilize edin. Yazılımın araç çubuğundaki "Sitometreyi" seçin ve "Fluidic sh seçin. "utdown süreçler tarafından belirtilen adımları izleyin.
- Hazırlama ve herhangi bir kristal ve kirletici maddelerin bertaraf edecek şekilde bir 0.22 um filtre ile 1x PBS filtre. Tankın iç üst kaynak hattına kılıf deposunu doldurunuz.
- Yazılımını başlatın ve oturum açın. Önce sıralama için en az 30 dakika süreyle lazer ısınmak için FACS sıralayıcı başlatın. Akıskanlar tekni˘gi gelen etanol dışarı floş iki akışkan başlangıç süreçlerini çalıştırın. Yazılımın araç çubuğundaki "Sitometreyi" seçin ve "Fluidic başlangıç" ı seçin. Süreçlerle belirtilen adımları izleyin.
Not: Bu normal bir kılıf sıvısı (1x PBS) ile Fluidics geri yükler. - Sıralama blok ve distile su ile saptırma plakaları temizleyin ve iyice kurulayın. Bir sonikasyon banyosu içinde 2 dakika için damıtılmış su içinde bir boru içine yerleştirilmiş bir 100 um ağızlık sonikasyon. Iyice memeyi silin.
- Akış hücre içine 100 mikron memesini takın ve 12 meme-kilitleme kolunu saat yönünde çevirinhr pozisyonu. 20 psi kılıf basıncını ayarlayın.
- Dere açın ve (30 civarında) frekans hedef değerleri elde etmek için genlik ayarlayın 1 (150 civarında) bırakın ve (12 civarında) Gap ve istikrarlı bir damlacık kırılması deseni (birkaç uydu damla) kurmak. Zayıflama kapatın.
- Dere düz ve sıralama bloğunun açısını değiştirerek atık aspiratör merkezini vurur emin olun. Not: 10 psi A 130 mikron meme de test edildi ve belirgin bir fark bulunmuştur.
- Sarı-yeşil lazerler için, mavi mor kırmızı için -77.39, 37.33 -39.85 ve için 0 olarak ayarlayın lazer gecikme.
- Sarı-yeşil lazerler için, mavi mor kırmızı için 1.0, 0.75 ve 0.96 için 1.14 ölçekleme ayarlayın alanları.
- (Yazılım "Yan Akım" penceresinde) Test Sıralama kullanarak, yan akışları havalandırarak olmadığından emin olun. Onlar middl isabet böylece "Yan Akım" penceresinde, her yan akımının gerilim sürgü ayarlamakTest toplama tüpünün e. Merkez akışı sıkı değilse, merkez akışı sınırlamak için 2 nd, 3 rd ve 4. damla ayarlarını.
- Yazılımın ("Sitometre" menüsü) Sitometrenin Kurulum ve İzleme (CS & T) uygulamasını başlatın.
- Üreticinin talimatlarını kullanarak sitometresinin performans karakterizasyonu ve izleme otomatikleştirmek için 350 ul başına 1 damla sitometresinin kurulum ve izleme boncuk kullanın.
- CS & T uygulaması çıkın. CS & T ayarı uygulamak, dere parametreleri hala istikrarlı bir damlacık kırılması modelini izin verdiğinizden emin olun, ve ("kırılması penceresinde" olarak) üreticinin talimatlarına açıklandığı gibi Sweet Spot butonuna açın.
- Floresan boncuklar kullanarak Bırak Gecikme değerini optimize (Malzeme Tablo).
- Tutucuya toplama tüpleri yükleyin. Sıralama bloğu kapağını açın. "Yan Akım" penceresinde, "seçeneğini ardından gerilime açınTest sıralama "ve çekmeceyi açın ve toplama tüpleri erişimi için Aspiratör Çekmece düğmesini tıklatın.
- Onlar tüp merkezine gitmek böylece yan akışları optimize edin. Gerektiği gibi değer ve kaydırma çubuklarını ayarlayın.
- Sıralama bloğu kapağını kapatın ve merkezde parlak boncuk nokta elde etmek mikrometre kadranını ayarlamak için emin olun. Unselect atık çekmece test sıralama ve gerilim. Toplama tüpleri çıkarın.
- Üreticinin talimatlarına göre açılan gecikme optimize edin.
- Kısaca, boncuk şişe kuvvetlice sallayın ve PBS 0.5 ml boncuk 1 damla sulandırmak.
- Üreticinin talimatlarına kullanarak, yazılım mevcuttur Bırak Gecikme deneme şablonu kullanarak damla gecikme ayarlayabilirsiniz. Alternatif olarak, açılan gecikmesini ayarlamak için Otomatik Bırak Gecikme özelliğini kullanın.
- Floresan boncuk tüp yerleştirin ve eşik oranı kadar ~ 3.000 4.000 olaylar / saniye akış hızını ayarlayın. Sıralama hassasiyetini ayarlamak için "İlk" ve sonly "Sıralama düzeni" penceresindeki "İnce ayar" için. Optik filtreyi seçin ve boncuk sıralayın. % 100 sola sıralanır ~ kadar Bırak Gecikmesi ayarlayın.
Not: Bu adım emin olmak için kritik olduğunu bir yan akışına faiz tür hücreler. Boncuk ve optik filtre, bir% 100 damlacık sapma yakın elde etmek için kullanılır.
- FSC dedektörü bloğunun sol ucundaki bir FSC 1.5 ND (nötr yoğunluk) filtreyi yerleştirin. 2.00 us pencere uzantısı ve ("Sitometre" penceresindeki "Lazer" sekmesinde) 1.00 FSC Alan ölçekleme ayarlayın.
- Örnek tüpü yerleştirmeden önce, topaklanma önlemek için örnek hattının sonunda 50 um örnek filtre satırı koyun. Bunu yapmak için, "Sitometre" menüsünden "Örnek Filtre değiştirme" seçeneğini seçin.
- Yan akım arasındaki havalandırmadan iyi bir şekilde ayrılmasını sağlamak ve Polipropilen yapışmasını önlemek için hücrelerin örnek sıvı bileşimin testne tüpler.
- , Örnek tüp Yük saptırma plakaları açın ve çekmece kapalı "Test tür" seçeneğini seçin. Ayrılık çok fazla ventilatör olmadan oluşursa yan dereler bak.
Not: Havalandırma, numune tamponu içinde, yüksek protein konsantrasyonunda muhtemeldir.
- , Örnek tüp Yük saptırma plakaları açın ve çekmece kapalı "Test tür" seçeneğini seçin. Ayrılık çok fazla ventilatör olmadan oluşursa yan dereler bak.
- FACS aracı haline örnek tüp yükleyin. 300 rpm'lik bir ajitasyon örneği ve 4 ° C'de bir örnek sıcaklığı seçin. "Acquisition Dashboard" in "Veri Edinme" seçeneğini seçin.
- Gerekirse, (3.0 maksimum akış hızında) / saniye 5000 etkinlikleri en fazla, uygun bir olay hızı elde etmek için örnek seyreltin. Sıralanmış hücrelerin saflığını muhafaza edecek şekilde Strictly bu sınırları saygı.
- Analiz ve hücreleri sıralamak için, faiz nüfusu müdahale etmeden enkaz ortadan kaldırmak için FSC eşik değerini optimize. Logaritmik ölçekte yapmak amacıyla 530/30 filtresi ile foto-çoğaltıcı tüp (PMT) dedektörün voltajını ayarlamakEmin toplam nüfusun floresan sinyal ölçeğinde dahilinde ve pozitif nüfus kapısı (Şekil 1, Kapı 1).
- Bir Forward Scatter-alanı (FSC-A) / Side Scatter alan SYTO16 pozitif nüfusun (SSC-A) arsa üretin ve yaklaşık 110 V Doğrusal ölçekte için FSC-A ayarlayın ve yaklaşık 150 V SSC-A Çok büyük hücreleri ve hücre agrega hariç ise logaritmik ölçekte tüm olayları görselleştirmek için.
- "Sıralama Düzeni" penceresinde, "Sıralama Hassas Mode" set "4-yollu saflık" için (Verim maskesi: 0, Saflık Maskesi: 32, Faz Maskesi: 0). Sürekli sıralama için "Hedef Etkinlikler" menüsünden "Sürekli" yi seçin.
- ("Sıralama Düzeni" penceresinde) tüplere karşılık gelen alanda sıralamak için popülasyonları ekleyin. Yüksek orta frekans ve ucunda düşük frekanslarda olanlar ile yerleştirin popülasyonları. , Sıralama sırasında 2500 V gerilim plakaları ayarlayın örnek toplama t tutmakBuz üzerinde UBE.
4. Hücre Ayırma
- Hemen sıralamadan önce, yuvarlak dipli tüp önceden kaplanmış 5 ml polipropilen 50 mikron filtre kullanılarak filtre hücreleri.
- Tampon sıralama 1-2 ml yoğun filtreyi yıkayın.
- Şekil 1'de detaylı yolluk planı izleyen bir 488 nm lazer donanımlı hücre sıralayıcı kullanılarak sırala sabit germ hücreleri. Daha önce buz üzerinde bölüm 1 kaplı 5 ml polipropilen yuvarlak dipli tüplerde arıtılmış kesirler toplayın.
- FBS 100-200 ul tüp duvarına sıralanmış hücrelerin yapışmasını önlemek için toplama tüpleri muhafaza olduğundan emin olun.
- SYTO16 konsantrasyonu sıralama döneminde floresan dalgalanmaları önlemek için doygunluğa emin olun. Ayırma Grafiklerdeki Alexa Fluor 488 parametresi (DNA boyama) hücre boyama yoğunluğunun daha fazla değişiklik olduğunda SYTO16 satürasyon. Gerekirse, 1 ulSıralama tüp SYTO16 doygunluk ulaşmak için.
- Alexa Fluor 488-A vs olay sayısı: aşağıdaki parametreleri gösteren bir grafik üzerinde toplam etkinlik gösterir.
- Şekil 1 'de gösterildiği gibi, Gate 1 pozitif bir DNA boyama hücreleri seçin.
- Parametre olarak FSC-A vs SSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde kapısı 1 Ekran hücreleri
- Şekil 1'de gösterdiği gibi, Gate 2 ile hücreleri seçin.
- Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs FSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde Gate 2 Ekran hücreleri.
- Şekil 1'de gösterdiği gibi, Gate 2 grafik üzerinde Gate 5 ve Gate 6 hücreleri seçin.
- Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs 488-W Alexa Fluor kullanarak grafik üzerinde ayrı ayrı Gate 5 ve 6 Gate gösterir.
- Seç Spermiyogenez Gate 5 grafikte 1-9 spermatid adımları ve Şekil 1'de gösterdi Spermiyogenez Gate 6 grafik 10-12 spermatid adımları yineleyin.
- Ekranparametre olarak Alexa Fluor 488-A vs FSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde kapısı 1 hücreleri
- Şekil 1'de gösterdiği gibi, Gate 3 ve Gate 4 hücreleri seçin.
- Parametre olarak Alexa Fluor 488-A vs 488-W Alexa Fluor kullanarak grafik üzerinde ayrı ayrı Gate 3 ve Gate 4 görüntüler.
- Seç Spermiyogenez Kapısı 3 grafik üzerinde 13-14 spermatid adımları ve Şekil 1'de gösterdi Spermiyogenez, Gate 4 grafik üzerinde 15-16 spermatid adımları yineleyin.
- Parametre olarak FSC-A vs SSC-A kullanılarak bir grafik üzerinde kapısı 1 Ekran hücreleri
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yolluk strateji akış sitometri ile kullanılabilir
Şekil 1 dört derece saf spermatid popülasyonları sıralamak için flow sitometri kullanılan yolluk stratejisini temsil eder. Kısaca, pozitif DNA boyama hücreleri (Alexa Fluor 488-A) Birinci boyut vs granulosity (SSC-A) gösteren bir nokta arsa üzerinde Spermiyogenezin 1. spermatid 1-12 seçilir adımlar Kapısı (Gate 2) ile seçilir (FSC Kapı 1. A) Daha sonra, Spermiyogenezin gelen Spermatidler 1-9 adımları ve Spermiyogenez 10-12 DNA boyama yoğunluğuna varyasyonuna göre birbirinden ayrılabilir adım (kapılar 5 ve 6). Spermiyogenezin gelen spermatidler 13-14 adımları ve 15-16, doğrudan DNA boyama (Alexa Fluor 488-A) vs nokta arsa gösteren boyutu (FSC-A) pozitif lekeli hücrelerde arasından seçilir (kapıları 3 ve 4). Tüm sıralanmış popülasyonlar Alexa Fluor ile yeniden tanımlanmıştır 488-W Alexa Fluor 488-A nokta lekeler artırmak için vs ir saflık.
Epifloresans mikroskobu ile saflaştırma şemasının Doğrulama
Şekil 2 akış sitometri spermatid sıralı popülasyonlarının DAPI boyama temsil eder. Spermiyogenez 1-9 spermatidler yuvarlak spermatid ve Spermiyogenez 9. adımda Spermatidler oval şekilli çekirdeğin tipik yuvarlak şekilli çekirdeği gösterir adımlar. Spermiyogenez 10-12 Spermatidler büyük kanca şekilli uzayan çekirdeği gösterir adımlar. Spermiyogenez 13-14 ve 15-16 Spermatidler benzer şekilli çekirdeği var, ama onların sıralama izin DNA boyama yoğunluğu, biraz farklı adımlar. Farklı sıralanmış popülasyonlarının farklılaşma adımları ve saflık, önceki bir çalışmada 9'da tarif edildiği gibi belirli bir biyolojik belirleyicilerinin tespit edildi. Sıralanmış spermatid popülasyonlarının saflığı Tablo 1 'de gösterilmiştir.
1 ">:" keep-together.within sayfa = fo "çadır
1. Detaylı yolluk strateji ultrasaf spermatid popülasyonları sıralamak Şekil. Spermiyogenezin sıralamak için kullanılan yolluk stratejisinin şematik, 1-9 spermatid adımları 10-12 spermatid adımları 13-14 spermatid adımları ve 488 nm ile 14-16 Spermatidler eşzamanlı adımlar lazer donanımlı hücre sıralayıcı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Epifloresans tarafından sıralanan spermatidlerin Görselleştirme. SÄ spermatid DAPI ile boyanmış, mikroskop lamı üzerine cytospined ve DAPI için uygun filtreler ile bir Epifloresans mikroskop kullanılarak görüntülendi ve bir CCD ca ile donatılmıştırmera. Hücreler ters gri tonlama gösterilir. Bar = 20 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
| Hücre tipi çoğunluk gözlenen | Saflık | Hücrelerin yaklaşık sayısı (8 saat sıralama) | Kirletici | |
| Nüfus 1 | 1-9 spermatid Adımları | % 99-100 | 4000000 | 10 spermatid Adım |
| Nüfus 2 | 10-12 spermatid Adımları | % 95-98 | 1.000.000 | Spermatosit |
| Population 3 | 13-14 spermatid Adımları | % 99-100 | 800.000 | Spermatositler, 1-9 spermatid adımları |
| Nüfus 4 | 15-16 spermatid Adımları | % 98-100 | 1500000 | Spermatosit |
Tablo 1: Sıralama spermatid nüfusları ve kirleticiler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Spermatogenik hücreler her zaman seminifer epitel karmaşıklığı yanı sıra, in vitro kültür sınırlı bir başarı verilen araştırmaya zorlu oylandı. Yıllar boyunca, pek çok yaklaşım, çeşitli türlerden germ hücreleri geliştirildi saflaştırmak için. Percoll ya da sığır serum albümini gradyanları ile gravite arıtma kullanılarak sedimentasyon teknikler genellikle sağlam germinal hücrelerde daha iyi bir verim sağlar, ancak bu mayoz tetraploid hücre ve spermatidler 10 gibi bazı hücre tipleri arasında, uygun bir tanım yoksundur. Ayrıca, bu teknikler gerektiren hantal deneme yanılma olmadan çoğaltmak onları zor hale birçok laboratuvarlar için hazır olmayabilir (genellikle ev yapımı) özel cihazlar. Cihaz, genellikle, hücre canlılığını korumak için 4 ° C sıcaklıkta tutulur Bu yöntemler, aynı zamanda zaman alıcı, titreşime duyarlı ve elverişli değildir. Ne zaman başarılı, sedimantasyon yöntemleri ancak birkaç milyon saflaştırılmış canlı c sağlamaknüfus başına arşın. Bununla birlikte, elde edilebilir, hücre zenginleşme düşük düzeyde nadiren fazla% 80-90 saflıkta ulaştığında bu tekniklerin temel dezavantajı var. Moleküler analizler için büyük bir engel oluşturmaktadır, DNA, RNA ya da protein içeriği ile ölçüldüğü zaman, bazı durumlarda, diğer hücre tipleri 10-20% bir kirlenme mevcuttur.
Hücre popülasyonlarının saflığını geliştirmek isteyen, bazı araştırmacılar diğer yöntemlere ağırlık sedimantasyon birleştirdik. En etkili yaklaşımlardan birisi daha sonraki aşamalarını temsil eden farklı hücre popülasyonlarının sayısını sınırlamak için, olgunlaşmamış fareler kullanmaktır. Bir spermatogenez ilk dalga yararlanmak ve doğumdan sonra sıralı görünüm dayalı verilen bir farklılaşma aşamasına kadar germinal hücreleri içeren bir hücre hazırlık edinebilirsiniz. Bununla birlikte, bu yaklaşım, defin Birleştirilen eksikliği gidermez henüz başlangıç malzemesinin sınırlı miktarda telafi etmek için daha fazla hayvan gerektirirsedimantasyon yöntemleri ition. Buna ek olarak, bu tip bir yaklaşım pratik gibi spermatidler gibi daha sonraki hücre tipleri için uygulanabilir değildir, ancak spermatogonia ve primer spermatosit ağırlıklı olarak kullanılır. Ayrıca, spermatogenez ilk dalgası olgun farelerin 11,12 bisiklet epitel biraz daha farklı özelliklere sahip hücreler liman olabileceğine dair bazı kanıtlar vardır.
Spermatogenezisin A vitamini senkronizasyonu da bu prosedür tedavi hayvanın testislerde bulunan aşamaların sayısını daraltır olarak germinal hücre saflaştırma iyileştirmek için kullanılmıştır. Ancak, bu işlem çoğunlukla farelerde 13,14 bildirilen bazı başarı ile, sıçanlarda spermatogenezi eşitlemek için kullanıldı. Kendi deneyim, farelerde bir senkronizasyon vitamini zaman alıcıdır, nadiren tekrarlanabilir sonuçlar verir ve seminifer epitel hücre bütünlüğü konusunda endişe yükselterek zararlı yan etkiler oluşturur.
Other grupları başarıyla fare 15-18 germ hücreleri arındırmak için flow sitometri kullanıldı. Ancak, bunların hiçbiri yuvarlak spermatid adımlarla geçmiş spermatid nüfus saflaştırılması bildirdi. Bizim yolluk strateji moleküler çalışmalara yatkın önemli farklılaşma adımları temsil eden dört yüksek derecede saflaştırılmış haploid hücre popülasyonlarının arındırmak için izin verir. Bu yazıda anlatılan yöntemin temel kısıt sıralanmış hücrelerin sınırlı verimi olabilir. Saflık yüksek düzeyde bir şekilde kriteri hücrelerin sayısı pahasına elde edilmektedir. Ancak, biz protokole birkaç kritik tavsiyeler eklendi, sıralama koşullarının uygun olduğundan emin olun. Tüm bu teknik tavsiyeleri numarası ya da sıralanmış spermatid saflığını ya artırmayı hedefliyoruz. Örneğin, büyük ölçüde sıralama esnasında tüpler kaplı FBS kullanımı tüpleri sopa hücrelerin kaybı azalır. Ayrıca SYTO16 kullanılarak doyurucu bir konsantrasyonu daha kararlı populat ile sonuçlanan DNA boyama yoğunluğuna varyasyonları azaltıriyonları FACS araziler ve 8 saatlik sıralama süre boyunca daha iyi bir verim ve sıralı spermatidlerin saflığı görüldüğü gibi. Buna ek olarak, FACS sıralayıcı set-up için sağlanan teknik tavsiyeleri kesinlikle tüpleri toplama hücre takunya veya çapraz bulaşmayı önlemek göre sıralama genel verimliliğini artırmaya yardımcı olur. Seçenek olarak ise, girişler sonunda bazı çalışmalar için kabul edilebilir popülasyon saflık küçük bir azalma ile sonuçlanan, kriteri hücrelerin sayısını arttırmak için genişletilebilir. Ayrıca, SYTO16 ile lekelenmiş etanol sabit germ hücreleri 4 ° C'de çok stabildir ve sınırlı bir yolluk ayarlamaları ve denetimi ile fazla 8 saat süre ile sıralanabilir. Son olarak, sıralama birkaç gün herhangi bir uygulama için yeterli hücre sayısını elde etmek için bir araya getirilmiş olabilir.
Burada tarif edildiği gibi elde edilen akış kriteri Spermatidler deneyler çeşitli kullanılabilir. Bu hücrelerden gelen DNA, kolayca ticari genomik DNA saflaştırma kitleri kullanılarak ekstre edilmiş ve ortaya konabilirPCR 9 analiz eder ve yeni nesil sekanslama (veriler gösterilmemiştir) için uygun kalitede olması. Ayrıca, protein için kullanılabilir kriteri Spermatidler biz sıralama spermatidler yüksek saflıkta teyit etmek için safha spesifik belirteçler karşı çeşitli imünoblotlarının gerçekleştirilen 9 analiz eder. Biz sıralı spermatid hücre bütünlüğünü doğrulandı ve tüm popülasyonların çekirdek ve sitoplazma bozulmadan kalması bulundu. Bununla birlikte, 13-14 Spermatidler adımların bir kısmını ve kamçılı eksik adımlar 15-16 Spermatidler daha küçük bir oranda bulunan (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, yüksek ölçüde saf bir germ hücre popülasyonları, bu yaklaşımın proteomik ve genomik analizler, hem de diğer uygulamalara uygun olarak kullanılarak kriteri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Yazarlar Epifloresans mikroskobu ile ilgili teknik danışmanlık için Dr. Leonid Volkov ve Éric Bouchard teşekkür etmek istiyorum.
Finansal destek
GB Sağlık Araştırması (hibe # MOP-93.781) Kanada Enstitüleri tarafından finanse
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
- Sato, T., et al. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature. 471 (7339), 504-507 (2011).
- Sato, T., et al. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nat. Commun. 2, 472 (2011).
- Sun, X., Kovacs, T., Hu, Y. -J., Yang, W. -X. The role of actin and myosin during spermatogenesis. Mol. Biol. Rep. 38 (6), 3993-4001 (2011).
- Cheng, C. Y., Mruk, D. D. Cell junction dynamics in the testis: Sertoli-germ cell interactions and male contraceptive development. Physiol. Rev. 82, 825-874 (2002).
- Laiho, A., Kotaja, N., Gyenesei, A., Sironen, A. Transcriptome profiling of the murine testis during the first wave of spermatogenesis. PLoS ONE. 8 (4), (2013).
- Leduc, F., Maquennehan, V., Nkoma, G. B., Boissonneault, G. DNA damage response during chromatin remodeling in elongating spermatids of mice. Biol. Reprod. 78 (2), 324-332 (2008).
- Meistrich, M. L., Mohapatra, B., Shirley, C. R., Zhao, M. Roles of transition nuclear proteins in spermiogenesis. Chromosoma. 111 (8), 483-488 (2003).
- Grégoire, M. -C., et al. Male-driven de novo mutations in haploid germ cells. Mol. Hum. Reprod. 19 (8), 495-499 (2013).
- Simard, O., et al. Instability of trinucleotidic repeats during chromatin remodeling in spermatids. Hum. Mutat. , (2014).
- Wykes, S. M., Krawetz, S. Separation of spermatogenic cells from adult transgenic mouse testes using unit-gravity sedimentation. Mol. Biotechnol. 25 (2), 131-138 (2003).
- Yoshida, S., et al. The first round of mouse spermatogenesis is a distinctive program that lacks the self-renewing spermatogonia stage. Development (Cambridge, England). 133 (8), 1495-1505 (2006).
- Moreno, R. D., Lizama, C., Urzúa, N., Vergara, S. P., Reyes, J. G. Caspase activation throughout the first wave of spermatogenesis in the rat. Cell Tissue Res. 325 (3), 533-540 (2006).
- Meistrich, M. L., Trostle-Weige, P. K., Van Beek, M. E. Separation of specific stages of spermatids from vitamin A-synchronized rat testes for assessment of nucleoprotein changes during spermiogenesis. Biol. Reprod. 51 (2), 334-344 (1994).
- van Pelt, A. M., de Rooij, D. G. Synchronization of the seminiferous epithelium after vitamin A replacement in vitamin A-deficient mice. Biol. Reprod. 43, 363-367 (1990).
- Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. J. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. , (2011).
- Kovtun, I. V., McMurray, C. T. Trinucleotide expansion in haploid germ cells by gap repair. Nature Genet. 27 (4), 407-411 (2001).
- Bastos, H., et al. Flow cytometric characterization of viable meiotic and postmeiotic cells by Hoechst 33342 in mouse spermatogenesis. Cytometry A. 65 (1), 40-49 (2005).
- Lassalle, B., Ziyyat, A., Testart, J., Finaz, C., Lefèvre, A. Flow cytometric method to isolate round spermatids from mouse testis. Hum. Reprod. 14 (2), 388-394 (1999).
