Abstract
小鼠精子细胞分化是用于生产的官能雄性配子具有完整基因组中的一个关键的工艺要发送给下一代。到目前为止，这种形态转变的分子研究受到阻碍，缺乏一种方法允许精子细胞分化为后续分析这些重要步骤，充分分离。因为在精子细胞进行染色质重塑一个奇特的增加，DNA荧光在这些细胞使用流式细胞仪的正常浇注较早尝试可能是困难的。基于这一观察，我们提供了一个简单的流式细胞术方案细节，让四个种群的小鼠精子细胞固定用乙醇可重放纯化，每个代表在核重塑过程不同的状态。富集的人口使用步骤的具体指标和形态准则确认。纯化的精子细胞，可用于基因组和蛋白质组IC分析。
Protocol
动物保健是按照舍布鲁克大学动物护理和使用委员会。
1.管子准备
- 细胞分选前一天，加1-2热灭活的胎牛血清（FBS）中的溶液至5毫升聚丙烯圆底管中，15毫升和50毫升聚丙烯锥形管。
关键的一步：确保在协议中使用的每个管涂层。
注意：FBS涂层防止生殖细胞粘到管壁。 - 慢慢地，管均匀使用旋转器以4°C到外套搭配O / N的反转。
- 第二天，通过倾析从包被的管中删除FBS中。
- *关键的一步：确保中的5毫升聚丙烯圆底管及用于细胞制备的15和50毫升管（协议步骤2.1至2.11）被完全清空FBS，以防止煽动（侧流也就是不精确的偏差）。使用P200的吸管去除FBS。
- 离开的FBS（约100-200微升）在5 ml的聚丙烯轮用于收集纯化的细胞底管小的残留量。
- *关键的一步：确保中的5毫升聚丙烯圆底管及用于细胞制备的15和50毫升管（协议步骤2.1至2.11）被完全清空FBS，以防止煽动（侧流也就是不精确的偏差）。使用P200的吸管去除FBS。
2.细胞的制备
- 用O 2 /异氟醚（归纳为5％，那么保持在2％），其次是二氧化碳窒息牺牲一只公鼠在麻醉下。
- 消费和解封装双侧睾丸和讳言与在500μl分类缓冲器到1.5毫升管的小剪刀。
- 冲洗生殖细胞从输精管通过温和上下吹打在1.5 ml管，先用截短100-1,000微升末端，然后用一个完整100-1,000微升小费。
- 使用40微米的细胞过滤一个过滤步骤删除碎片和团块，收集滤液放入50ml锥形管上一个iously涂上FBS的第1步。
- 与排序缓冲高达3毫升的总体积和传递滤液进入的15毫升锥形管先前在步骤1涂覆洗过滤一次。
- 添加16微升50毫摩尔EDTA pH值为8每个细胞悬浮液的毫升（48微升3毫升），以便获得0.8 1mM EDTA的最终浓度。
- 要修复的生殖细胞，用10ml的移液管轻轻搅动（涡流以低速），这将产生一个乳白色悬浮液慢慢加入3倍体积冰冷的100％乙醇。
关键的步骤：慢慢加入乙醇是至关重要的，重要的是保持细胞制剂的完整性。我们注意到，迅速加入乙醇导致造成分拣效率的大幅度下降细胞溶解。对于3 ml的细胞悬浮液，9毫升乙醇应在大约1分钟加入。 - 孵育细胞在冰上15分钟，偶尔搅拌颠倒。
- 在800 XG 5分钟离心细胞悬液，并取下透明上清。
- 轻轻悬浮在2ml排序缓冲器的固定生殖细胞。
- 加入4微升SYTO16 DNA染料（在DMSO 1mM的溶液）并孵育至少30分钟（避光）。
注意：最佳排序结果是使用SYTO16，因为它是一个可渗透DNA染料，很容易结合到精子细胞的高度压实的细胞核获得。
3.细胞分选仪设置
注意：在这里，一个4激光器（405纳米 - 紫色，488纳米 - 蓝色，561纳米 - 黄绿色，633纳米 - 红）20参数BDFACSAria III细胞分选仪被使用。在BD FACSDiva 6.1.3软件用于可视化和分析数据。的设置可以根据所用分拣机的类型而变化。
- 通过运行70％的乙醇作为流体关机过程之前排序（“流式细胞仪”软件中的菜单）在鞘液消毒的FACS分拣机。该软件的工具栏中选择“流式细胞仪”，然后选择“射流SHutdown“。按照由过程中提到的步骤。
- 制备和筛选的1×PBS用0.22微米的过滤器，以便消除任何晶体和污染物。填充鞘罐在罐的内侧上部焊接线。
- 启动软件并登录。启动FACS分拣机之前分拣预热激光器至少30分钟。运行两个流体启动过程来冲洗掉乙醇从流体。该软件的工具栏中选择“流式细胞仪”，然后选择“流控启动”。遵照过程中提到的步骤。
注：此射流恢复正常鞘液（1X PBS）。 - 清洁排序块和偏转板，用蒸馏水彻底干燥。超声处理一个100微米的喷嘴在超声处理浴中放置在蒸馏水的试管2分钟。彻底擦拭喷嘴。
- 插入100μm的喷嘴进入流动池和喷嘴锁定杆顺时针转动到12HR的地位。将外皮压到20 psi。
- 打开流和调整幅度，以获得目标值的频率（约30），1滴（约150）和Gap（约12），并建立了稳定的液滴断离模式（几个卫星滴）。关闭衰减。
- 确保流是直的，并通过改变所述排序块的角度击中废物抽吸器的中心。注：在10psi一个130微米的喷嘴进行了测试，并没有明显的差异。
- 设置激光延迟为0的蓝色，-77.39为红，37.33为紫色和-39.85为黄绿色激光器。
- 集区域扩展到1.14为蓝，1.0为红，0.75紫色和0.96的黄绿色激光器。
- 使用测试排序（在软件的“侧流”窗口），请确保侧流不煽动。在“侧流”窗口，调整每边流的电压滑块，使他们击中了MIDDLË测试集管。如果中心流不紧，调整2 次 ，3 次和4 次下跌的设置来限制中心流。
- 启动流式细胞仪设置和软件（“流式细胞仪”菜单）追踪（CS＆T）的应用程序。
- 使用流式细胞仪的设置和跟踪珠粒在每350微升1滴自动化使用制造商的说明细胞仪性能的表征和跟踪。
- 退出CS＆T的应用程序。应用CS＆T的设置，确保流参数仍允许一个稳定的液滴断离的模式，并打开甜蜜点按钮，在制造商的说明书中描述（在“断离窗”）。
- 优化利用荧光珠的投递延迟值（见表材料 ）。
- 在保持器安装在收集管中。打开排序块门。在“侧流”窗口中，开启电压，然后选择“测试排序“，然后单击吸气抽屉按钮，打开抽屉，并有机会获得收集管。
- 优化侧流，以便它们进入该管的中心。根据需要调整值和滑块。
- 关闭排序块门，确保调整千分表以获得中央的亮珠点。取消选择废抽屉，测试排序和电压。取出收集管。
- 根据制造商的指示优化下降延迟。
- 简单地说，撼动珠药瓶大力稀释1滴珠0.5毫升的PBS。
- 使用制造商的说明，设置使用该软件提供的投递延迟实验模板下降延迟。另外，使用自动删除延迟功能设置下拉延迟。
- 加载的荧光珠的管和调节流速直至该阈值速率是〜3000至4000次/秒。设置排序精度“初始”和最后立法院“微调”中的“排序布局”窗口。选择滤光器和排序珠。调整投递延迟，直到〜100％被分拣到左边。
注意：该步骤是关键的，以确保感兴趣排序细胞分化成的侧流。所述珠和滤光器被用于实现接近100％的微滴的偏差。
- 放置FSC 1.5 ND（中性密度）滤光片在FSC检测器模块的左端。将窗口扩展到2.00微秒和FSC面积比例为1.00（在“激光”选项卡中的“流式细胞仪”窗口）。
- 在装入样品管，放置50μm的样品过滤器线在样品线的末端，以避免结块。要做到这一点，选择在“流式细胞仪”菜单中的“更改样品过滤器”。
- 测试该样品流体的组成，以实现良好的分离，而不侧流之间扇形并防止细胞粘到polypropyle东北管。
- 装入样品管，打开偏转板，然后选择“测试类”与抽屉关闭。如果发生分离没有太多的扇形看一边流。
注意：范宁可能是由于在样品缓冲液中的高蛋白质浓度。
- 装入样品管，打开偏转板，然后选择“测试类”与抽屉关闭。如果发生分离没有太多的扇形看一边流。
- 装载样品管进入FACS仪器。选择300rpm的样品搅拌和4℃的样品温度。选择“获取仪表板”，“采集数据”。
- 如果需要的话，稀释样品以达到一个适当的事件速率至最大5,000个事件/秒（以3.0的最大流量）。严格遵守这些限制，以维护选细胞的纯度。
- 为了分析，将细胞进行排序，优化FSC阈值，以消除碎屑而不与所研究的总体干扰。在对数标度，调整光电倍增管（PMT）探测器与三十零分之五百三十○滤波器的电压，以便使肯定的总人口的荧光信号的比例内配合，和栅极上的阳性群体（图1，门1）。
- 生产前向散射区域（FSC-A）/侧面分散区域的SYTO16积极的人口（SSC-A）的情节和调节FSC-A约110伏的线性度，和SSC-A约150V的在对数标度的可视化所有的事件，同时排除非常大的细胞和细胞聚集。
- 在“排序布局”窗口中，将“排序精度模式”到“4路纯度”（产量面膜：0，纯度面膜：32，相面膜：0）。从“目标活动”菜单进行连续排序选择“连续”。
- 添加种群在对应于管中的字段进行排序（在“排序布局”窗口）。地方人口在中间较高频率和那些与在端部较低的频率。设置电压板2500五，在整理，保持样品收集牛逼冰上ubes。
4.细胞分选
- 随即排序前，用一个事先涂5毫升聚丙烯50微米的过滤器圆底管过滤器单元。
- 1-2毫升分类缓冲器的广泛冲洗过滤器。
- 使用488纳米激光装备细胞分选仪按照图1中详述的门控方案排序固定的生殖细胞。在收集事先涂在第1冰上5毫升聚丙烯圆底管纯化馏分。
- 确保100-200微升的FBS的被保持在收集管，以避免在分选的细胞在管壁的粘附。
- 确保SYTO16的浓度是饱和的，以避免在分拣期间荧光的波动。 SYTO16是饱和的时，有细胞染色强度中的所述的Alexa Fluor 488参数（DNA染色）中的排序的图形没有进一步的变化。如有必要，添加1微升SYTO16至分拣管达到饱和。
- 显示器上显示以下参数的图形总事件：事件VS的Alexa Fluor 488-A的数量。
- 与门1选择阳性DNA染色细胞， 如图1。
- 显示单元从1号门上使用的SSC-A对FSC-A作为参数的图形
- 与门2选择细胞，显示出在图1中。
- 显示单元从2号门上使用FSC-A对的Alexa Fluor 488-A作为参数的图形。
- 选择单元格与5号门和6号门上的门2的图形，如显示在图1中。
- 另5号门和6号门上显示使用的Alexa Fluor 488-W VS的Alexa Fluor 488-A作为参数的图形。
- 选择精子步骤1-9精子在5号门的图形和精子步骤10-12精子细胞在6号门图形，显示在图1中。
- 显示使用FSC-A对的Alexa Fluor 488-A作为参数，从1号门的细胞上的图形
- 与门3和门4选择细胞，表明在图1中。
- 另外3号门和4号门显示使用的Alexa Fluor 488-W VS的Alexa Fluor 488-A作为参数的图形。
- 选择精子步骤13-14精子在3号门的图形和精子步骤15-16精子细胞在4号门的图形，如显示在图1中。
- 显示单元从1号门上使用的SSC-A对FSC-A作为参数的图形
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Representative Results
使用流式细胞仪门控策略
图1表示了流式细胞用于四个高纯度精子细胞种群进行排序选通策略。简而言之，将细胞与阳性DNA染色（的Alexa Fluor 488-A）的第一个带门从精子1.精子细胞的步骤1-12被选择（栅极2）上选择一个点图表示granulosity（SSC-A）与大小（FSC -A）从门1。然后，从精子的精子细胞的步骤1-9和精子步骤10-12可以彼此根据DNA染色强度的变化来分离（盖茨5和6）。从精子的精子细胞的步骤13-14和15-16是直接从阳性染色细胞上选择一个点图表示大小（FSC-A）对DNA染色（的Alexa Fluor 488-A），（盖茨3和4）。所有分类的人群被重新定义的Alexa Fluor 488-W VS的Alexa Fluor 488-A斑点杂交增加 IR纯度。
纯化方案通过荧光显微镜验证
图2代表精子细胞通过流式细胞术所划分种群DAPI染色。在精子形成步骤1-9精子细胞显示圆形精子细胞和精子的步骤9精子的椭圆形核的典型的圆形核。在精子形成步骤10-12精子细胞表现出较大的钩状伸长核。精子步骤13-14和15-16精子具有类似的形核，但在DNA染色强度，这使得它们的排序略有不同。还确定使用特定的生物标志物作为在先前的研究9中描述的分化步骤的不同排序的种群和纯度。排序精子细胞群的纯度示于表1中。
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图1.详细的门控策略，以超精细胞群体进行排序。用于排序精子浇注战略示意图步骤1-9精子，步骤10-12精子，步骤13-14精子细胞和精子14-16步同时用488纳米激光装备细胞分选仪。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.排序精子细胞通过荧光可视化。排序精子细胞是cytospined在显微镜玻片上，用DAPI染色，并用落射荧光显微镜用适当的过滤器的DAPI可视化并配有CCD钙梅拉。细胞示于倒灰阶。酒吧= 20微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
| 在大多数细胞类型观察 | 纯度 | 细胞大约数（8小时排序） | 污染物 | |
| 人口1 | 步骤1-9精子 | 99-100％ | 4000000 | 第10步精子 |
| 人口2 | 步骤10-12精子 | 95-98％ | 百万 | 精母细胞 |
| Population 3 | 步骤13-14精子 | 99-100％ | 800000 | 精母细胞，步骤1-9精子 |
| 人口4 | 步骤15-16精子 | 98-100％ | 1500000 | 精母细胞 |
表1：分类精子人口及其污染物。
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Discussion
生精细胞始终是具有挑战性的研究给出的生精上皮的复杂性， 以及在体外培养的有限的成功。多年来，许多方法来净化来自不同物种生殖细胞被开发。利用重力纯化用的Percoll或牛血清白蛋白梯度沉降技术通常提供完整生发细胞的良好的产率，但缺乏某些类型的细胞之间的适当定义如减数分裂四倍体细胞和精子细胞10。而且，这些技术需要特殊的装置（通常自制的）可能不容易获得许多实验室，这使得它们难以无需繁琐的试验和错误重现。这些方法也费时，对振动非常敏感且不方便作为装置通常保持在4℃，以保持细胞生存力。如果成功，沉淀法却提供了数百万纯净生活Ç每个人口ELLS。然而，细胞富集程度低，可以实现是这些技术的主要缺点，因为它很少达到超过80-90％纯度。在某些情况下，当由DNA，RNA或蛋白质含量，这是一个重大的障碍分子分析测定的10-20％的从其它细胞类型的污染是否存在。
当寻求改善细胞群的纯度，一些研究者已经联合重力沉降到其他的方法。其中最有效的方法是使用未成熟的小鼠，以限制不同细胞群体代表稍后阶段的数目。人们可以采取生精第一波的优势，获得包含生殖细胞达根据其出生后连续外观给定的分化阶段的细胞制品。然而，这种结合方法需要更多的动物，以补偿起始材料的量有限，但不能解决缺乏defin的银行足球比赛的沉淀法。此外，这种方法不能实际应用于购买细胞类型，例如精子，但主要用于精原细胞和初级精母细胞。此外，有一些证据表明，精子的第一波可能含有细胞的属性略有不同比成熟的小鼠11,12的循环上皮细胞。
精子发生的维生素A的同步也被用来改善生发细胞纯化作为此过程缩小了存在于治疗的动物的睾丸级的数目。但是，此过程被主要用于大鼠同步精子发生，取得了一些成功报道在小鼠中13,14。从我们自己的经验，维生素小鼠同步是费时，很少获得可再现的结果，并产生有害的副作用提高对的精上皮细胞完整性的关注。
OTHER基团成功地利用流式细胞仪从小鼠15-18净化生殖细胞。然而，他们没有报告精子细胞种群过去的圆形精子细胞的步骤的净化。我们的门控策略允许净化4个高度纯化的单倍体细胞群较重要的差异化措施经得起分子研究。本文所描述的方法的主要制约因素可以是分选的细胞的有限产量。纯度的高级别有所在分选的细胞的数目为代价获得的。但是，为了确保排序条件最优，我们增加了一些重要的建议，以协议。所有这些技术建议旨在增加的数量或排序精子细胞的纯度。例如，使用的FBS的期间大大排序涂层管减少细胞粘到管的损失。另外，SYTO16使用饱和浓度有助于减少DNA染色强度导致更稳定populat变化因为看到FACS图和更好的产量和排序的精子细胞的纯度超过8小时的整理期离子。此外，所提供的技术建议用于FACS分拣机设置有一定帮助，以增加通过避免在收集管细胞堵塞或交叉污染排序的整体效率。可替代地，门可扩展到增加分选的细胞的数量，最终导致一个小的下降人口纯度，这可以是可接受的一些研究。此外，染色SYTO16乙醇固定生殖细胞都在4℃下非常稳定，并且可以将其分类为超过8小时以有限选通的调整和监督。最终，排序的数天，可以合并，以获得细胞的足够数量的任何应用程序。
可用于多种实验得到这里所描述的流动来分类的精子细胞。从这些细胞中的DNA可以很容易地使用商业基因组DNA纯化试剂盒提取，并表现出成为适当的质量为PCR分析9和下一代测序（数据未显示）。排序精子细胞也可用于蛋白质分析9中，其中我们进行针对阶段特异性标记几个免疫印迹，以确认排序精子细胞的高纯度。我们验证了排序的精子细胞的细胞完整性，发现所有人群的细胞核和细胞质保持不变。然而，我们发现的步骤13-14精子细胞的比例和步骤15-16精子细胞是缺少其鞭毛比例较小（数据未显示）。因此，高纯度的生殖细胞群体使用这种方法适用于蛋白质组和基因组分析，以及其它应用排序。
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Acknowledgments
作者要感谢列昂尼德·沃尔科夫博士和Eric布沙尔他们关于荧光显微镜技术咨询。
经济支持
由健康研究（批＃MOP-93781），以GB的加拿大学院资助
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isoflurane | ABBOT | 05260-05 | For mouse anesthesia before euthanasia |
| Fetal bovine serum | Wisent | 90150 | For tube coating |
| 1x PBS | |||
| EDTA | BioShop | EDT | For sorting buffer preparation |
| HEPES | Sigma | H | For sorting buffer preparation |
| 100% Ethanol | Les alcools de commerce | 092-09-11N | For cell fixation |
| SYTO 16 | Life Technologies | S7578 | DNA staining |
| 5 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352063 | Sorted cells collection |
| 15 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 1500 | |
| 50 ml polypropylene conical bottom tubes | PROgene | 5000 | |
| TEC4 anaesthetic vaporizer | Ohmeda | 1160526 | For mouse euthanasia |
| CO2 gas tank | Praxair | C799117902 | For mouse euthanasia |
| O2 gas tank | Praxair | O254130501 | For mouse euthanasia |
| Homemade mouse gas chamber | For mouse euthanasia | ||
| 40 µm Falcon cell strainer | Corning Incorporated | 352340 | |
| 50 μm sample line filters | BD Biosciences | 649049 | |
| Vortex mixer | Labnet international, inc. | S0200 | For cell fixation |
| Dynac centrifuge | Clay Adams | 101 | |
| Celltrics 50 µm filters | Partec | 04-004-2327 | |
| 488 nm laser-euipped cell sorter | BD Biosciences | FACSAria III | |
| Accudop Fluorescent Beads | BD Biosciences | 345249 | |
| Sorting Buffer: 1x PBS, 1 mM EDTA pH 8.0, 25 mM HEPES pH 7.0, 1% FBS | FBS is heat-inactivated. Make fresh solution, 0.22 μm filtered and keep at 4°C. |
References
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