Summary
Primära Sertoliceller krävs för att studera testikel-immun privilegium, signaltransduktion under inflammation eller infektion, och utnyttjande av deras immun egenskaper. Här beskriver vi en enzym-baserat protokoll för isolering av höggradigt renade primära Sertoliceller och peritubulära celler från rått testiklar.
Abstract
Testiklarna, och i synnerhet hangamet utmanar immunsystemet på ett unikt sätt, eftersom differentierade spermier först visas vid tidpunkten för puberteten - mer än tio år efter införandet av systemisk immuntolerans. Spermatogenescykler celler uttrycker ett antal proteiner som kan ses som icke-själv av immunsystemet. Testiklarna måste då kunna etablera tolerans mot dessa neo-antigener, å ena sidan, men ändå kunna skydda sig mot infektioner och tumörutveckling å andra sidan. Därför testiklarna är en av ett fåtal immun privilegierade platser i kroppen som tål främmande antigener utan att framkalla en skadlig inflammatorisk immunsvar. Sertoliceller spelar en nyckelroll för upprätthållandet av detta immun privilegierad miljö av testiklarna och även förlänga överlevnaden av cotransplanted celler i en främmande miljö. Därför primära Sertoliceller är ett viktigt verktyg för att studera immun förmånen att testikeln som inte kan vara easily ersättas med etablerade cellinjer eller andra cellulära modeller. Här presenterar vi en detaljerad och omfattande protokoll för isolering av Sertoliceller - och peritubulära celler om så önskas - från rått testiklar i en enda dag.
Introduction
Testiklarna producerar manliga könsceller och könshormoner, det vill säga, androgener. Orgeln är sammansatt av två avdelningar. I interstitialrummet representerar att ungefär 10-12% av den totala testikelvolym 1, steroid sker inom Leydigceller. Det rörformiga facket utgör ungefär 60-80% av den testikelvolymen 1 och innehåller könsceller och två typer av somatiska celler - peritubulära celler och Sertoliceller. Testiklarna delas av bindväv septa i 250-300 lobules, vardera innehållande 1-3 mycket invecklade sädeskanalerna. Dessa tubuli är omslutna av en basal membran, ett ark av kollagen, och ett periferiskikt av peritubulära celler (Figur 1A).
Den germinala epitel är belägen på den luminala sidan av basalmembranet. Sertoliceller är stora avlånga celler som spänner över hela embryon epitel från basalmembranet till lumen. De är starkt ATTvärkte till basalmembranet och bildar en sammanhängande cellulär ark genom basolaterala organiserade tight junctions som täpper till stilbildande epitel från interstitium och representerar blodtestikelbarriären. Sertoliceller har framträdande cytoplasmiska utsprång och förgreningar som gör det möjligt för dem att komma in i tät morfologiska och funktionella kontakt med en artspecifik men konstant antal könsceller. Diploida embryon stamceller föröka sig och differentierar till spermatogonier.
Under meios I kortlivade tetraploida spermatocyter genereras som utvecklas ytterligare i fyra haploida spermatider under meios II. Alla könsceller är sammankopplade genom cytoplasmatiska bryggor så att de bildar ett cellulärt nät. Den huvudsakliga händelse under mognaden av spermatider är extrudering av stora delar av cytoplasman och bildar resterande organ, i en process som kallas spermiogenesen. Rest kroppar fagocyteras av Sertoliceller. Sena spermatider frigörs sedan in ide rörformiga lumen och transporteras till bitestiklarna för ytterligare mognad. Sertoliceller och könsceller verkar ömsesidigt samordna spermatogenes topografiskt och funktionellt.
Framställning av enskilda testikelcelltyper började nästan ett sekel sedan när små testikel bitar odlades och celltyper identifieras genom mikroskopi 2. Genom noggrann dissektion av tubuli efter öppning tunica albuginea använder spetsig pincett var det senare möjligt att separera rörformiga och mellanliggande fack 3. 1975 introducerade Welsh och Wiebe en kollagenasbehandling för att befria de tubuli från att vidhäfta interstitiell vävnad och en pankreatin behandling för avlägsnande av den yttre peritubulära cellskiktet 4. Från tidigt unga omogna råttor (cirka 20 dagar gamla) hade använts i vilken Sertolicellerna utgör en stor del av den rörformiga cellpopulationen eftersom spermatogenes inte har börjat ännu. I den här åldern råtta Sertoli-celler att upphöra att dela sig, och tight junctions mellan grannceller bildar så att blod-testikelbarriären är etablerad 5.
Oberoende av Welsh och Wiebe Dorrington et al. Infört en kombination av trypsin och deoxiribonukleas följt av soybeen trypsininhibitor och kollagenas behandling som publicerades samma år 6. Båda grupperna har också använt mekanisk kraft (ritning de spjälkade tubulära fragment upprepade gånger genom en sprutnål eller en pasteurpipett respektive) i syfte att producera en homogen cellsuspension för plätering som innehåller cirka 70% Sertoliceller. Efter 3 dagar i odling, med användning av ett medium som är serumfritt, ökar den procentuella andelen av Sertoliceller till cirka 90%. Detta kan till stor del hänföras till döden av kontaminerande könsceller. Rest peritubulära celler (PTC), dock hålla stadigt fastsatt via deras extracellulära matrisen. PTC, men inte Sertoliceller, är kända för att producerafibronektin som kan fungera som ett markörprotein för att uppskatta förorening med PTC. Därför Tung et al. motiverat att en ytterligare hyaluronidas behandling kan förbättra renheten av Sertoli cellfraktionen 7. I själva verket kunde de visa att en ytterligare behandling kunde minska föroreningen av PTC cirka 20 gånger, vilket blir särskilt tydligt när i jämförelse ett seruminnehållande medium används för odling renade Sertoliceller. Från och med då det förbättrade förfarandet enligt Tung et al. blev den rådande protokollet och i stor utsträckning används av andra stora grupper inom åtta (Figur 1B).
Under kollagenas behandling majoriteten av PTC frigörs och kan isoleras i parallellt med Sertoliceller. Medan PTC kraftigt föröka och inte svarar på follikelstimulerande hormon (FSH), do Sertoliceller inte genomgå mitos längre och svara på FSH genom karakteristiska morfologiska förändringaroch en ökning av cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) koncentration 9. Mycket liknande enzymatiska digereringsprotokoll kan användas för isolering av primära Sertoliceller från andra djur som människa 10, mus 11,12, sibirisk hamster 13 eller jak 14. För avlägsnande av stora mängder av kontaminerande könsceller en hypoton chock kan användas vid slutet av isoleringsförfarandet 15. Detta gör också att en effektiv isolering av Sertoliceller från vuxen råtta testiklar 16. En berikad Sertolicellen suspension kan också separeras från könsceller genom plätering av suspensionen på lektin skålar belagda med Datura stramonium-agglutinin 17. Endast Sertoliceller och några rest PTC följa lektin plattorna.
Primär Sertoli cellkulturer, främst från råtta har använts initialt för att undersöka känslighet för hormoner eller upprättandet cellinjer som mus Sertolicellen line TM4 18. Denna cellinje har undersökts i mer än hundra studier fram till idag. I en translationell tillvägagångssätt Sertoliceller har använts för immunskydd av samodlade celler och vävnader som i co-transplantation av främlings- eller allogena pankreasöar för långsiktig graft överlevnad utan systemisk immunsuppression 19. Isolerade Sertoliceller har också använts i samarbete kultur experiment för att studera epitel-mesenkymala (Sertoliceller - PTCc) och somatisk-könsceller (Sertoliceller - könsceller) interaktioner 20, 21. Nyligen primära Sertoliceller har använts för att undersöka uttryck av Toll-liknande receptorer och utsöndringen av proinflammatoriska cytokiner liksom signaltransduktionskaskader leder till cytokinexpression efter infektion med icke-patogena och uropatogen E. coli 22. Andra nya undersökningar använde Sertoliceller för att studera testikelimmun privilege 23 och visade att testosteron förbehandling undertrycker LPS-inducerad inflammatoriskt svar 24.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Animal Ethics Statement
Experiment som beskrivs här utfördes enligt riktlinjer Regierungspräsidium Giessen, Tyskland, som kommunen och bekräfta den tyska uppförandekoden för skötsel och användning av djur för försöksändamål (Tillstånd nr. GI 20/23 Nr A 31 / 2012).
2. Beredning av Media, Enzymlösningar och djur
- Bered 1% jod alkohol genom att lösa 1 g jod i 100 ml etanol.
- Förbereda 2x 500 ml Dulbecco's fosfatbuffrad saltlösning (PBS) utan Ca2 + och Mg2 + kompletterat med vardera 7,5 ml D-glukos (100 g / liter) och 5 ml 100x penicillin / streptomycin stamlösning (15 mg / ml D -glukos, 50 U / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin slutlig).
- Supplement 1x 500 ml Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium med 5 ml 100x penicillin / streptomycin stamlösning (50 U / ml penicillin och 50 | ig / ml streptomycin final).
- Förbered en Trypsin-DNas I-lösning (2,5 mg / ml trypsin och 10 pg / ml DNas I) genom att tillsätta 25 mg trypsin och 0,1 ml DNas I (1 mg / ml DNas I) till 9,9 ml PBS.
- Lös upp 50 mg Trypsininhibitor i 5 ml PBS under Trypsininhibitor En lösning (10 mg / ml). Lös upp 25 mg Trypsininhibitor i 10 ml PBS för Trypsininhibitor B-lösning (2,5 mg / ml).
- För en kollagenas-Hyaluronidas-deoxiribonukleas I (DNas I) Lös 10 mg kollagenas A (1 mg / ml slutlig), 10 mg Hyaluronidas (1 mg / ml slutlig) och 0,1 ml DNas I (1 mg / ml DNas I) ( 10 | ig / ml slutlig) i 10 ml PBS.
- Förbered en Hyaluronidas-DNas I-lösningen genom att tillsätta 10 mg Hyaluronidas (1 mg / ml slutlig) och 0,1 ml DNas I-lösning (1 mg / ml) (10 | ig / ml slutlig) till 9,9 ml PBS.
- Beställa Wistar-råttor i tid så att de är 19 dagar gamla på dagen för Sertoli cellisolering.
Obs: Den beskrivna protokollet är utformat för 10 råttor utan kan modifieras för minst 5 och högst 20 råttor.Volymerna av alla lösningar måste anpassas därefter. - Förbered Oil Red O stamlösning genom att lösa 0,35 g Oil Red O i 100 ml isopropanol. Stir O / N, filtrera genom 0,2 | j, m och förvara vid rumstemperatur under upp till ett år.
- Förbereda Oil Red O färgning lösning genom att blanda 6 ml Oil Red O av utgångslösningen med 4 ml vatten (3: 2). Efter 10-20 min filtrera genom 0,2 | j, m. Användning inom nästa två timmar.
- Bered en 4% (vikt / volym) formaldehydlösning i en ventilerad huv genom tillsats av 4 g paraformaldehyd pulver (PFA) till 80 ml 1 x PBS under omrörning försiktigt. Värm till ~ 60 ° C, tillsätt 1 ml av 1 M NaOH och fortsätt omrörningen tills paraformaldehyd är upplöst. Låt lösningen svalna till RT, justera pH till 7,4 med 1 M HCl och volymen till 100 ml med 1 x PBS. Filtrera lösningen (0,45 ^ m) och använda färsk eller förvara i alikvoter vid -20 ° C under flera månader.
Obs: Polymeriserad formaldehyd (PFA) depolymeriserar till monomer formaldehyd i vatten. Denna process ärkatalyseras av måttlig värme och en svagt alkaliskt pH. Förbered alla enzymlösningar nyligen och filter sterilisera (0,2 M) dem på användningsdagen. Om en annan tillverkare för ett enzym (se Material / utrustning tabell) används, noggrant justera dess koncentration / aktivitet.
I följande protokoll "en pipett" står för en serologisk pipett.
3. Beredning av sädeskanalerna
- Söva 10 manliga Wistar-råttor en och en i en torkapparat med användning av CO2 och en flödeshastighet som förskjuter åtminstone 20% av kammarvolymen per minut. Vänta tills andningen upphör, testa anestesi genom att klämma en fot pad, och om det inte finns någon reaktion avliva varje råtta genom halsdislokation. Dränera blod genom sektione halsvenen och halspulsådern (slidan carotica) under rinnande vatten. Desinficera buken genom att torka med 70% etanol.
- Använda pincett lyfta huden från buken muslarna och klipp ut en oval hud lob som sträcker sig från blygdbenssammanfogningen till bröstbenet (Figur 2A) och fliken det uppåt på bröstet. Nästa, ta magmusklerna och göra en medial snitt från blygdbenssammanfogningen till bröstbenet.
- Kläm buken med tummen från bäckenet uppåt för att pressa testiklarna ur de lägre bäckenet. Välj epididymal fettkudden (Figur 2B) med pincett för att dra upp testiklarna ytterligare. Skär sädesledare (figur 2B), lämnar tunica albuginea intakt, och samla alla testiklar i 20 ml PBS i en 50 ml koniskt rör (figur 2C).
- Efter uppsamling alla testiklar, desinficera dem genom tillsats av en lika stor volym (20 ml) av 1% (vikt / vol) jod i etanol. Vänd röret två gånger och dekantera supernatanten omedelbart. Snabbt tvätta testiklarna två gånger med 25 ml PBS vardera (figur 2D).
- Överför testiklarna till en petriskål innehållering 15 ml PBS (Figur 2E). Fatta varje testikel ordentligt med pincett i ena änden, gör ett litet snitt i tunica albuginea i den motsatta änden, och pressa ut tubuli använder slutna skärbladen som ett skrapverktyg.
Notera: De tubuli bör fortfarande bilda en kompakt testikel formad bunt med endast ett fåtal tubuli sträcker sig in i lösningen för att möjliggöra homogen enzymatisk digerering (Figur 2F). - Överföra de-inkapslad testiklar till en 100 ml med skruvlock flaska innehållande 10 ml Trypsin-DNas I-lösningen. Utföra digestion i ett skakande vattenbad vid 32 ° C (120 svängningar / min). Efter 4 min utvärdera tubuli med blotta ögat för spridning av tubuli. När tubuli börjar sprida i lösningen, stoppa matsmältningen omedelbart. Om det är nödvändigt, fortsätta inkubation under upp till två minuter.
- Stoppa trypsin digestion genom att tillsätta 5 ml av trypsininhibitor lösning A. Blanda lösningen genom att pipettera upp och ned 3-4 tidär att använda en 10 ml pipett och överföra den till en 50 ml koniska rör.
- Efter 5 min inkubation observera tubuli lösa per enhet allvar, försiktigt bort supernatanten med hjälp av 10 ml pipett från steg 3,6 och tillsätt 10 ml av trypsininhibitor B-lösning för att till fullo sluta trypsin matsmältningen. Resuspendera tubuli genom att pipettera upp och ned 2-3 gånger.
- I syfte att avlägsna kontaminerande interstitiella celler tvätta tubuli 9 gånger med 25 ml PBS vardera. Resuspendera tubuli i varje tvätt genom att använda en 25 ml pipett och tillåta dem att lösa per enhet allvar under 10 minuter. Använd alltid samma 25 ml pipett för pipettering PBS, resuspension och avlägsnande av supernatanten.
4. Borttagning / Isolering av peritubulära Cells (PTC)
- Överföra alla tubuli till en 100 ml med skruvlock flaska och tillsätt Kollagenas-Hyaluronidas-DNas I-lösning (figur 3A). Utföra digestion under 10 min i ett skakande vattenbad vid 32 ° C (120 svängningar / min).
- Pipett en droppe av suspensionen på ett objektglas och snabbt kontrollera tubuli under ett inverterat ljusmikroskop för rutin cellodling vid 100x förstoring. Om matsmältningen är inte tillräckligt avancerad fortsätta inkubation under ytterligare 2 min (inte räkna den tid som behövs för mikroskopisk kontroll).
Obs: Under detta steg alla tubuli får förkortas längd och tubuli kanterna bör bli grov (figur 3B och C). Ojämna kanter är vägledande för frisläppandet av peritubulära celler. - Överför suspensionen med rötas tubuli till en 50 ml koniska rör med hjälp av 25 ml pipett från steg 3,8. Tvätta 100 ml flaska med 10 ml PBS och lägga till tubuli i den koniska röret. Låt de spjälkade tubuli att reglera genom enhets allvar under 10 minuter, och försiktigt aspirera supernatanten, som innehåller PTC, med hjälp av 25 ml pipett igen, och överföra den till en ny koniskt rör. För aspiration av de sista några milliliter använder en 5 ml pipett i order för att förhindra överföring av tubuli.
- Tillsätt 20 ml RPMI 1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat fetalt bovint serum (FBS) till de uppsamlade tubuli supernatanterna, blanda och centrifugera vid 300 xg under 10 min vid RT utan att använda avbrott.
- Dekantera försiktigt supernatanten och suspendera pellet PTC i 20 ml RPMI 1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat FBS och frö 4 ml vardera på fem T75-kolvar innehållande 16 ml medium vardera. Inkubera vid 37 ° C i 5% CO 2 atmosfär (Figur 4A).
- På 3 rd odlingsdagen trypsinize de PTC och dela upp dem en: 2 på T75-kolvar innehållande 16 ml RPMI 1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat FBS vardera (utbyten 10 kolvar tot) (Figur 4B). Fortsätta inkubation vid 37 ° C i 5% CO 2 atmosfär.
- Den 5: e dagen av kultur trypsinize de PTC igen och platta dem på sex brunnar eller 24-brunnsplattor, beroende på experimentet(En T75 kolv per platta). Experiment kan utföras på dag sex.
5. Isolering av Sertoliceller (SCS)
- Resuspendera de sedimente tubuli från steg 4,3 noggrant i 25 ml PBS med hjälp av en 25 ml pipett och tillåta dem att lösa per enhet allvar för 12 minuter. Använd samma 25 ml pipett för pipettering PBS, resuspension av tubuli och borttagning av supernatanter. Upprepa tvätta 3 gånger (4 tvättar totalt).
- Efter den sista tvättn överföra de spjälkade tubuli till ytterligare 100 ml skruv-cap flaskan innehållande Hyaluronidas-DNas I-lösningen. Utföra digestion i ett skakande vattenbad vid 32 ° C (120 svängningar / min).
- Efter 5 min kontrollera tubuli igen genom Ijusmikroskopisk inspektion vid 100 gångers förstoring såsom beskrivs i steg 4,2.
Obs: Korta tubuli, rörformiga aggregat och frigjorda celler ska vara synliga (Figur 3D).- Tillåter de rörformiga aggregat sedimentera under 10 min, och aspirera supernatanten ossing en 25 ml pipett. Tvätta aggregerar 4 gånger med 25 ml PBS och en sedimenteringstiden för 10 minuter för varje tvättsteg (figur 3E).
- Tillsätt 20 ml av RPMI 1640-medium och passera suspensionen 10 gånger genom en 18 G-nål monterad på en 20 ml spruta. Undvika luftbubblor.
Notera: Pulling suspensionen in och ut genom nålen betraktas som ett pass. Avbrott och homogenisering av celler genom hydrodynamisk skjuvning är en standardteknik vid framställning av celler som tenderar att aggregera. Tidens celler genom en injektionsnål av små innerdiameter är osannolikt att ha en inverkan på deras funktionella egenskaper Figur 5C och D 25. Visar den normala ultra av renade Sertoliceller på dag fyra av kultur.- Pipett en droppe av suspensionen på ett objektglas och snabbt kontrollera tubuli under ett inverterat ljusmikroskop för rutin cellodling vid 10X förstoring om aggRegates är alla utspridda (Figur 3F). Filtrera cellsuspensionen genom en 70 | im cellfilter i syfte att erhålla en ren enkelcellsuspension i filtratet.
- Centrifugera filtratet i steg 5,4 vid 200 xg under 10 minuter vid RT utan att använda paus. Noggrant aspirera supernatanten med användning av en 25 ml pipett, och återsuspendera Sertoliceller i 40 ml RPMI 1640-medium (serumfritt).
- Blanda 100 l cellsuspension med 100 pl av Trypan Blue Stain och räkna celler med en Neubauer Förbättrad kammare. Justera cellkoncentrationen till 3 x 10 6 celler / ml enligt räkneresultatet. Seed 1 ml per brunn på en 6-brunnsplatta (= dag 1). Om en Oil Red O färgning (steg 6) planeras sätta ett täckglas i en eller ett fåtal brunnar innan sådd Sertoliceller.
Obs: Sertoliceller i suspension lösa snabbt så att röret ska kort skakas varje gång innan en cell alikvot tas med pipett. Tills dag fyra de stadigt ATTACH till underlaget. - För att avlägsna flytande eller adherenta könsceller på dag 4 (fig 4C) tvätta varje brunn på 6-brunnars plattor som används för plätering isolerade Sertoliceller (steg 5,6) med PBS (Figur 4D). Aspirera mediet, tillsätt 1-2 ml PBS till varje brunn och skaka 6-brunnars plattor horisontellt på ett bord med kraft men utan att spilla PBS. Upprepa tvätta 3 gånger och utföra samma tvättningsproceduren på dag 5 och 6 (Figur 4E).
Obs: På dag 4 Sertoliceller har stadigt fäst och visa en kullerstensliknande mönster under inverterat ljusmikroskop (Figur 4C). Experiment kan utföras från dag 7 och framåt.- (Alternativ för steg 5,7) för avlägsnande av flytande och vidhäftande könsceller utför en hypotonisk chock 3 dagar efter sådd på 6-brunnsplattor. Avlägsna mediet och tillsätt 1 ml av 20 mM Tris pH 7,5 som tagits direkt ur kylskåpet. Aspirera Tris-buffert efter 90-120 sek, men intesenare. Tvätta cellerna två gånger med PBS, och tillsätt 2 ml av RPMI 1640-medium (serumfritt). Eventuellt utföra experiment nästa dag.
Obs: Ju längre varaktighet hypoton chock är desto mer könsceller kan tas bort, men ju fler Sertoliceller vilse liksom. Den första PBS tvätt bör utföras snabbt, men med omsorg för att inte förskjuta några Sertoliceller. Direkt efter hypotonisk behandling talrika vakuoler av olika storlek kan observeras i cytoplasman genom faskontrastmikroskopi. Vakuoler försvinner inom några timmar efter hypoton behandling.
- (Alternativ för steg 5,7) för avlägsnande av flytande och vidhäftande könsceller utför en hypotonisk chock 3 dagar efter sådd på 6-brunnsplattor. Avlägsna mediet och tillsätt 1 ml av 20 mM Tris pH 7,5 som tagits direkt ur kylskåpet. Aspirera Tris-buffert efter 90-120 sek, men intesenare. Tvätta cellerna två gånger med PBS, och tillsätt 2 ml av RPMI 1640-medium (serumfritt). Eventuellt utföra experiment nästa dag.
6. Oil Red O färgning
- Utför alla steg vid RT. På dag 7 tvätta Sertoliceller odlas på ett täckglas (steg 5,6) med PBS två gånger och fixera dem med 10% formalin i PBS. Efter 10 min ersätta formalin med färsk lösning, och fortsätt fixering för en annan 60 minuter.
Notera: Alla lösningarna sättes till brunnen (er) med ett täckglas och aspireras innan nästa steg. Aspirera formalin, tvätta cellerna med vatten två gånger och tillsätt 60% isopropanol. Efter 5 minuter tillåter celler till lufttorka i några minuter. - Tillsätt 1 ml Oil Red O färgning lösning per brunn och inkubera under 10 min. Aspirera lösningen och tvätta cellerna omedelbart 4 gånger med vatten och montera täckglas i glycerol-PBS (9: 1). Ta bilder med en rutin ljusmikroskop (Figur 4F) ljusa fält.
7. immunofluorescensfärgning
- Tvätta PTC (från steg 4,5) eller Sertoliceller (från steg 5,5) odlas på ett täckglas med PBS två gånger och fixera dem med 4% PFA under 10 minuter vid RT.
- Inkubera med 5% BSA i PBS under 1 h vid RT. Kasta BSA-PBS-lösning och tillsätt färsk BSA-PBS-lösning innehållande aktin (glatt muskulatur) (för PTC) eller vimentin (för Sertoliceller) primär antikropp (utspädning 1: 100 för båda antikropparna) och inkubera vid 4 ° CO / N.
Anmärkning: Inkubation med BSA block icke-specifik bindning av den primära antikroppen. - Tvätta täckglas 3 gånger i 5 minuter i PBS-0,1% Tween 20 och inkubera med grön-fluorescerande färgämne konjugerat get anti-mus sekundär antikropp (spädning 1: 1000) vid RT under 1 h i mörker.
- Tvätta täckglas 3 gånger i 5 minuter i PBS-0,1% Tween 20 och montera dem i DAPI monteringsmedium.
8. Ultrastrukturell analys
- Tvätt Sertoli-celler (från steg 5,6) odlas på en 6 cm cellodlingsplatta med PBS och fixera dem i 2 timmar vid 4 ° C i en blandning av 2,5% glutaraldehyd, 2,5% paraformaldehyd och 0,05% pikrinsyra i 67 mM kakodylatbuffert ( pH 7,4) enligt Ito och Karnovsky 26.
- Utföra efter fixering i 1% osmiumtetroxid följt av en O / N inkubation i 0,3% uranylacetat löstes i 50 mM maleat-buffert (pH 5). Bädda prover i bädda media enligt standardprocedurer. Skär tunna sektioner, kontrast dem med blycitrat och undersöka med ett elektronmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrivna proceduren tillåter isolering av ca 12 x 10 7 Sertoliceller från 10 rått testiklar. 3 x 10 6 celler stryks per brunn på en 6-brunnsplatta så att sex till sju 6-brunnars plattor är tillgängliga för experiment på dag 7. Trypsin-DNas I digerering är det mest kritiska steget under Sertoli cellisolering. Om nedbrytning vid denna punkt går framåt för långt, förhållandet mellan könsceller / Sertoliceller kommer oproportionerligt öka fram till slutet. Under dag 3-6 av kultur är det viktigt att noggrant tvätta bort så många icke-vidhäftande eller löst bundna könsceller som möjligt. Som ett alternativ till omfattande tvätt under 4 dagar könsceller kan avlägsnas genom hypoton behandling på dag 3 27. En fördel med denna metod är att tiden för Sertoli cellodling hålls till ett minimum så att Sertoli cell-specifika funktioner är potentiellt bättre behålls än efter en längre tids kultur.
(figur 5B). Eftersom peritubulära celler har en stark proliferativ potential, har Sertoli cellkultur som skall utföras i frånvaro av serum. I närvaro av 10% skulle serum PTC utgör cirka 20% av alla celler efter 6 dagars odling, medan kan förväntas sin del att vara under 1% i frånvaro av serum 7. Praktiskt taget alla isolerade Sertoliceller är viabla såsom bedömdes genom Trypan-blåfärgning (ej visad). Omkring dag 7 av kultur de isolerade Sertoliceller är minst förorenade med könsceller och peritubulära celler (Figur 4), så att försök bör genomföras kring denna dag om det är möjligt. För god reproducerbarhet är det viktigt att upprepa experimentetär alltid på samma dag av kultur. Om transfektioner planeras de bör utföras på dag fyra eller fem, och cellextrakt bör göras på dag 5 eller 6.
Över åtminstone två veckor i serumfria betingelser Sertoliceller reagerar på FSH och producera mer androgen-bindande protein, plasminogenaktivator och transferrin på FSH-behandling. För längre kultur krävs ett matarskikt av peritubulära celler eller serum. Efter fyra veckor kulturer försämras, och celler lossnar från underlaget 7.
På dag 6 av kultur mest Sertoliceller har förvärvat lipiddropparna. I majoriteten av cellerna en enda stor vakuol har bildats (fig 5C och 5D). Den neutrala lipiden Innehållet kan enkelt visualiseras genom Oil Red O-färgning (Figur 4F).
I tillägg till Sertoli cel ls de borttagna PTC kan odlas samt (figur 4A och 4B). PTC från 10 testiklar ger fem T75-kolvar som kan förväntas för att bilda ett sammanhängande skikt efter 2 dagars odling. Liksom isolerade Sertoliceller nyisolerade PTC är förorenade av könsceller som kan till stor del avlägsnas genom passage. Kolvar split 1: 2 med standard trypsinisering så att 10 flaskor kommer att sammanflytande på dag 5 efter isolering. Renhet av isolerade PTC är> 95% och kan bekräftas med hjälp av α-glatt muskulatur aktin immunomärkning (Figur 5A). Från denna dag framåt PTC kan användas för experiment. En kolv är tillräcklig för ca en 6-brunnsplatta, och brunnar bör sammanflytande nästa dag. Celler kan passe många gånger, men försök bör utföras alltid på samma ställe i syfte att se till att cellerna uppträder på ett reproducerbart sätt.
ladda / 53389 / 53389fig1.jpg "/>
Figur 1. Morfologi av testiklarna och arbetsflödet av förfarandet. (A) En sektor av en sädeskanalernas tubuli med intilliggande interstitiell vävnad visas schematiskt. Sädeskanalerna omges av ett basalmembran (BM) och en periferiskikt av myoid peritubulära celler (PTC). Den germinala epitel är belägen på den luminala sidan av basalmembranet. Sertoliceller (SC), som spänner över hela germinal epitel är starkt bunden till BM och sammankopplade via basolaterala positionerad ockluderande korsningar representerar blod-testikelbarriären (BTB). Deras oregelbundna kärnan (N) visar en eller flera brottytor liknande fördjupningar och innehåller ett kärnsystemet. Könsceller (GC) är i intim kontakt med SC på alla stadier av deras utveckling. Mellanrumsutrymmet mellan tubuli innehåller Leydigceller (LC) och immunceller, såsom makrofager (M O) samt blodkärl (BV). Figuranpassad från Fijak och Meinhardt 28. (B) Workflow av förfarandet; Färgkodningen är som i (A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Testiklar från Wistar-råttor excideras och decapsulated. (A) Den bukhålan öppnas genom en längsgående incision som beskrivs i texten. En asterisk (*) indikerar epidydimal fettkudden. (B) Testiklar avlägsnas genom att skära sädesledare och (C) samlas i en 50 ml koniskt rör innehållande 20 ml PBS. När har samlats in alla testiklar de desinficeras i 20 ml 1% (vikt / vol) jod i etanol. För avlägsnande av jod de snabbt tvättas två gånger med 25 mlPBS vardera. (D) Testiklar efter första PBS tvätt. (E) Testiklar överförs till en petriskål (till höger), och sädeskanalerna trängs ut från den öppnade tunica albuginea genom slutna skärbladen (till vänster) som beskrivs i texten. (F) De decapsulated testiklarna fortfarande bilda en kompakt testikel formad massa med enkel tubuli framträdande. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Isolering av Sertoliceller. (A) Efter avlägsnande av interstitiella celler genom trypsin-DNas I matsmältning och tvätt 9x med PBS tubuli blir mobiliserade och ser ren. (B) Under kollagenas-hyaluronidas-DNas I-behandling peritubulära cellar från det yttre skiktet och könsceller frigörs. Tubuli får förkortas och få en grov utseende. (C) Tubular fragment efter tvätt 4x med PBS. (D) Hyaluronidas-DNas I-behandling frigör rest peritubulära celler såväl som könsceller. Tubuli får ytterligare förkortas och rörformiga aggregat bildas. (E) Tubular aggregat efter tvätt 4x med PBS. (F) Single Sertoliceller produceras genom att aggregaten 10x genom en 18G nål. Skala barer i (AE) = 200 nm, i (F) = 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Kultur av peritubulära celler (AB) och Sertoliceller (CF) och borttagning av contaminat ing könsceller. (A) Resuspenderade PTC från steg 4,5 ympades omedelbart och fotograferades nästa dag. (B) Efter att dela på dag tre förorening med könsceller minskar. (C) På dag 4 Sertoliceller visar en typisk kullersten-liknande mönster. Flytande och vidhäftande könsceller är synliga innan du tvättar med PBS. (D) Samma väl efter tvätt 3x med PBS. Antalet kontaminerande könsceller minskas. Tvättning tre gånger med PBS upprepas på dag 5 och 6. (E) På dag 6 av kultur i stort sett alla könsceller har tagits bort. Sertoliceller har bildat en unik ser cellskikt, och de flesta celler har förvärvat en enda stor vacuole. (F) Olje röd O färgning visar att dessa vakuoler är lipiddropparna innehåller i stort sett neutrala lipider. Skala barer i (AD) = 200 nm, i (E) = 50 pm och i (F) = 25 pm..jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. Immunofluorescens färgning. Färgning av renade primära peritubulära celler med aktin (glatt muskulatur) antikropp (A) och av Sertoliceller med vimentin antikropp (B). Inga kontaminerande celler är synliga i båda synfält. Skalstrecket i (A) och (B) = 10 | am. (C) och (D) Elektron mikroskopiska bilder av Sertoliceller efter 4 dagar i kultur. (C) Notera den nära kontakt av närliggande celler (pilspetsar) som leder till gatsten liknande mönster såsom visas i fig 4C. En enda lipiddroppe (L) ses i cytoplasman i varje cell. (D) mest förekommande organeller är mitokondrier (M) och Golgi-apparaten (G).Kärnan (N) innehåller en kärnsystemet (NC) och visar den typiska spricka liknande inbuktning. Skala bar i (C) = 1 pm och (D) = 0,25 um. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Guido Verhoeven och Ludo Deboel, Leuven, som var mycket hjälpsamma upprättandet isolering av primära Sertoliceller i Meinhardt arbetskraft i Giessen. Monika Fijak, Gießen, är känd för hennes hjälp med figur 1A och råd. Studier stöddes av Deutsche Forschungsgemeinschaft genom bidrag BH 93 / 1-1 (SB) och finansieringen av International Research Graduate College JLU Gießen (Tyskland) / Monash University (Melbourne, Australien) GRK 1871 (SB). Stöd erhölls även från ett bidrag på delstaten Hessen inom programmet "Landes-Offensive Zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz" (LOEWE) kallas "Männliche Infertilität bei Infektion & Entzündung" (MIBIE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Actin (smooth muscle) antibody clone 1A4 | Dako | M0851 | Monoclonal mouse anti human antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Albumin bovine fraction V Standard grade, lyophilized |
Serva | 11930.04 | Filter (0.45 µm) BSA solutions used for immunofluorescence. |
| Corning Cell Strainers 70 µm | Corning | 431751 | White color |
| Collagenase A from Clostridium histolyticum | Roche | 10103586001 | |
| DAPI mountant ProLong Gold Antifade | Life technologies | P-36931 | |
| D-glucose | Sigma | G8644 | 100 g/L |
| Dulbecco´s PBS without Ca2+/Mg2+ | Gibco | 14190-094 | |
| DNase I | Roche | 10104159001 | |
| Electron microscope | Zeiss | EM 109S | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan 2 | |
| Hyaluronidase from bovine testis | Sigma | H3506 | |
| Inverted light microscope | Olympus | CKX41 | Routine cell culture microscope |
| Mouse IgG / IgM (H+L) polyclonal secondary Antibody |
Life technologies | A-10684 | Alexa Fluor 488 conjugate |
| Oil Red O | Sigma | O0625 | Has replaced Sudan III and Sudan IV because of brighter color. |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Penicillin (5,000 U/ml)/ Streptomycin (5,000 µg/ml) |
Gibco | 15070-063 | 100x solution |
| RPMI-1640 | Gibco | 21875-034 | Contains 300 mg/L L-glutamine |
| Trypsin from porcine pancreas | Sigma | T5266 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Trypsin inhibitor from soybean | Sigma | T6522 | The Sigma product is considerably cheaper than the previously used BPTI (Aprotinin) from Roche. |
| Vimentin antibody (V9) | Sigma | V6630 | Monoclonal mouse anti pig vimentin antibody. Use 1:100 dilution for immunofluorescence. |
| Wistar WU rats | Charles River | Should be 19 days old on day of experiment. |
References
- Andrology. Male Reproductive Health and Dysfunction. Nieschlag, E., Behre, H., Nieschlag, S. , 3rd ed, Springer. (2010).
- Esaki, S. Über Kulturen des Hodengewebes der Säugetiere und über die Natur des interstitiellen Hodengewebes und der Zwischenzellen. Z. Mikrosk. Anat. Forsch. 15, 368-404 (1928).
- Hall, P. F., Irby, D. C., De Kretser, D. M. Conversion of cholesterol to androgens by rat testes: comparison of interstitial cells and seminiferous tubules. Endocrinology. 84, 488-496 (1969).
- Welsh, M. J., Wiebe, J. P. Rat sertoli cells: a rapid method for obtaining viable cells. Endocrinology. 96, 618-624 (1975).
- Vitale, R., Fawcett, D. W., Dym, M. The normal development of the blood-testis barrier and the effects of clomiphene and estrogen treatment. Anat. Rec. 176, 331-344 (1973).
- Dorrington, J. H., Roller, N. F., Fritz, I. B. Effects of follicle-stimulating hormone on cultures of Sertoli cell preparations. Mol. Cell. Endocrinol. 3, 57-70 (1975).
- Tung, P. S., Skinner, M. K., Fritz, I. B. Fibronectin synthesis is a marker for peritubular cell contaminants in Sertoli cell-enriched cultures. Biol. Reprod. 30, 199-211 (1984).
- Verhoeven, G., Cailleau, J. Testicular peritubular cells secrete a protein under androgen control that inhibits induction of aromatase activity in Sertoli cells. Endocrinology. 123, 2100-2110 (1988).
- Tung, P. S., Dorrington, J. H., Fritz, I. B. Structural changes induced by follicle-stimulating hormone or dibutyryl cyclic AMP on presumptive Sertoli cells in culture. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 72, 1838-1842 (1975).
- Teng, Y., et al. Isolation and culture of adult Sertoli cells and their effects on the function of co-cultured allogeneic islets in vitro. Chin. Med. J. (Engl.). 118, 1857-1862 (2005).
- Kohno, S., Ziparo, E., Marek, L. F., Tung, K. S. Murine Sertoli cells: major histocompatibility antigens and glycoconjugates. J. Reprod. Immunol. 5, 339-350 (1983).
- Dufour, J. M., et al. Sertoli cell line lacks the immunoprotective properties associated with primary Sertoli cells. Cell Transplant. 17, 525-534 (2008).
- Majumdar, S. S., Tsuruta, J., Griswold, M. D., Bartke, A. Isolation and culture of Sertoli cells from the testes of adult Siberian hamsters: analysis of proteins synthesized and secreted by Sertoli cells cultured from hamsters raised in a long or a short photoperiod. Biol. Reprod. 52, 658-666 (1995).
- Zhang, H., Liu, B., Qiu, Y., Fan, J., Yu, S. Pure cultures and characterization of yak Sertoli cells. Tissue Cell. 45, 414-420 (2013).
- Ziparo, E., Geremia, R., Russo, M. A., Stefanini, M. Surface interaction in vitro between Sertoli cells and germ cells at different stages of spermatogenesis. Am. J. Anat. 159, 385-388 (1980).
- Anway, M. D., Folmer, J., Wright, W. W., Zirkin, B. R. Isolation of Sertoli cells from adult rat testes: an approach to ex vivo studies of Sertoli cell function. Biol. Reprod. 68, 996-1002 (2003).
- Scarpino, S., et al. A rapid method of Sertoli cell isolation by DSA lectin, allowing mitotic analyses. Mol. Cell. Endocrinol. 146, 121-127 (1998).
- Mather, J. P. Establishment and characterization of two distinct mouse testicular epithelial cell lines. Biol. Reprod. 23, 243-252 (1980).
- Korbutt, G. S., Elliott, J. F., Rajotte, R. V. Cotransplantation of allogeneic islets with allogeneic testicular cell aggregates allows long-term graft survival without systemic immunosuppression. Diabetes. 46, 317-322 (1997).
- Fritz, I. B. Somatic cell-germ cell relationships in mammalian testes during development and spermatogenesis. Ciba Found. Symp. 182, 271-281 (1994).
- Whaley, P. D., Chaudhary, J., Cupp, A., Skinner, M. K. Role of specific response elements of the c-fos promoter and involvement of intermediate transcription factor(s) in the induction of Sertoli cell differentiation (transferrin promoter activation) by the testicular paracrine factor PModS. Endocrinology. 136, 3046-3053 (1995).
- Bhushan, S., et al. Uropathogenic Escherichia coli block MyD88-dependent and activate MyD88-independent signaling pathways in rat testicular cells. J. Immunol. 180, 5537-5547 (2008).
- Meinhardt, A., Hedger, M. P. Immunological, paracrine and endocrine aspects of testicular immune privilege. Mol. Cell. Endocrinol. 335, 60-68 (2011).
- Fijak, M., et al. Influence of Testosterone on Inflammatory Response in Testicular Cells and Expression of Transcription Factor Foxp3 in T Cells. Am. J. Reprod. Immunol. , 12-25 (2015).
- Mamidi, M. K., et al. Impact of passing mesenchymal stem cells through smaller bore size needles for subsequent use in patients for clinical or cosmetic indications. J. Transl. Med. 10, 229 (2012).
- Ito, S., Karnovsky, M. J. Formaldehyde-glutaraldehyde fixatives containing trinitro compounds. J. Cell. Biol. 39, 168-169 (1968).
- Galdieri, M., Ziparo, E., Palombi, F., Russo, M. A., Stefanini, M. Pure Sertoli cell cultures: a new model for the study of somatic-germ cell interactions. J. Androl. 5, 249-254 (1981).
- Fijak, M., Meinhardt, A. The testis in immune privilege. Immunol. Rev. 213, 66-81 (2006).
- Jegou, B. The Sertoli cell in vivo and in vitro. Cell Biol. Toxicol. 8, 49-54 (1992).
- Pineau, C., Le Magueresse, B., Courtens, J. L., Jegou, B. Study in vitro the phagocytic function of Sertoli cells in the rat. Cell Tissue Res. 264, 589-598 (1991).
- Ren, Y., Savill, J. Apoptosis: the importance of being eaten. Cell Death Differ. 5, 563-568 (1998).
- Ducray, A., et al. Establishment of a mouse Sertoli cell line producing rat androgen-binding protein (ABP). Steroids. 63, 285-287 (1998).
- Konrad, L., et al. Rat Sertoli cells express epithelial but also mesenchymal genes after immortalization with SV40. Biochim. Biophys. Acta. 1722, 6-14 (2005).
