Protocol
1. kemisk kobling af proteiner til polymerkugler
- Thiol-amin retningsbestemt kobling
Bemærk: Denne protokol er egnet til kobling af cystein-holdige proteiner til amin-funktionaliserede polymerperler, ved hjælp af sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butyrat (sulfo-SMPB) som tværbindingsmiddel (figur 1).
Figur 1. Tværbinding strategi, der anvendes til retningsbestemt thiol-amin kobling af proteiner til polymerkugler. Aminmodificeret polystyrenkugler aktiveres med sulfo-SMPB. Den maleimid reagerer med frie cysteiner til retningsbestemt par proteiner til perler. Klik her for at se en større version af dette tal.- Fremstilling af reagenser:
- Forbered PBS (100 mM natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) og autoklaver. Der fremstilles en 100 x stamopløsning (0,5 M eller 287 mg / ml i PBS) i TCEP (Tris (2-carboxyethyl) phosphin) umiddelbart før brug.
- Der fremstilles en 5 x stamopløsning (10 mM eller 4,58 mg / ml i dH2O) af sulfo-SMPB umiddelbart før brug.
- Der fremstilles en 10 x stamopløsning (500 mM eller 88 mg / ml i PBS, pH 7,0) af cystein umiddelbart før brug.
- Perler aktivering:
- Bland perlesuspensionen ved forsigtigt at vende og overføre den nødvendige mængde perlesuspensionen (f.eks 12 ml) i en steril 1,5 ml rør indeholdende 1 ml sterilt PBS, pH 7,0.
- Pipettér forsigtigt op og ned for at vaske perlerne og pellet ved centrifugering i en mikrocentrifuge (2 minutter ved 16.000 xg).
- Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette og udsmid. Resuspender pellet i perlen 1 ml frisk sterilt PBS og gentag vasketrinnet. Resuspender pellet i perlen 0,8 ml PBS.
- Tilsæt 200 ml frisk fremstillet 10 mM sulfo-SMPB, at give en endelig concentration af 2 mM.
- Inkubér perlesuspensionen i 1 time ved 25 ° C på et roterende hjul.
- Protein reduktion:
- Under inkubationsperioden for aktiveringstrinnet forberede protein til følgende koblingstrin så det umiddelbart kan sættes til de aktiverede perler.
Bemærk: Selvom dette trin reduktion ikke altid nødvendig for GST (Glutathion S-transferase) fusionsproteiner, anbefales det at sikre en høj koblingseffektivitet.- Kontroller proteinkoncentrationen og tilpasse det til den endelige koncentration, der kræves for koblingsreaktionen. Bemærk: 6 mM protein i PBS og et volumen på 1 ml normalt anvendes.
- Tilføj TCEP lager til opnåelse af en slutkoncentration på 5 mM. Inkubér opløsningen i 30 minutter ved stuetemperatur.
Bemærk: Reaktionsblandingen kan anvendes direkte til den følgende koblingsreaktion. - Tilbageholde en lille mængde (et par ml) af proteinopløsningen til bestemmelse af pro TEIN koncentration og beregning af koblingseffektivitet (se afsnit 2).
- Under inkubationsperioden for aktiveringstrinnet forberede protein til følgende koblingstrin så det umiddelbart kan sættes til de aktiverede perler.
- Protein koblingstrin:
- Pelletere aktiverede perler ved centrifugering (2 min, 16.000 xg i en mikrocentrifuge) og vaskes pelleten gang i 1 ml frisk sterilt PBS.
- Pellet resuspenderes i den fremstillede proteinopløsning (f.eks, 1 ml), at give den ønskede proteinkoncentration.
Bemærk: Proteinkoncentrationen under koblingen skridt vil afhænge af den gennemsnitlige koblingseffektivitet (se afsnit 2 til bestemmelse af koblingseffektiviteten) og den ønskede kobling densitet (som beregnet i 1.1.4.3). Effektiviteten er ca. 85% og den ønskede slutkoncentration 5 mM i 10 x perlesuspensionen, så proteinkoncentrationen under koblingen skridt bør være ca. 6 mm. - Beregn koblingstæthed ved hjælp af følgende formel:
jpg "/> hvor
ρ c koblingstæthed [antal proteinmolekyler / nm 2],
protein conc proteinkoncentration [mg / ml],
protein Mw protein molekylvægt [Da],
perle konc perlekoncentration [antal perler / L],
d perlediameter [nm 2]
Avogadro nummer - Brug koblingstæthed at beregne den gennemsnitlige ligand indbyrdes afstand:
- Inkubér protein-perlesuspensionen i 2 timer ved 25 ° C på et roterende hjul.
Bemærk: Nogleproteiner kan ikke være stabil ved stuetemperatur. I disse tilfælde kan reaktionen udføres ved 4 ° CO / N. - Deaktivere resterende aktiverede grupper på perlerne ved at tilsætte cystein lager til en slutkoncentration på 50 mM og inkubere suspensionen i 30 minutter ved 25 ° C på et roterende hjul. Pelletere kuglerne ved centrifugering (2 min, 16.000 xg i en mikrocentrifuge).
- Hold supernatanten til bestemmelse af protein koncentration og beregning af koblingseffektivitet (se afsnit 2).
- Vask perlen pellet to gange med 1 ml PBS og resuspender i 1 ml frisk PBS til opnåelse af slutproduktet.
Bemærk: Den ovennævnte protokol giver typisk 1 ml koblet protein, ved en slutkoncentration på 5 mM protein, som kan anvendes som en 10x lager til efterfølgende forsøg (se afsnit 3). - At fortsætte til afsnit 3 i protokollen, arbejde med 100 ml / ml perle lager, eller i en endelig koncentration på 500 nM protein. Bemærk: Et godt udgangspunkt for denne procedure vil være 2 × 10 12 perler / ml, hvilket resulterede i en gennemsnitlig koblingstæthed på 3 × 10 -4 proteiner / nm 2 eller en gennemsnitlig afstand på 57 nm på en perle på 2 mm diameter.
- Fremstilling af reagenser:
- Thiol-carboxy retningsbestemt kobling
Bemærk: Denne protokol er egnet til kobling af cystein-holdige proteiner til carboxyl-funktionaliserede polystyrenkugler. Carboxyldelen aktiveres først under anvendelse af 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) / N-hydroxysuccinimid (NHS), aminmodificeret og derefter tværbundet ved hjælp af sulfo-SMPB (figur 2).
Figur 2. Tværbinding strategi, der anvendes til retningsbestemt thiol-carboxyl kobling af proteiner til polymerkugler. Carboxylerede polystyrenperler først aktiveret med EDC og modificeret med NHS til dannelse af en semi-stabil NHS-ester. Efterfølgende amin-kobling af ethylenediamin resulterer i en fri amingruppe, som reagerer med sulfo-SMPB. Maleimid aktiverede perler kan derefter reagere med frie cysteiner til retningsbestemt par proteiner til perler. Klik her for at se en større version af dette tal.- Fremstilling af reagenser:
- Forbered PBS (100 mM natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,0) og autoklaver.
- Forbered en 100x bestand (0,5 M eller 287 mg / ml i PBS,) i TCEP umiddelbart før brug.
- Der fremstilles en 10 x stamopløsning (20 mM, eller 4 mg / ml i PBS) EDC (1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid) umiddelbart før brug.
- Der fremstilles en 10 x stamopløsning (50 mM, eller 6 mg / ml i PBS) NHS (N-hydroxysuccinimid) umiddelbart før brug.
- Der fremstilles en 5 x stamopløsning (10 mM eller 4,58 mg / ml i dH2O) af sulfo-SMPB umiddelbart før brug.
- Der fremstilles en 10 x stamopløsning (500 mM eller 88 mg / ml i PBS, pH 7,0) af cystein umiddelbart bnden brug.
- Perler aktivering:
- Bland perlesuspension ved forsigtigt at vende og overføre den nødvendige mængde perlesuspensionen (f.eks 12 ml) i en steril 1,5 ml rør indeholdende 1 ml sterilt PBS, pH 7,0.
- Pipettér forsigtigt op og ned for at vaske perlerne og pellet ved centrifugering i en mikrocentrifuge (2 minutter ved 16.000 xg).
- Fjern forsigtigt supernatanten med en pipette og udsmid.
- Resuspender pellet i perlen 1 ml frisk sterilt PBS og gentag vasketrinnet.
- Resuspender pellet i perlen 0,8 ml PBS.
- Der tilsættes 100 ml 10x EDC lager (2 mM slutkoncentration), og straks 100 ml 10x NHS stamopløsning (5 mM slutkoncentration) til perlesuspensionen.
- Inkubér perlesuspensionen i 30 minutter ved 25 ° C på et roterende hjul.
- Vask perler gang i 1 ml PBS og resuspender i 0,8 ml frisk sterilt PBS.
- Tilsæt 200 ml ethylendiamin, og incUbate perlesuspensionen i 1 time ved 25 ° C på et roterende hjul.
- Vask perler gang med 1 ml PBS og resuspender perlerne i 0,8 ml frisk PBS.
- Fortsæt fra punkt 1.1.2.4 (perle aktivering med sulfo-SMPB) som beskrevet i afsnit 1.1.2, og følg resten af protokollen beskrevet i afsnit 1.1 (Thiol-amin retningsbestemt kobling). Udfør protein forberedelse og protein koblingstrinene på en måde, identiske med dem, der er beskrevet i afsnit 1.1.
Bemærk: Den typiske koblingseffektivitet benytter denne protokol er lidt lavere i forhold til afsnit 1.1, således justere den oprindelige proteinkoncentration i overensstemmelse hermed at opnå den samme kobling densitet (ca. 75%)..
- Fremstilling af reagenser:
2. Bestemmelse af koblingseffektivitet
Bemærk: For at bestemme protein koncentrationen anvendes Bradford reagens 10 og kolorimetriske analyser som følger:
- Vend forsigtigt Bradford Reagens til e PÍ homogenitet af reagenset.
- Anvendelse af en 10 mg / ml BSA-stamopløsning, forberede protein standarder for koncentrationer fra 0,1 til 1,5 mg / ml BSA i buffer.
- 250 ml Bradford reagens til brønde i en 96-brønds plade. Forbered nok brønde for alle prøver, protein standarder og negative kontroller (buffer kun).
- Der tilsættes 5 ml proteinprøve (proteinstandarder eller puffer, til den negative kontrol) til reagenset i 96-brønds plade.
- Inkubér pladen på en orbitalryster ved stuetemperatur i 10 min.
- Mål absorbans ved 595 nm under anvendelse af en pladelæser.
- Generer en standardkurve BSA-koncentration versus A595 nm og bruge dette til at bestemme protein-koncentrationer i indledende og supernatant prøver.
- Beregn koncentrationen af koblet protein som følger:
- Beregn koblingseffektiviteten som:
00eq4.jpg "/>
3. Anvendelse af Bead-koblede adhæsiner i Konkurrence Analyser
- Forberedelse:
- Seed 1 ml pr brønd af Hela-celler i en koncentration på 150.000 celler / ml i en plade med 24 brønde dagen før konkurrencen assay, for at tillade cellerne at nå ca. 80% konfluens forud for start af forsøget.
- Oprette hver forsøgsgruppe tilstand i tre eksemplarer. Medtag brønde til negative kontroller (ingen bakterier tilsættes under konkurrencemæssige analyser), positive kontroller (kontrol perler koblet til fusion-tag kun tilsat under konkurrencemæssige analyser) og lysis kontroller (for cytotoksicitet eksperimenter).
- Inokulere en 5 ml marine LB (MLB) kultur med en frisk koloni af V. parahaemolyticus og vokse O / N ved 30 ° C, rysten.
- Forbered tilstrækkelig perle-koblede MAM, som beskrevet i afsnit 1 (kobling). Mulighed for 100 ml 10x perlerne per brønd.
- Konkurrence-assay:
- På dagen for den competition eksperiment, måle OD 600 af bakteriekulturen.
- Forbered infektion medier ved at fortynde bakteriekulturer i farveløse DMEM uden tilsætningsstoffer, præ-opvarmet til 37 ° C, indeholdende 10% vol / vol perlesuspension (enten adhesin-koblede perler eller kontrol-perler), til opnåelse af en MOI på 10. Forbered 1 ml / brønd og 10-20% overskud volumen pr prøve. Bemærk: Af ovennævnte betingelser (plade med 24 brønde, V. parahaemolyticus, MOI 10), den nødvendige mængde af O / N-kulturen, hvormed per brønd (ml / ml) beregnes som 3 / OD600 af kulturen. For eksempel vil 1 ml medium infektion typisk indeholde 100 ml perlesuspension, nogle få ml bakteriekultur og gøres op til 1 ml med farveløs, ikke-suppleret DMEM.
- Fjern gammelt medium fra brøndene og vask dyrkede Hela-celler ved tilsætning af 1 ml sterilt PBS forvarmet til 37 ° C til hver brønd.
- Fjern PBS og tilsæt 1 ml infektion medium per brønd. Også oprettet kontrol, ved at tilføje løsninger fortsaining kontrol-perler og bakterier (positiv kontrol) eller adhesin perler og ingen bakterier (negative kontroller) eller DMEM indeholdende 0,1% Triton X-100 (lysis kontrol, kun nødvendigt for cytotoksicitet målinger).
- Inkubér pladen i en vævskultur-inkubator ved 37 ° C i det ønskede tidsrum (f.eks 4 timer for cytotoksicitet målinger eller 1 time for vedhæftning målinger).
Bemærk: Både bakteriel adhæsion og cytotoksicitet på værtsceller kan anvendes som udlæsninger for effektiviteten af inhibering. Hvis tidspunkter af cytotoksicitet og vedhæftning målinger sammenfaldende, kan begge assays udføres under anvendelse af prøver fra samme godt, da cytotoksicitet bestemmes ved anvendelse af kultursupernatanten og vedhæftede analyser anvender prøver afledt fra den resterende cellelag.
- Cytotoksicitet målinger:
- På angivne tidspunkter (f.eks 4 timer efter infektion), fjernes tre gange 200 ml af hver 24 brønde og overførsel tilen 96-brønds plade.
- Spin plader med 96 brønde ved 1.500 xg 5 min og overføre 100 ml fra hver brønd i en frisk 96-brønds plade. Der tilsættes 100 ml af medier, der anvendes under infektion eksperimenter til friske brønde i 96-brønds plade i tre eksemplarer (disse vil blive anvendt som blindprøver).
- Udføre lactatdehydrogenase (LDH) release assay under anvendelse af en LDH cytotoksicitet afsløring kit og ved at følge producentens instruktioner.
- Kort fortalt beregne mængden af reagens nødvendig i trin på 25 (fx hvis 62 prøver skal måles, fyldes op nok reagens mix til 75 mm).
- For eksempel, for 100 prøver, blandes 11,25 ml reagens A med 250 pi reagens B. Inverter, ikke vortex at undgå skumdannelse.
- Sæt blandingen i et reservoir til at kunne pipetteres med en multi-kanal pipette. Tilsæt 100 pi reagensblanding til hver prøve.
- Inkuber plade ved stuetemperatur og læse absorbansen ved 490 nm på en pladelæser ved 10, 20, 30 min. Analyser datasættet for hvilke absorbansen af lysis kontrolprøven er høj, men stadig inden for det lineære område af pladelæser (typisk 2-3 absorbansenheder).
- Hurtig resultater som% cytotoksicitet, ved hjælp af følgende formel for konvertering:
- Måling af bakteriel adhæsion:
- På angivne tidspunkter (f.eks, 1 time efter infektion), fjerne mediet fra cellelaget.
- Vaskes cellelaget med sterilt, forvarmet PBS (mindst 3-4 vaske med 1 ml PBS hver) for at fjerne eventuelle un-bundne celler.
- Lyse værtsceller ved tilsætning af 1 ml af en steril 1% v / v Triton X-100 i PBS per brønd. Inkubér pladen ved 37 ° C i 5 minutter.
- Pipetteres hver prøve op og ned flere gange før overførsel af indholdet af hver brønd til at adskille 1,5-ml rør. Forbered 10-fold seriefortyndinger af prøveri sterilt PBS (fx bruge 100 ml prøve og 900 ml PBS).
- Plade 100 ml af hver prøve på MLB agar og spredt ved hjælp af en celle sprederen. Optimer som dilutions til pladen afhængig af bakteriestammer og tidspunkt. Bemærk: For den beskrevne forsøgsopstilling, 10 5 eller 10 6 gange fortyndinger giver et passende antal CFU'er.
- Pladerne inkuberes ved 37 ° CO / N og optælle bakterier ved kolonitælling.
Representative Results
V. parahaemolyticus adhæsinet MAM7 indeholder syv tandem pattedyr post celle (MCE) domæner involveret i erkendelse af vært overfladereceptorer. Vi brugte polystyrenperler koblet til rekombinant, oprensede fragmenter omfatter enten alle syv tandem MCE domæner (MAM7) eller kun den første MCE domæne (MAM1) for at teste evnen af disse materialer til at konkurrere med V. parahaemolyticus for værtscelle binding og den resulterende effekt af disse materialer som vedhæftning inhibitorer. Hela-celler blev inficeret med V. parahaemolyticus stamme POR1, og cytotoksicitet som følge af infektion in vitro blev evalueret efter 4 timer (figur 3). Behandling af Hela-celler med 0,1% Triton X-100 (positiv lysis kontrol) resulterede i fuldstændig cellelyse, ikke-inficerede celler udviste meget lave niveauer af cytotoksicitet. In vitro infektion af ubehandlede celler med POR1 resulterede i meget høje niveauer af cellelyse, og dette blev inhiberet af MAM7-coupled perler, men ikke MAM1-koblede eller GST-koblet kontrol-perler (figur 3).
Figur 3. Karakterisering af Vibrio parahaemolyticus induceret cytotoksicitet i epitelceller i kompetitive assays. Cellerne blev behandlet med V. parahaemolyticus (Vp), angivet med (+) eller ikke bakterier (-) i nærværelse af forskellige konkurrerende enheder (. comp) som angivet. Disse omfattede enten ingen comp. (-), MAM7 perler (MAM7), MAM1 perler (MAM1) eller GST kontrol-perler (GST). Som kontroller blev celler behandlet enten med Triton X-100 (Triton, lyse kontrol) eller efterladt uinficeret (uninf). LDH frigivelse efter 4 timer blev målt som beskrevet i afsnit 3, og resultater normaliseret til Triton kontroller (100%) og emner (0%) som beskrevet ovenfor. Resultater er middelværdier ± SEM fra tredobbelte eksperimenter. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tælling af V. parahaemolyticus bundet til enten ubehandlede HeLa-celler eller celler inkuberet med MAM7-, MAM1- eller GST kontrol-perler, afslørede, at MAM7-perler, men ikke MAM1- eller GST kontrol-perler udkonkurrere V. parahaemolyticus til fastgørelse til vært celleoverfladereceptorer (Figur 4).
Figur 4. Karakterisering af bakteriel fastgørelse under kompetitive forsøg. Hela-celler blev inficeret med V. parahaemolyticus POR2 (Vp +) i fravær (-) eller tilstedeværelsen af konkurrerende enheder som følger: MAM7 perler (MAM7), MAM1 perler (MAM1) eller GST kontrol perler (GST) (forb.). Bakteriel adhæsion blev målt efter 1 time, som beskrevet i afsnit 3. Resultaterne er gennemsnit ± SEM fra tredobbeltforsøg. Midler (FLTR i CFU / ml) er 2,3010 6, 1,5310 5, 2,0510 6, 2,1210 6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Adhæsiner koblet til fluoroformærkede perler resulterer i dannelsen af materialer, der efterligner bakteriel adhæsion til værtsceller og er effektive redskaber til cellulær billeddannelse (figur 5). Brug af MAM7-koblede fluorescerende blå perler, karakteriserede vi processen med MAM7-medieret binding til epitelceller. Fastgørelse af MAM7 til værtsceller resulterede i actin omlejringer og dannelse af stress fibre, som var co-visualiseret ved anvendelse af rhodamin-phalloidin til farvning for F-actin (figur 5B).
_upload / 53400 / 53400fig5.jpg "/>
Figur 5. Udarbejdelse og brug af fluorophormærket biomimetiske perler til billeddannelse formål. (A) Suspension af fluorescerende blå biomimetiske perler (højre rør, 10x materiel) og buffer kontrol (venstre rør). (B) Fastgørelse af MAM7-koblede perler til Hela celler resulterer i actin omlejringer og stress fiberdannelse. Fastgørelse af fluorescerende blå perler og deraf actin stress fibre (røde, farvet med rhodamin-phalloidin) blev afbildet ved mikroskopi. Bar, 10 um. Billeder i panel B blev tilpasset fra Lim et al. 1, og gengivet under Creative Commons Attribution-licens. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Heri beskriver vi to protokoller, der kan anvendes til at koble thiolholdige proteiner amin- eller carboxylat-modificeret polystyren perler hhv. På grund af lethed af proceduren, thiol-amin kobling foretrækkes, men afhængig af den ønskede perle specifikation (diameter, fluorescensegenskaber), kan anvendelse af amin-funktionaliserede perler ikke mulig, og vi har derfor indeholdt en protokol, der vil omdanne carboxylat - i en amindel for at give forskeren størst mulig fleksibilitet i valg af stilladset. Selv om både thiol-amin og thiol-carboxyl kobling værk til ethvert cysteinholdige protein, retningsbestemt kobling (dvs. immobilisering af protein pr dets N-terminal, efterligner overfladen display) kræver et protein uden cysteinrester, er der produceres som et GST-fusion protein, eller som indeholder en enkelt terminal cysteinrest indført ved stedorienteret mutagenese. Hvis flere reaktive cysteiner er indeholdti proteinet, vil dette føre til tilfældige immobilisering, som kan hæmme proteinfunktion. Mange bakterielle adhæsiner indeholder ikke cysteiner naturligt. For andre, kan disse fjernes ved steddirigeret mutagenese, selv om dette ville kræve omfattende analyser for at sikre native struktur og funktion er tilbageholdt i mutanten. For GST-fusionsproteiner kan oprenses GST-tag koblet til perlerne anvendes som en egnet negativ kontrol. Brug af koblede perler som en kontrol bør undgås, da disse ofte har en højere tendens til at klumpe sammen eller klæbe til celler ikke-specifikt. En forenklet version af protokollen 1.2., Idet der kun EDC, kan anvendes til at koble proteiner til carboxyl-funktionaliserede polymerperler, men i dette tilfælde kobling sker via primære aminer i proteiner og derfor garanterer ikke retningsbestemt kobling.
TCEP som reduktionsmiddel må ikke erstattes med andre kommercielt tilgængelige og almindeligt anvendte reduktionsmidler, såsom dithiothreitol (DTT) eller 2-mercaptoethanol (BME), som thioler indeholdt i dem vil konkurrere med protein kobling i thiol-maleimid koblingstrin. PBS kan erstattes med andre buffere, men med følgende betragtninger: Buffere kan ikke indeholde primære aminer (så Tris-indeholdende buffere ikke er egnede). Anvendelse af buffere, der indeholder meget lave (<10 mm) saltkoncentrationer fører til perle sammenklumpning og bør også undgås. Proteinrenhed er også en vigtig faktor til at overveje under denne procedure, og for at opnå data af høj kvalitet, skal der anvendes rene proteiner. Vi rutinemæssigt at oprense proteiner i flere trin, herunder mindst en affinitet oprensning og gelfiltreringstrin, men i nogle tilfælde Ionbytterkromatografi udføres som et tredje trin. Som følge renheden af proteiner, der anvendes til kobling er sædvanligvis 90% eller derover, som bedømt ved SDS-PAGE.
Det anbefales at bestemme proteinkoncentrationer både i den indledende reaktionsblanding samt the supernatanten efter reaktionsfuldførelse. Dette vil bidrage til at bestemme den tilsyneladende koncentration af perle-koblet protein, og dermed kobling tæthed. Bestemmelse af begge værdier vil også tillade beregning af koblingseffektiviteten. Dette kan tages i betragtning ved fremstilling af oprindelige proteinopløsning i efterfølgende reaktioner, for at opnå den ønskede slutkoncentration og kobling tæthed. Bradford reagens er særlig velegnet til bestemmelse af proteinkoncentration før og efter koblingsreaktionen, da ingen af stofferne i reaktionen interfererer med farvestoffet kompleksdannelse ved de anvendte koncentrationer. Hvis lavere koncentrationer protein skal anvendes, kan denne metode skulle erstattes af en mere følsom påvisningsmetode dog opmærksomheden skal betales til det faktum, det har at være forenelig med de stoffer, der er indeholdt i koblingsreaktionen. Det anbefales også at bruge frisk fremstillede reagenser og håndtere pulveriserede reagenser med omhu (f.eks butiki en forseglet beholder og bruge silicaperler, for at undgå reagenserne trække fugt) Da kvaliteten af reagenser vil påvirke koblingseffektiviteten. Hvis koblingen effektivitet er lavere end forventet, omfatter mulige løsninger øger de indledende perle og protein koncentrationer. Hvis der bruges højere koncentrationer, koncentrationen af koblingsreagenser skal øges proportionalt for at sikre tilstrækkelig molært overskud. Ændring perle / protein-koncentrationer er normalt en bedre skridt mod optimering snarere end at øge reaktionstider. Da protokollerne for perle kobling er lange, vi almindeligvis forberede et stort parti af materialet. Portioner af suspensionen kan snap-frosset i flydende nitrogen og opbevaret ved -20 ° C i flere måneder. Optøede portioner bør ikke genfryses og skal opbevares ved 4 ° C og anvendes inden for 1-2 dage. Dette vil imidlertid variere med arten og stabiliteten af proteinet anvendt som skal afprøves på et lille parti i første omgang.
Vibrio parahaemolyticus, anvendelse af enten et fald i bakteriel vedhæftning til værtsceller eller nedsat cytotoksicitet som udlæsning . I begge tilfælde, forberedelse og kompetitive assays følge samme protokol. Afhængigt af udlæsning, forskellige stammer af V. parahaemolyticus bliver brugt: den cytotoksiske stamme POR1 anvendes for cytotoksicitet målinger, mens de ikke-cytotoksiske stamme POR2 anvendes til måling bakteriel adhæsion, idet celledød og Cellefrigørelse kompromitterer proceduren til kvantificering vedhæftede bakterier.
I første omgang, kompe-rencen eksperimenter blev sat op som en trinvis protokol, hvor værtscellerne blev først præinkuberet med perler forud for tilsætningen af bakterier. Til V. parahaemolyticus og perle specifikationer, der anvendes (2 um perler koblet til MAM7), kan både perler og bakterier tilsættes samtidigt uden ændringer i den resulterende cytotoksicitet. Dvs., i dette forsøgsopstilling, perler udkonkurrere bakterier for værtscelle binding. Afhængigt af bakterielle arter og perle geometri, som anvendes, kan der være gode grunde til at bevare perlen adhæsion og bakteriel infektion som to separate trin. For eksempel for at inficere celler med ikke-bevægelige bakterier, pladerne centrifugeres almindeligvis efter tilsætning af infektionen medier. Imidlertid bør centrifugering af plader indeholdende perle suspensioner bør undgås, da dette fører til en meget ujævn fordeling af perlerne på cellelaget. Hvis der bruges mindre partikelstørrelser, vil perler tage længere tid at sætte sig på celleoverfladen, i hvilket tilfælde sufficient tid bør være tilladt for perle fastgørelse forud for infektionen. Når bakteriel adhæsion bruges som en udlæsning, bør der tages prøver på tidspunkter, hvor værtsceller er ikke væsentligt beskadiget af den inficerende stamme, som celle løsrivelse og lyse kan kompromittere kvantificering af vedhæftede bakterier.
I stedet for at optælle bakteriel adhæsion ved fortynding plating, kan prøverne alternativt behandles for imaging (figur 5). I dette tilfælde bør vævskulturceller podes på dækglas, i stedet for direkte i brønde. Derudover kan fluorescerende perler og bakterier, der udtrykker et fluorescerende protein anvendes sammen med infektion-specifikke vært cellemarkører. For eksempel er kompetitive forsøg almindeligvis afbildes under anvendelse af fluorescerende røde rhodamin-phalloidin til farvning værtscellerne 'aktincytoskelettet og vurdere morfologiske ændringer som følge af infektion, sammen med fluorescerende blå perler og fluorescerendegrøn (GFP udtrykke eller SYTO18 farvet) bakterier.
En række perle-koblede adhæsiner, herunder Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD og Vibrio parahaemolyticus MAM, er blevet anvendt som biomimetiske materialer til at studere vedhæftning, adhæsionsinhibering og bidrag adhæsion til patogen-medieret cytotoksicitet 1, 7, 8. En af fordelene ved at anvende denne fremgangsmåde er den lette visualisering af vedhæftede begivenheder, da polymerperler anvendes som scaffolds er tilgængelige i en bred vifte af farver (fx blå, fluorescerende rød, blå, grøn, orange). Således direkte proteinmærkning, hvilket kan forstyrre funktionen, kan undgås. Derudover overflade kobling efterligner multivalente visning af adhesiner på den bakterielle overflade, hvilket afspejler en mere fysiologisk relevant kropsbygning i forhold til opløselige proteiner.
Sammenlignet med undersøgelser ved anvendelse af intakte bakterier eller bacteriAL mutanter, perlen tilgang omgår problemerne forbundet med bakterievækst. For eksempel, på længere sigt (f.eks O / N) undersøgelser af bakteriel adhæsion til værtsceller anvendelse af intakte bakterier er ofte kompromitteret af fænomener ledsager bakterievækst - forsuring af vækstmediet og næringsstof sult negativ indvirkning værtsceller og bakteriereplikation vinder kompromiser billedkvalitet.
For nylig er anvendelsen af perle-koblede adhæsiner blevet udvidet til at omfatte deres anvendelse som værktøjer til affinitet oprensninger af værten cellulære faktorer involveret i signalering processer nedstrøms for bakteriel vedhæftning. V. parahaemolyticus MAM7, via binding til phosphatidsyrer i værtscellemembranen, udløser RhoA aktivering og actin omlejringer 1, 3. MAM-koblede perler bliver brugt til at oprense og identificere proteiner involveret i signalering platforme samles som følge af MAM-værtscelle binding. Da Perlerne kanlet adskilles fra supernatanten ved en kort centrifugeringstrin og proteinet af interesse er kovalent koblet, er dette en god metode til at opnå adskillelse fra kontaminerende proteiner og berige relevante proteinkomplekser, som kan anvendes til efterfølgende anvendelser såsom proteomics eller Western blotting.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
