Protocol
1. כימי צימוד של חלבונים לחרוזי פולימרים
- צימוד כיוונית תיאול-אמין
הערה: פרוטוקול זה מתאים לצימוד של ציסטאין המכיל חלבונים לאמינים פונקציונליות חרוזים פולימר, באמצעות 4 וטיראט Sulfosuccinimidyl (-maleimidophenyl p) (Sulfo-SMPB) כסוכן cross-linking (איור 1).
1. cross-linking דמות אסטרטגיה המשמשת לצימוד תיאול-אמין כיוונית של חלבונים לחרוזי פולימר. חרוזי פוליסטירן שונה-אמין מופעלים עם Sulfo-SMPB. Maleimide מגיב עם cysteines החופשי directionally זוג חלבונים לחרוזים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.- הכנה של חומרים כימיים:
- הכן PBS (100 פוספט נתרן מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.0) וחיטוי. הכן מלאי 100x (0.5 M או 287 מ"ג / מיליליטר PBS) של TCEP (phosphine טריס (2-carboxyethyl)) מייד לפני השימוש.
- הכן מלאי 5x (10 מ"מ או 4.58 מ"ג / מיליליטר ב DH 2 O) של Sulfo-SMPB מייד לפני השימוש.
- הכן מלאי 10x (500 מ"מ או 88 מ"ג / מיליליטר PBS, pH 7.0) של ציסטאין מייד לפני השימוש.
- הפעלה ביד:
- מערבבים את ההשעיה חרוז בעדינות על ידי היפוך ולהעביר את הכמות הנדרשת של השעיה חרוז (למשל, 12 מיליליטר) לתוך צינור 1.5 מיליליטר סטרילי המכיל 1 מיליליטר סטרילי PBS, pH 7.0.
- פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לשטוף את החרוזים וגלולים על ידי צנטריפוגה בmicrocentrifuge (2 דקות ב16,000 XG).
- מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ופסול. Resuspend גלולה חרוז ב 1 מיליליטר של PBS סטרילי הטרי ולחזור על שלב הכביסה. Resuspend גלולה חרוז ב0.8 מיליליטר של PBS.
- הוסף 200 מיליליטר של מוכן טרי 10 מ"מ Sulfo-SMPB, לתת concent סופימנה של 2 מ"מ.
- דגירה ההשעיה חרוז עבור שעה 1 ב 25 ° C על גלגל מסתובב.
- הפחתת חלבון:
- במהלך תקופת הדגירה של שלב ההפעלה, להכין את החלבון לצעד הבא הצימוד כך שניתן להוסיף באופן מיידי לחרוזים מופעלים.
הערה: למרות שצעד הפחתה זו לא תמיד נדרש לGST (גלוטתיון S-transferase) חלבוני היתוך, מומלץ על מנת להבטיח יעילות צימוד גבוהה.- בדוק את ריכוז החלבון, ולהתאים אותו לריכוז הסופי הנדרש לתגובת הצימוד. הערה: 6 מ"מ בחלבון PBS, ונפח של 1 מיליליטר משמש בדרך כלל.
- להוסיף מניית TCEP לתת ריכוז סופי של 5 מ"מ. דגירה הפתרון למשך 30 דקות ב RT.
הערה: תערובת התגובה ניתן להשתמש ישירות לתגובת הצימוד הבאה. - לשמור על כמות קטנה (כמה מיליליטר) של פתרון החלבון לקביעת פרו ריכוז חלבון וחישוב יעילות צימוד (ראה סעיף 2).
- במהלך תקופת הדגירה של שלב ההפעלה, להכין את החלבון לצעד הבא הצימוד כך שניתן להוסיף באופן מיידי לחרוזים מופעלים.
- צעד צימוד חלבון:
- גלולה חרוזים מופעלים על ידי צנטריפוגה (2 דקות, 16,000 XG בmicrocentrifuge), ולשטוף את הכדור פעם אחת ב 1 מיליליטר של PBS סטרילי הטרי.
- Resuspend גלולה בפתרון מוכן חלבון (לדוגמא, 1 מיליליטר), לתת את ריכוז החלבון הרצוי.
הערה: ריכוז החלבון במהלך שלב הצימוד יהיה תלוי ביעילות הממוצעת הצימוד (ראה סעיף 2 לקביעת יעילות הצימוד) וצפיפות רצויה צימוד (כפי שמחושב ב1.1.4.3). היעילות היא כ -85% ואת הריכוז סופי 5 מ"מ הרצוי בהשעית 10x חרוז, כך ריכוז חלבון במהלך שלב הצימוד צריך להיות כ 6 מ"מ. - לחשב את צפיפות הצימוד באמצעות הנוסחא הבאה:
jpg "/> שם
[מספר מולקולות חלבון / ננומטר 2] צפיפות צימוד ρ ג,
ריכוז חלבון חלבון קונצרט כלשהו [מ"ג / מיליליטר],
M החלבון w משקל המולקולרי של חלבון [Da],
ריכוז קונצרט כלשהו חרוז חרוז [מספר חרוזים / L],
קוטר חרוז ד [ננומטר 2]
מספר אבוגדרו - השתמש בצפיפות הצימוד כדי לחשב את מרווח יגנד הממוצע:
- דגירה ההשעיה חלבון-חרוז לשעה 2 ב 25 ° C על גלגל מסתובב.
הערה: חלק מחלבונים לא יכולים להיות יציבים ב RT. במקרים אלה, התגובה יכולה להתבצע על 4 מעלות CO / N. - בטל קבוצות הופעלו נותרו בחרוזים על ידי הוספת מניית ציסטאין לריכוז סופי של 50 מ"מ ודגירת ההשעיה למשך 30 דקות ב 25 ° C על גלגל מסתובב. גלולה חרוזים על ידי צנטריפוגה (2 דקות, 16,000 XG בmicrocentrifuge).
- שמור את supernatant לקביעת ריכוז החלבון וחישוב יעילות צימוד (ראה סעיף 2).
- שטוף את כדור חרוז פעמיים עם 1 מיליליטר PBS ו resuspend ב 1 מיליליטר PBS הטרי לתת את המוצר הסופי.
הערה: הפרוטוקול לעיל בדרך כלל ייתן לי 1 מיליליטר של חלבון בשילוב, בריכוז סופי של 5 חלבון מ"מ, אשר יכול לשמש כמניות 10x לניסויים הבאים (ראה סעיף 3). - כדי להמשיך לסעיף 3 לפרוטוקול, לעבוד עם 100 מיליליטר / מיליליטר של מניית חרוז, או בריכוז סופי של 500 ננומטר חלבון. הערה: נקודת התחלה טובה לprocedur זהדואר יהיה 2 × 10 12 מיליליטר / חרוזים, וכתוצאה מכך צפיפות ממוצעת צימוד של 3 × 10 -4 חלבונים / ננומטר 2 או מרווח של 57 ננומטר ממוצע בחרוז בקוטר 2 מ"מ.
- הכנה של חומרים כימיים:
- צימוד כיוונית תיאול קרבוקסי
הערה: פרוטוקול זה מתאים לצימוד ציסטאין המכיל חלבונים לחרוזי פוליסטירן פונקציונליות carboxyl. מחצית carboxyl מופעלת באמצעות ראשונה 1-אתיל-3 carbodiimide (3-dimethylaminopropyl) (EDC) / N-hydroxysuccinimide (NHS), אמין שונה ולאחר מכן חוצה מקושר באמצעות Sulfo-SMPB (איור 2).
2. cross-linking דמות אסטרטגיה המשמשת לצימוד תיאול-כיוונית carboxyl של חלבונים לחרוזי פולימר. חרוזי פוליסטירן Carboxylated מופעלים ראשון עם EDC ושונה עם שירותי הבריאות ליצירת NHS-אסתר למחצה יציבה. אמין-הצימוד הבא של ethylenediתוצאות האמינים בקבוצה אמין חופשית, אשר מגיבה עם Sulfo-SMPB. Maleimide מופעל חרוזים אז יכולים להגיב עם cysteines החופשי directionally זוג חלבונים לחרוזים. אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.- הכנה של חומרים כימיים:
- הכן PBS (100 פוספט נתרן מ"מ, 150 מ"מ NaCl, pH 7.0) וחיטוי.
- הכן מלאי 100x (0.5 M או 287 מ"ג / מיליליטר PBS,) של TCEP מייד לפני השימוש.
- הכן מלאי 10x (20 מ"מ, או 4 מ"ג / מיליליטר PBS) של EDC (carbodiimide 1-אתיל-3 (3-dimethylaminopropyl)) מייד לפני השימוש.
- הכן מלאי 10x (50 מ"מ, או 6 מ"ג / מיליליטר PBS) של שירותי הבריאות (N-hydroxysuccinimide) מייד לפני השימוש.
- הכן מלאי 5x (10 מ"מ או 4.58 מ"ג / מיליליטר ב DH 2 O) של Sulfo-SMPB מייד לפני השימוש.
- הכן מלאי 10x (500 מ"מ או 88 מ"ג / מיליליטר PBS, pH 7.0) של ציסטאין מייד בשימוש efore.
- הפעלה ביד:
- מערבבים בעדינות על ידי השעיה חרוז היפוך ולהעביר את הכמות הנדרשת של השעיה חרוז (למשל, 12 מיליליטר) לתוך צינור 1.5 מיליליטר סטרילי המכיל 1 מיליליטר סטרילי PBS, pH 7.0.
- פיפטה בעדינות מעלה ומטה כדי לשטוף את החרוזים וגלולים על ידי צנטריפוגה בmicrocentrifuge (2 דקות ב16,000 XG).
- מוציא בזהירות את supernatant עם טפטפת ופסול.
- Resuspend גלולה חרוז ב 1 מיליליטר של PBS סטרילי הטרי ולחזור על שלב הכביסה.
- Resuspend גלולה חרוז ב0.8 מיליליטר של PBS.
- להוסיף של 10x מניית EDC 100 מיליליטר (ריכוז סופי 2 מ"מ) ומייד 100 מיליליטר של 10x פתרון NHS מניות (ריכוז סופי 5 מ"מ) על השעיית חרוז.
- דגירה ההשעיה חרוז למשך 30 דקות ב 25 ° C על גלגל מסתובב.
- לשטוף חרוזים פעם ב 1 מיליליטר של PBS וגלול ב0.8 מיליליטר סטרילי PBS הטרי.
- הוסף 200 מיליליטר ethylenediamine, וIncubate ההשעיה חרוז עבור שעה 1 ב 25 ° C על גלגל מסתובב.
- לשטוף חרוזים פעם עם 1 מיליליטר PBS ו resuspend חרוזים ב0.8 מיליליטר של PBS הטרי.
- המשך מסעיף 1.1.2.4 (הפעלת חרוז עם Sulfo-SMPB) כאמור בסעיף 1.1.2 ובצע את שאר הפרוטוקול המתואר בסעיף 1.1 (צימוד כיוונית תיאול-אמין). לבצע הכנת חלבון וצעדי צימוד החלבון באופן זהה לאלה שתוארו בסעיף 1.1.
הערה: יעילות הצימוד הטיפוסית באמצעות פרוטוקול זה היא מעט נמוכה יותר בהשוואה לסעיף 1.1, ולכן להתאים את ריכוז החלבון הראשוני בהתאם כדי להשיג את אותה צפיפות צימוד (כ 75%.).
- הכנה של חומרים כימיים:
2. קביעת יעילות צימוד
הערה: כדי לקבוע את ריכוז חלבון, להשתמש ברדפורד מגיב 10 ומבחני colorimetric כדלקמן:
- בעדינות להפוך רדפורד מגיב לדואר הומוגניות Nsure של המגיב.
- באמצעות 10 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות BSA, להכין סטנדרטים חלבון מכסים ריכוזים 0.1-1.5 מ"ג / מיליליטר BSA במאגר.
- הוסף 250 מיליליטר של רדפורד מגיב לבארות של צלחת 96-היטב. הכן מספיק בארות עבור כל הדגימות, הסטנדרטים חלבון ובקרות שליליות (חיץ בלבד).
- הוסף 5 מיליליטר של מדגם חלבון (סטנדרטים חלבון או חיץ, לבקרה השלילית) למגיב בצלחת 96-היטב.
- דגירה את הצלחת על שייקר מסלולית ב RT במשך 10 דקות.
- למדוד הספיגה ב 595 ננומטר באמצעות קורא צלחת.
- ליצור עקומה סטנדרטית של ריכוז BSA לעומת ננומטר A595 ולהשתמש בזה כדי לקבוע ריכוזי חלבון בדגימות ראשוניות וsupernatant.
- חשב את הריכוז של חלבון בשילוב כדלקמן:
- חשב את יעילות צימוד כ:
00eq4.jpg "/>
3. שימוש בAdhesins בשילוב חרוזי במבחני תחרות
- אופן ההכנה:
- זרע 1 מיליליטר לכל טוב של תאי הלה בריכוז של 150,000 תאים / מיליליטר לתוך צלחת 24 גם היום לפני assay התחרות, כדי לאפשר לתאים להגיע לכ 80% confluency לפני תחילת הניסוי.
- הגדר את כל תנאי ניסוי בשלושה עותקים. כולל בארות עבור פקדים שליליים (לא חיידקים הוסיפו במהלך מבחני תחרות), בקרות חיוביות (חרוזים שליטה מצמידים את היתוך התג הוסיף רק במהלך מבחני תחרות) ובקרות תמוגה (לניסויים רעילים).
- לחסן LB תרבות 5 מיליליטר ימי (MLB) עם מושבה טרי של V. parahaemolyticus ולגדול O / N ב 30 מעלות צלזיוס, רועדת.
- הכן MAM מצמידים חרוז מספיק, כפי שתואר בסעיף 1. (צימוד). לאפשר לשל 10x מניית חרוז 100 מיליליטר לכל טוב.
- assay תחרות:
- ביום competitניסוי יון, למדוד את OD 600 של תרבות החיידקים.
- הכן תקשורת זיהום על ידי דילול תרבויות חיידקים לתוך DMEM חסר צבע ללא תוספים, טרום חיממו עד 37 מעלות צלזיוס, המכיל 10% השעיה נ / חרוז V (או חרוזים או חרוזים שליטת מצמידים adhesin), לתת משרד הפנים של 10. הכן 1 מיליליטר / גם ו10-20% נפח עודף לדגימה. הערה: לתנאים שהוזכרו לעיל (24 גם צלחת, parahaemolyticus V., משרד הפנים 10), נפח הצורך של O / תרבות N שיתווסף לכל גם (מיליליטר / מיליליטר) מחושב כ3 / OD 600 של התרבות. לדוגמא, 1 מיליליטר של מדיום זיהום בדרך כלל מכיל 100 מיליליטר השעיה חרוז, כמה מיליליטר של תרבית חיידקים ולהתבצע עד 1 מיליליטר עם DMEM חסר צבע, unsupplemented.
- הסר בינוני ישן מבארות ולשטוף תאים בתרבית הלה על ידי הוספת 1 מיליליטר של סטרילית מראש חיממתי PBS עד 37 ° C לכל אחד.
- הסר PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של מדיום זיהום בכל טוב. גם להגדיר בקרות, על ידי הוספת המשך פתרונותaining חרוזים שליטה וחיידקים (ביקורת חיובית) או חרוזים adhesin ולא חיידקים (בקרות שליליות), או DMEM המכילים 0.1% Triton X-100 (שליטת תמוגה, נחוצה רק למדידות רעילות).
- דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך זמן הרצוי (למשל 4 שעות למדידות רעילות או שעה 1 למדידות הידבקות).
הערה: שתי הידבקות חיידקים ורעילים לתאי מארח יכולים לשמש לקריאה פסקי ליעילות של עיכוב. אם הנקודות של מדידות רעילות והידבקות הזמן לחפוף, שני מבחני יכולים להתבצע באמצעות דגימות מאותו היטב, שכן רעיל נקבע באמצעות שימוש במבחני supernatant התרבות וקובץ מצורף להשתמש דגימות נגזרות משיכבת התאים שנותרה.
- מדידות רעילות:
- בנקודות זמן המצוינות (לדוגמא, לאחר זיהום 4 שעות), להסיר את שלושה 200 מיליליטר פעמים מכל אחד 24 גם והעברה לצלחת 96-היטב.
- ספין 96-גם צלחות ב1,500 XG, 5 דק 'והעברת 100 מכל מיליליטר גם לתוך צלחת 96-היטב טרי. להוסיף בתקשורת המשמשת בניסויי זיהום בארות טריות של הצלחת 96-היטב בשלושה עותקים 100 מיליליטר (אלה ישמשו כחסר).
- לבצע את assay דהידרוגנז שחרור (LDH) חומצת החלב באמצעות ערכת זיהוי רעילה LDH והבא להוראות היצרן.
- בקצרה, לחשב את הסכום של מגיב צורך במרווחים של 25 (לדוגמא, אם 62 דגימות שנמדדו, לפצות מספיק תערובת מגיב 75 וכו ').
- לדוגמא, עבור 100 דגימות, לערבב 11.25 מיליליטר של מגיב עם 250 μl של מגיב ב הפוך, לא מערבולת כדי למנוע הקצפה.
- מכניס את התערובת במאגר כדי להיות מסוגל pipet עם טפטפת רב-ערוצית. להוסיף תערובת של מגיב 100 μl לכל דגימה.
- דגירה הצלחת ב RT ולקרוא את הספיגה ב 490 ננומטר על קורא צלחת בגיל 10, 20, 30 דקות. לנתח את מערכת הנתונים אשר הספיגה של מדגם שליטת תמוגה היא גבוהה, אך עדיין בטווח ליניארי של קורא הצלחת (בדרך כלל, 2-3 יחידות ספיגה).
- הגעה תוצאות כרעילות%, תוך שימוש בנוסחא הבאה להמרה:
- מדידה של הידבקות חיידקים:
- בנקודות זמן המצוינות (לדוגמא, לאחר זיהום שעה 1), להסיר את התקשורת משיכבת התאים.
- ביסודיות לשטוף את שכבת התא עם סטרילי PBS המחומם מראש, (לפחות 3-4 שטיפות של 1 מיליליטר PBS כל אחד) כדי להסיר את כל תאים מצורפים האו"ם.
- תאי מארח Lyse על ידי הוספת 1 מיליליטר של נ 1% סטרילי / V טריטון פתרון X-100 ב PBS לכל טוב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- פיפטה כל מדגם למעלה ולמטה כמה פעמים לפני העברת התוכן של כל אחד גם להפריד צינורות 1.5 מיליליטר. הכן פי 10 דילולים סידוריים של דגימותלסטרילי PBS (למשל, שימוש במדגם של 100 מיליליטר ו -900 מיליליטר של PBS).
- צלחת של כל דגימה על אגר MLB 100 מיליליטר ולהפיץ באמצעות מפזר תא. מטב שדילולי צלחת בהתאם לזני החיידקים ונקודת זמן. הערה: הגדרת הניסוי המתוארת, 10 5 או 10 6 דילולים לקפל לתת מספר מתאים של CFUs.
- דגירה צלחות ב 37 מעלות CO / N ולמנות חיידקים על ידי ספירת מושבה.
Representative Results
V. parahaemolyticus adhesin MAM7 מכיל תחומים שבעה טנדם כניסת תאים יונקים (MCE) המעורבים בהכרה של קולטני משטח מארח. אנו משמשים חרוזי פוליסטירן מצמידים רקומביננטי, שברים מטוהרים הכוללים גם את כל תחומי MCE שבעה טנדם (MAM7) או רק תחום MCE הראשון (MAM1) כדי לבחון את היכולת של חומרים אלה כדי להתחרות עם V. parahaemolyticus לתא מארח המחייבים והיעילות של חומרים אלו כמעכבי הידבקות כתוצאה. תאי הלה היו נגועים בV. זן parahaemolyticus POR1, ורעיל כתוצאה מזיהום במבחנה הוערך לאחר 4 שעות (איור 3). טיפול בתאי הלה עם 0.1% Triton X-100 (שליטת תמוגה חיובית) הביאו תמוגה תא שלמה, תאים נגוע מוצגים רמות נמוכות מאוד של רעיל. זיהום במבחנה של תאים שלא טופלו עם POR1 הביא רמות גבוהות מאוד של תמוגה תא, וזה היה מעוכב על ידי MAM7-שיתוףupled חרוזים אבל לא מצמיד MAM1 או חרוזים שליטת מצמידים GST (איור 3).
איור 3. אפיון של parahaemolyticus Vibrio מושרה רעיל בתאי אפיתל במבחני תחרות. תאים שטופלו עם V. parahaemolyticus (סמנכ"ל), הצביע עם (+), או לא חיידקים (-) בנוכחות של גופים מתחרים שונים (. comp) כפי שצוינו. אלה כללו גם לא comp. (-), חרוזים MAM7 (MAM7), חרוזים MAM1 (MAM1) או חרוזים שליטת GST (GST). כפקדים, טופלו תאים או עם טריטון X-100 (טריטון, שליטת תמוגה), או שמאלה נגוע (uninf). שחרור LDH לאחר 4 שעות נמדד כאמור בסעיף 3, ותוצאות מנורמלות לבקרות טריטון (100%) ואת החסר (0%) כפי שתואר לעיל. תוצאות הן אמצעי ± SEM מניסויים בשלושה עותקים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
ספירת V. parahaemolyticus מצורף או תאים שלא טופלו הלה, או תאים הודגרו עם MAM7-, MAM1-, או חרוזים שליטת GST, גילה כי MAM7-חרוזים אבל לא MAM1- או חרוזים שליטת GST- לגבור V. parahaemolyticus לקובץ מצורף לארח קולטני תא שטח (איור 4).
אפיון איור 4. התקשרות חיידקים במהלך ניסויי תחרות. תאי הלה היו נגועים בV. parahaemolyticus POR2 (סמנכ"ל +), בהעדר (-) או נוכחות של גופים מתחרים כדלקמן: חרוזים MAM7 (MAM7), חרוזים MAM1 (MAM1) או חרוזים שליטת GST (GST) (comp.). הידבקות חיידקים נמדדה לאחר שעה 1, כ מתואר בסעיף 3. תוצאות הם אמצעי ± SEM מניסויים בשלושה עותקים. אמצעי (fltr בCFU / ml) הם 2.3010 6, 5 1.5310, 2.0510 6, 6 2.1210. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Adhesins מצמידים את חרוזים fluorophore שכותרתו לגרום לדור של חומרים המחקים הידבקות חיידקים לארח תאים והם כלים רבי עוצמה להדמיה סלולרית (איור 5). שימוש בחרוזים כחולים ניאון בשילוב-MAM7, אנחנו אפיינו את תהליך ההתקשרות בתיווך MAM7 לתאי האפיתל. קובץ מצורף של MAM7 לארח תאים הביא יקטין ארגון מחדש והיווצרות סיבי מתח, שהיו באמצעות rhodamine-phalloidin להכתים לF- אקטין (איור 5) דמיין-שיתוף.
_upload / 53,400 / 53400fig5.jpg "/>
קובץ מצורף איור הכנה 5. ושימוש בfluorophore שכותרת חרוזים biomimetic למטרות הדמיה. () השעיה של חרוזים biomimetic כחולים ניאון (צינור תקין, 10x מלאי) וחיץ שליטה (צינור שמאלי). (ב) לחרוזים בשילוב-MAM7 להלה תוצאות תאים בארגון מחדש אקטין והיווצרות מתח סיב. סיבי קובץ מצורף של חרוזים כחולים ניאון ויקטינו מתח וכתוצאה מכך (אדומים, מוכתמים בrhodamine-phalloidin) היו צילמו על ידי מיקרוסקופ. בר, 10 מיקרומטר. תמונות בלוח ב 'הותאמו מים et al. 1 ולשכפל תחת רישיון Creative Commons ייחוס. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Discussion
בזאת, אנו מתארים שני פרוטוקולים, אשר יכול לשמש לחלבונים המכיל תיאול זוג amine- או חרוזי פוליסטירן-שונה carboxylate, בהתאמה. בשל הקלות של ההליך, צימוד תיאול-אמין עדיף, אך בהתאם למפרט הרצוי חרוז (קוטר, תכונות הקרינה), שימוש בחרוזים פונקציונליות אמין לא יכולים להיות אפשריים ועל כן כללנו פרוטוקול שיהיה להמיר carboxylate - למחצית אמין לתת חוקר הגמישות הגדולה ביותר האפשרית בבחירה של פיגום. למרות ששני תיאול-אמין ועבודת צימוד תיאול-carboxyl לכל ציסטאין המכיל חלבון, צימוד כיוונית (כלומר, חוסר תנועה של החלבון לכל N-הסופית שלה, מחקה תצוגת משטח) דורש חלבון ללא שאריות ציסטאין, כי הוא מיוצר כהיתוך GST חלבון, או שמכיל שאריות ציסטאין מסוף יחידה שהוצגו על ידי אתר מכוון mutagenesis. אם cysteines תגובתי מרובה כלוליםבתוך החלבון, זה יוביל לחוסר תנועה אקראית שעלולות לעכב את תפקוד חלבון. adhesins חיידקים רב אינו מכיל cysteines באופן טבעי. עבור אחרים, אלה ניתן להסיר על ידי mutagenesis אתר מכוון, אם כי זה ידרוש מבחני נרחבים כדי להבטיח מבנה ותפקוד האם נשמרים במוטציה. לחלבונים היתוך GST, GST-תג מטוהר מצמידים את חרוזים יכול לשמש כביקורת שלילית מתאימה. שימוש בחרוזי נחק כביקורת יש להימנע, כמו אלה לעתים קרובות יש נטייה גבוהה יותר לגוש ביחד או לדבוק תאים שאינם ספציפי. גרסה פשוטה יותר של פרוטוקול 1.2., באמצעות EDC בלבד, יכולה לשמש לכמה חלבונים לחרוזי פולימרים פונקציונליות carboxyl, אולם במקרה זה צימוד מתרחש באמצעות אמינים ראשוניים בחלבון ולכן אינו מבטיח צימוד כיוונית.
TCEP כסוכן צמצום לא חייב להיות מוחלף עם סוכנים אחרים זמינים מסחרית ונפוצים צמצום, כגון dithiothreitol (DTT) או 2-mercaptoethanol (BME), כthiols הכיל בתוכם יתחרה עם צימוד חלבון בשלב צימוד תיאול-maleimide. PBS עשוי להיות מוחלף עם מאגרים אחרים, אבל לשיקולים הבאים: חוצצים לא יכילו אמינים ראשוניים (כך מאגרי טריס המכילים אינם מתאימים). שימוש במאגרים המכילים ריכוזי מלח (<10 מ"מ) מאוד נמוכים מוביל לחרוז clumping ויש להימנע גם. טוהר חלבון הוא גם גורם חשוב לשקול במהלך הליך זה, וכדי להשיג נתונים באיכות גבוהה, יש להשתמש בחלבונים טהורים. אנחנו באופן שיגרתי לטהר חלבונים בשלבים מרובים, כוללים לפחות צעד טיהור זיקה וסינון ג'ל, אך במקרים מסוימים יון כרומטוגרפיה חילופי נעשה כצעד שלישי. כתוצאה מכך טוהר של חלבונים המשמשים לצימוד הוא בדרך כלל 90% ומעלה, כפי שיישפט על ידי SDS-עמוד.
מומלץ לקבוע ריכוזי חלבון הן בתערובת התגובה הראשונית, כמו גם של הsupernatant דואר לאחר השלמת תגובה. זה יעזור לקבוע את ריכוז חלבון לכאורה מצמידים חרוז של, ובכך צפיפות צימוד. נחישות של שני הערכים גם תאפשר חישוב של יעילות הצימוד. זה יכול להילקח בחשבון בעת הכנת פתרון החלבון הראשוני בתגובות הבאות, כדי להשיג את צפיפות ריכוז וצימוד הסופית הרצויה. מגיב ברדפורד מתאים במיוחד לקביעת ריכוז חלבון לפני ואחרי תגובת הצימוד, כמו שאף אחד מהחומרים בתגובה מפריעה להיווצרות המורכבת הצבע בריכוזים בשימוש. אם ריכוזי חלבון נמוכים יותר לשימוש, שיטה זו עשויה להיות מוחלפת על ידי שיטת זיהוי רגישה יותר, עם זאת תשומת לב צריכה להיות משולמת לעובדה שזה צריך להיות תואם עם החומרים הכלולים בתוך תגובת הצימוד. כמו כן, מומלץ להשתמש בחומרים כימיים מוכנים טרי ולהתמודד עם ריאגנטים אבקה בזהירות (למשל, חנות במכל אטום ולהשתמש חרוזים סיליקה, כדי למנוע את ריאגנטים ציור לחות) מאז האיכות של חומרים כימיים ישפיע על יעילות הצימוד. אם את יעילות הצימוד היא נמוכה מהצפוי, פתרונות אפשריים כוללים הגדלת ריכוזי חרוז וחלבון הראשוני. אם ריכוזים גבוהים יותר נמצאים בשימוש, הריכוז של חומרים כימיים צימוד יש להגדיל באופן יחסי על מנת להבטיח עודף טוחנת מספיק. שינוי ריכוזי חרוז / חלבון הוא בדרך כלל צעד טוב יותר לקראת אופטימיזציה במקום להגדיל את זמני תגובה. מאז הפרוטוקולים לצימוד חרוז הם ארוכים, אנחנו בדרך כלל להכין אצווה גדולים של חומר. Aliquots של ההשעיה ניתן snap-קפוא בחנקן נוזלי ומאוחסן ב -20 ° C למשך מספר חודשים. לא צריך להיות refrozen aliquots המופשר וצריך להיות כל הזמן על 4 מעלות צלזיוס ומשמש בתוך 1-2 ימים. עם זאת, זה ישתנה עם הטבע והיציבות של החלבון המשמש כצריך להיבדק על אצווה קטן בתחילה.
s = "jove_content"> adhesins מצמיד יד יכול לשמש ליישומים רבים, כמפורט להלן. פרוטוקול זה מתואר assay שמשמש בדרך כלל למדידת עיכוב של cytotoxicity המחייב ותיווך פתוגן חיידקים על תאי מארח. Assay מבוצע בדרך כלל כדי למדוד את היכולת של MAMs מצמידים חרוז לעכב תחרותי זיהום של תאי האפיתל הלה עם parahaemolyticus Vibrio הפתוגן נשא פרותי הים, או באמצעות ירידה בקובץ מצורף חיידקים לארח תאים או מופחת רעיל כמו קריאה מתוך . בשני המקרים, מבחני הכנה ומעקב תחרות באותו הפרוטוקול. בהתאם את ההודעה, זנים שונים של V. parahaemolyticus נמצא בשימוש: המתח ציטוטוקסיות POR1 משמש למדידות רעילות, ואילו המתח שאינו רעיל לתאי POR2 משמש למדידת הידבקות חיידקים, מאז המוות של תאים וניתוק תא פוגעים בהליך לכימות חיידקים מצורפים.
בתחילה, compeניסויי tition הוקמו כפרוטוקול צעד חכם, שבו תאי מארח היו הראשונים מראש מודגרות-עם חרוזים לפני התוספת של חיידקים. לV. parahaemolyticus ומפרטי חרוז משמשים (2 מיקרומטר חרוזים מצמידים MAM7), ניתן להוסיף שני חרוזים וחיידקים באותו הזמן ללא שינויים ברעילים וכתוצאה מכך. כלומר, בהגדרת ניסוי זה, חרוזים לגבור חיידקים לתא מארח מחייב. בהתאם לגאומטרית המינים וחרוז חיידקים משמשת, ייתכנו סיבות טובות לשמירה על הידבקות חרוז וזיהום חיידקים כשני שלבים נפרדים. לדוגמה, כדי להדביק תאים עם חיידקים שאינם ניע, צלחות centrifuged נפוצות לאחר תוספת של תקשורת הזיהום. עם זאת, יש להימנע צנטריפוגה של צלחות המכילות השעיות חרוז, שכן זה מוביל לחלוקה לא שווה ביותר של חרוזים על שכבת התאים. אם גודל חלקיקים קטן יותר נמצא בשימוש, חרוזים ייקחו יותר זמן להתיישב על פני התא, במקרה שsuזמן fficient יש לאפשר לקובץ מצורף חרוז לפני הזיהום. כאשר הידבקות חיידקים משמשת כהקריא, יש לקחת דגימות בנקודות זמן שבו תאי מארח לא נפגעו באופן משמעותי על ידי מתח ההדבקה, כמו ניתוק תא ותמוגה יכולה להתפשר כימות של חיידקים מצורפים.
במקום ספירת הידבקות חיידקים על ידי ציפוי דילול, דגימות יכולות לחלופין להיות מעובד להדמיה (איור 5). במקרה זה, צריכים להיות נזרעו תאים בתרבית רקמה על תלושי כיסוי זכוכית, ולא ישירות לתוך בארות. בנוסף, ניתן להשתמש בחרוזי ניאון וחיידקים להביע חלבון פלואורסצנטי, יחד עם סמני תא מארח זיהום ספציפי. לדוגמא, ניסויי תחרות בדרך הדמיה באמצעות rhodamine-phalloidin האדום ניאון להכתים cytoskeleton אקטין תאי המארח ולהעריך שינויים מורפולוגיים הנובעים מזיהום, יחד עם חרוזים כחולים ניאון וניאוןירוק (GFP להביע או SYTO18 מוכתם) חיידקים.
מגוון של adhesins מצמידים חרוז, כוללים Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD וMAM parahaemolyticus Vibrio, היה בשימוש כחומרי biomimetic ללמוד הידבקות, עיכוב הידבקות והתרומה של הידבקות לתיווך פתוגן רעיל 1, 7, 8. אחד היתרונות של שימוש בגישה זו היא הקלות של הדמיה של אירועי קובץ מצורף, מאז חרוזים פולימרים המשמשים כפיגומים זמינים במגוון רחב של צבעים (למשל, אדום כחול, ניאון, כחול, כתום, ירוק). לפיכך, תיוג חלבון ישיר, שעלול להפריע לתפקוד, ניתן להימנע. בנוסף, המשטח מחקה צימוד תצוגת multivalent של adhesins על פני השטח החיידקים, ובכך משקף יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית קונפורמציה בהשוואה לחלבונים מסיסים.
בהשוואה למחקרים שהשתמש בחיידקים או bacteri שלמיםמוטציות אל, גישת חרוז עוקפת בעיות הקשורות להתפתחות חיידקים. לדוגמא, לטווח ארוך יותר (לדוגמא, O / N) מחקרים של הידבקות חיידקים לארח תאים באמצעות חיידקים שלמים לעתים קרובות נפגעו על ידי תופעות נלוות התפתחות חיידקים - החמצה של דלדול מדיום גידול והמזין להשפיע לרעה על תאי מארח, ושכפול חיידקי סופו של דבר פוגע ב איכות הדמיה.
לאחרונה, השימוש בadhesins מצמידים חרוז הורחב לכלול את השימוש בם ככלים לpurifications זיקה של גורמי מארח סלולארי המעורבים בתהליכי איתות במורד הזרם של קובץ מצורף חיידקים. V. parahaemolyticus MAM7, באמצעות קשירה לחומצות phosphatidic בקרום התא המארח, מפעיל הפעלת RhoA וארגון מחדש יקטין 1, 3. חרוזים בשילוב MAM נמצאים בשימוש כדי לטהר ולזהות חלבונים מעורבים בפלטפורמות האיתות התאספו כתוצאה מתא MAM-מארח כְּרִיכָה. מאז חרוזים יכוליםבקלות להיות מופרד מsupernatant על ידי צעד צנטריפוגה קצר, והחלבון של עניין הוא בשילוב קוולנטית, זה הוא שיטה טובה להשגת הפרדה מחלבונים מזהמים ולהעשיר קומפלקסי חלבונים רלוונטיים, אשר יכול לשמש ליישומים במורד כגון פרוטאומיקה או מערבי סופג.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
