Protocol
पॉलिमर मोती के लिए प्रोटीन की 1. रासायनिक युग्मन
- Thiol-एमाइन दिशात्मक युग्मन
नोट: इस प्रोटोकॉल प्रोटीन Sulfosuccinimidyl 4- (पी -maleimidophenyl) butyrate पार से जोड़ने एजेंट के रूप में (Sulfo-SMPB) (चित्रा 1) का उपयोग, बहुलक मोती-क्रियाशील अमाइन युक्त सिस्टीन के युग्मन के लिए उपयुक्त है।
चित्रा 1. पार से जोड़ने बहुलक मोती के लिए प्रोटीन की दिशात्मक thiol-एमाइन युग्मन के लिए इस्तेमाल किया रणनीति। अमाइन संशोधित polystyrene मोती Sulfo-SMPB साथ सक्रिय हैं। maleimide मोतियों को युगल प्रोटीन directionally करने के लिए स्वतंत्र cysteines साथ प्रतिक्रिया करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।- अभिकर्मकों की तैयारी:
- पीबीएस (100 मिमी सोडियम फास्फेट, 150 मिमी NaCl, पीएच 7.0) और आटोक्लेव तैयार करें। तुरंत उपयोग करने से पहले एक 100x शेयर TCEP की (पीबीएस में 0.5 एम या 287 मिलीग्राम / एमएल) (Tris (2 carboxyethyl) phosphine) तैयार करें।
- एक 5x शेयर Sulfo-SMPB की (DH में 10 मिमी या 4.58 मिलीग्राम / एमएल 2 ओ) का उपयोग करने के तुरंत पहले तैयार करें।
- एक 10x शेयर (500 मिमी या 88 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर, पीएच 7.0) तुरंत उपयोग करने से पहले सिस्टीन के लिए तैयार करें।
- मनका सक्रियण:
- धीरे inverting द्वारा मनका निलंबन मिलाएं और 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस, पीएच 7.0 से युक्त एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मनका निलंबन (जैसे, 12 एमएल) के लिए आवश्यक राशि हस्तांतरण।
- धीरे एक microcentrifuge (16,000 XG पर 2 मिनट) में centrifugation द्वारा माला और गोली धोने के लिए नीचे विंदुक ऊपर और।
- ध्यान से एक विंदुक और त्यागने के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें। ताजा बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में मनका गोली Resuspend और वाशिंग कदम दोहराएँ। पीबीएस के 0.8 मिलीलीटर में मनका गोली Resuspend।
- , हौसले से तैयार 10 मिमी Sulfo-SMPB के 200 मिलीलीटर जोड़ें एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए2 मिमी की राशन।
- एक घूर्णन पहिया पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मनका निलंबन सेते हैं।
- प्रोटीन में कमी:
- सक्रियण कदम के ऊष्मायन अवधि के दौरान, तो यह तुरंत सक्रिय मोतियों को जोड़ा जा सकता है निम्नलिखित युग्मन कदम के लिए प्रोटीन तैयार करते हैं।
नोट: इस कमी कदम हमेशा जीएसटी (glutathione एस ट्रांस्फ़्रेज़) संलयन प्रोटीन के लिए आवश्यक नहीं है, यद्यपि यह एक उच्च युग्मन दक्षता सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की है।- प्रोटीन एकाग्रता की जाँच करें, और युग्मन प्रतिक्रिया के लिए आवश्यक अंतिम एकाग्रता के लिए इसे समायोजित। नोट: पीबीएस में 6 मिमी प्रोटीन, और 1 मिलीलीटर की मात्रा में आम तौर पर इस्तेमाल कर रहे हैं।
- 5 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता देने के लिए TCEP शेयर जोड़ें। आरटी पर 30 मिनट के लिए समाधान सेते हैं।
नोट: प्रतिक्रिया मिश्रण सीधे निम्नलिखित युग्मन प्रतिक्रिया के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - समर्थक का निर्धारण करने के लिए प्रोटीन समाधान की एक छोटी राशि (कुछ मिलीलीटर) बरकरार Tein एकाग्रता और युग्मन दक्षता की गणना (धारा 2 देखें)।
- सक्रियण कदम के ऊष्मायन अवधि के दौरान, तो यह तुरंत सक्रिय मोतियों को जोड़ा जा सकता है निम्नलिखित युग्मन कदम के लिए प्रोटीन तैयार करते हैं।
- प्रोटीन युग्मन कदम:
- Centrifugation (2 मिनट, एक microcentrifuge में 16,000 XG) द्वारा सक्रिय मोती गोली, और ताजा बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में एक बार गोली धोने।
- वांछित प्रोटीन एकाग्रता देने के लिए तैयार प्रोटीन समाधान (जैसे, 1 मिलीलीटर) में गोली Resuspend।
नोट: युग्मन चरण के दौरान प्रोटीन एकाग्रता औसत युग्मन दक्षता (युग्मन दक्षता के निर्धारण के लिए धारा 2 देखें) और (1.1.4.3 में गणना के रूप में) वांछित युग्मन घनत्व पर निर्भर करेगा। युग्मन चरण के दौरान प्रोटीन एकाग्रता लगभग 6 मिमी होना चाहिए ताकि दक्षता, लगभग 85% और 10x मनका निलंबन में वांछित अंतिम एकाग्रता 5 मिमी है। - निम्न सूत्र का उपयोग युग्मन घनत्व की गणना:
JPG "/> जहां
ρ ग युग्मन घनत्व [प्रोटीन अणुओं की संख्या / एनएम 2],
प्रोटीन सान्द्र प्रोटीन एकाग्रता [मिलीलीटर मिलीग्राम /],
प्रोटीन एम, प्रोटीन आणविक वजन [da] डब्ल्यू
मनका सान्द्र मनका एकाग्रता [मोतियों की संख्या / एल],
डी मनका व्यास [एनएम 2]
एवोगेड्रो के नंबर - औसत ligand रिक्ति की गणना करने के युग्मन घनत्व का उपयोग करें:
- एक घूर्णन पहिया पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए प्रोटीन-मनका निलंबन सेते हैं।
नोट: कुछप्रोटीन आरटी पर स्थिर नहीं हो सकता। इन मामलों में, प्रतिक्रिया 4 डिग्री सीओ / एन से बाहर किया जा सकता है। - 50 मिमी की एक अंतिम एकाग्रता के लिए सिस्टीन शेयर जोड़कर मनकों पर शेष सक्रिय समूहों निष्क्रिय और एक घूर्णन पहिया पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए निलंबन सेते हैं। Centrifugation (2 मिनट, एक microcentrifuge में 16,000 XG) द्वारा मोती गोली।
- प्रोटीन एकाग्रता और युग्मन दक्षता की गणना का निर्धारण करने के लिए सतह पर तैरनेवाला रखें (खंड 2 देखें)।
- अंतिम उत्पाद देने के लिए ताजा पीबीएस 1 मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर पीबीएस और resuspend के साथ दो बार मनका गोली धो लें।
नोट: ऊपर प्रोटोकॉल आम तौर पर बाद के प्रयोगों (धारा 3 देखें) के लिए एक 10x स्टॉक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो 5 मिमी प्रोटीन के अंतिम एकाग्रता, पर, युग्मित प्रोटीन के 1 मिलीलीटर दे देंगे। - प्रोटोकॉल की धारा 3 के लिए आगे बढ़ने के लिए, मनका शेयर के 100 मिलीग्राम / मिलीलीटर के साथ काम करते हैं, या 500 एनएम प्रोटीन की एक अंतिम एकाग्रता में। नोट: इस procedur के लिए एक अच्छा प्रारंभिक बिंदुई 2 एनएम 3 × 10 -4 प्रोटीन / औसत युग्मन घनत्व या 2 मिमी व्यास का मनका पर 57 एनएम के एक औसत रिक्ति है, जिसके परिणामस्वरूप 2 × 10 से 12 मोती / मिलीलीटर हो जाएगा।
- अभिकर्मकों की तैयारी:
- Thiol-carboxy दिशात्मक युग्मन
नोट: इस प्रोटोकॉल कार्बाक्सिल-क्रियाशील polystyrene मोती के लिए प्रोटीन युक्त सिस्टीन युग्मन के लिए उपयुक्त है। कार्बाक्सिल आधा भाग पहला, संशोधित अमाइन और फिर पार से जुड़े Sulfo-SMPB (चित्रा 2) का उपयोग कर एक-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (ईडीसी) / एन hydroxysuccinimide (एनएचएस) का उपयोग कर सक्रिय है।
चित्रा 2. पार से जोड़ने बहुलक मोती के लिए प्रोटीन की दिशात्मक thiol-कार्बाक्सिल युग्मन के लिए इस्तेमाल किया रणनीति। Carboxylated polystyrene मोती पहली ईडीसी के साथ सक्रिय और एक अर्द्ध स्थिर एनएचएस एस्टर के लिए फार्म का एनएचएस के साथ संशोधित कर रहे हैं। Ethylenedi के बाद अमाइन युग्मनSulfo-SMPB के साथ प्रतिक्रिया करता है जो एक स्वतंत्र एमाइन समूह में अमाइन का परिणाम है। Maleimide मोती तो। मोतियों को युगल प्रोटीन directionally करने के लिए स्वतंत्र cysteines के साथ प्रतिक्रिया कर सकते हैं सक्रिय यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।- अभिकर्मकों की तैयारी:
- पीबीएस (100 मिमी सोडियम फास्फेट, 150 मिमी NaCl, पीएच 7.0) और आटोक्लेव तैयार करें।
- तुरंत उपयोग करने से पहले TCEP की (पीबीएस में 0.5 एम या 287 मिलीग्राम / एमएल) एक 100x स्टॉक तैयार।
- एक 10x शेयर तुरंत उपयोग करने से पहले ईडीसी की (पीबीएस में 20 मिमी, या 4 मिलीग्राम / एमएल) (1-इथाइल-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide) तैयार करें।
- एक 10x शेयर एनएचएस की (पीबीएस में 50 मिमी, या 6 मिलीग्राम / एमएल) (एन hydroxysuccinimide) का उपयोग करने के तुरंत पहले तैयार करें।
- एक 5x शेयर Sulfo-SMPB की (DH में 10 मिमी या 4.58 मिलीग्राम / एमएल 2 ओ) का उपयोग करने के तुरंत पहले तैयार करें।
- तुरंत ख सिस्टीन की एक 10x शेयर (500 मिमी या 88 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर, पीएच 7.0) तैयार करेंefore उपयोग करें।
- मनका सक्रियण:
- धीरे inverting द्वारा मनका निलंबन मिलाएं और 1 मिलीलीटर बाँझ पीबीएस, पीएच 7.0 से युक्त एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मनका निलंबन (जैसे, 12 एमएल) के लिए आवश्यक राशि हस्तांतरण।
- धीरे एक microcentrifuge (16,000 XG पर 2 मिनट) में centrifugation द्वारा माला और गोली धोने के लिए नीचे विंदुक ऊपर और।
- ध्यान से एक विंदुक और त्यागने के साथ सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
- ताजा बाँझ पीबीएस के 1 मिलीलीटर में मनका गोली Resuspend और वाशिंग कदम दोहराएँ।
- पीबीएस के 0.8 मिलीलीटर में मनका गोली Resuspend।
- 10x ईडीसी शेयर के 100 मिलीलीटर (2 मिमी अंतिम एकाग्रता) और मनका निलंबन के लिए 10x एनएचएस शेयर समाधान (5 मिमी अंतिम एकाग्रता) के तुरंत 100 मिलीलीटर जोड़ें।
- एक घूर्णन पहिया पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए मनका निलंबन सेते हैं।
- 0.8 मिलीलीटर ताजा बाँझ पीबीएस में पीबीएस और resuspend के 1 मिलीलीटर में एक बार मोती धो लें।
- 200 मिलीलीटर ethylenediamine जोड़ें, और इंकएक घूर्णन पहिया पर 25 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए मनका निलंबन Ubaté।
- 1 मिलीलीटर पीबीएस के साथ एक बार मोती धो और ताजा पीबीएस के 0.8 मिलीलीटर में मोती resuspend।
- खंड 1.1.2.4 (Sulfo-SMPB साथ मनका सक्रियण) के रूप में खंड 1.1.2 के तहत वर्णित से आगे बढ़ें और धारा 1.1 (thiol-एमाइन दिशात्मक युग्मन) में वर्णित प्रोटोकॉल के बाकी का पालन करें। धारा 1.1 में वर्णित उन लोगों के लिए समान तरीके से एक में प्रोटीन की तैयारी और प्रोटीन युग्मन चरणों का प्रदर्शन।
नोट: (लगभग। 75%) इस प्रोटोकॉल का उपयोग ठेठ युग्मन दक्षता इसलिए एक ही युग्मन घनत्व को प्राप्त करने के लिए तदनुसार प्रारंभिक प्रोटीन एकाग्रता समायोजित खंड 1.1 की तुलना में थोड़ा कम है।
- अभिकर्मकों की तैयारी:
युग्मन दक्षता 2. निर्धारण
नोट: इस प्रकार के रूप ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक 10 और वर्णमिति assays, प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण का उपयोग करें:
- धीरे करने के लिए ई ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक पलटना अभिकर्मक के Nsure एकरूपता।
- बफर में 0.1 से 1.5 मिलीग्राम / एमएल बीएसए को सांद्रता को कवर प्रोटीन मानकों तैयार करते हैं, एक 10 मिलीग्राम / एमएल बीएसए शेयर समाधान का उपयोग करना।
- एक 96 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक के 250 मिलीलीटर जोड़ें। सभी नमूनों, प्रोटीन मानकों और नकारात्मक नियंत्रण (केवल बफर) के लिए पर्याप्त कुओं तैयार करें।
- 96 अच्छी तरह से थाली में अभिकर्मक के लिए (नकारात्मक नियंत्रण के लिए प्रोटीन मानकों या बफर), प्रोटीन नमूने के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
- 10 मिनट के लिए आरटी पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन पर थाली सेते हैं।
- एक प्लेट रीडर का उपयोग कर 595 एनएम पर absorbance के उपाय।
- A595 एनएम बनाम बीएसए एकाग्रता का एक मानक वक्र उत्पन्न और प्रारंभिक और सतह पर तैरनेवाला नमूनों में प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए इस का उपयोग करें।
- इस प्रकार के रूप युग्मित प्रोटीन की एकाग्रता की गणना:
- युग्मन दक्षता के रूप में की गणना:
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प्रतियोगिता assays में मनका युग्मित adhesins की 3. का प्रयोग करें
- तैयारी:
- बीज 24 अच्छी तरह से थाली में 150,000 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता प्रतियोगिता परख से पहले दिन में हेला कोशिकाओं की अच्छी तरह से प्रति 1 मिलीलीटर, कोशिकाओं से पहले प्रयोग शुरू करने के लिए लगभग 80% confluency तक पहुँचने के लिए अनुमति देने के लिए।
- तीन प्रतियों में प्रत्येक प्रयोगात्मक हालत को निर्धारित करें। नकारात्मक नियंत्रण के लिए कुओं (प्रतियोगिता assays के दौरान जोड़ा कोई बैक्टीरिया), सकारात्मक नियंत्रण और (cytotoxicity प्रयोगों के लिए) सेल नियंत्रण (केवल प्रतियोगिता assays के दौरान जोड़ा संलयन-टैग करने के लिए मिलकर नियंत्रण मोती) शामिल हैं।
- वी के एक ताजा कॉलोनी के साथ एक 5 मिलीलीटर समुद्री पौंड (एमएलबी) संस्कृति टीका लगाना parahaemolyticus और मिलाते हुए, 30 डिग्री सेल्सियस पर हे / एन बढ़ता है।
- खंड 1. (युग्मन) में वर्णित है, पर्याप्त मनका युग्मित एमएएम तैयार करें। 10x मनका शेयर के 100 मिलीलीटर के लिए अनुमति दें प्रति अच्छी तरह से।
- प्रतियोगिता परख:
- प्रतिस्पर्धी के दिनआयन प्रयोग, जीवाणु संस्कृति की 600 आयुध डिपो को मापने।
- Additives के बिना बेरंग DMEM में बैक्टीरियल संस्कृतियों गिराए द्वारा संक्रमण मीडिया तैयार, 10% v / वी मनका निलंबन (या तो adhesin-मिलकर मोती या नियंत्रण मोती), 10 के MOI 1 मिलीलीटर की तैयारी देने के लिए, जिसमें 37 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व गर्म / अच्छी तरह से और नमूना प्रति 10-20% अतिरिक्त मात्रा। नोट: उपरोक्त वर्णित शर्तों (24 अच्छी तरह से थाली, वी parahaemolyticus, 10 MOI), हे / एन संस्कृति की आवश्यक मात्रा के लिए संस्कृति के 3/600 आयुध डिपो के रूप में गणना की है अच्छी तरह से (मिलीग्राम / एमएल) के प्रति जोड़ा जाएगा। उदाहरण के लिए, संक्रमण के माध्यम से 1 मिलीलीटर आम तौर पर, जीवाणु संस्कृति के कुछ मिलीलीटर 100 मिलीलीटर मनका निलंबन शामिल होंगे और बेरंग, unsupplemented DMEM के साथ 1 मिलीलीटर तक किया जा सकता है।
- कुओं से पुराने मध्यम निकालें और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 37 डिग्री सेल्सियस तक बाँझ पीबीएस पूर्व गर्म के 1 मिलीलीटर जोड़कर सुसंस्कृत हेला कोशिकाओं को धो लें।
- पीबीएस निकालें और अच्छी तरह से प्रति संक्रमण के माध्यम से 1 मिलीलीटर जोड़ें। इसके अलावा समाधान शेष भाग जोड़कर, नियंत्रण स्थापित0.1% ट्राइटन X-100 (cytotoxicity मापन के लिए, केवल आवश्यक सेल नियंत्रण) युक्त नियंत्रण माला और बैक्टीरिया (सकारात्मक नियंत्रण) या adhesin माला और कोई बैक्टीरिया (नकारात्मक नियंत्रण), या DMEM aining।
- समय के वांछित राशि (जैसे cytotoxicity मापन के लिए 4 घंटा या आसंजन मापन के लिए 1 घंटा) के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर एक टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में थाली सेते हैं।
नोट: मेजबान कोशिकाओं पर बैक्टीरियल आसंजन और cytotoxicity दोनों निषेध की प्रभावकारिता के लिए पढ़ने के बहिष्कार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। Cytotoxicity और आसंजन माप का समय अंक मेल खाना तो cytotoxicity संस्कृति सतह पर तैरनेवाला और लगाव assays के शेष सेल परत से निकाली गई नमूने का उपयोग का उपयोग कर निर्धारित किया जाता है, के बाद से दोनों assays, एक ही अच्छी तरह से नमूने का उपयोग किया जा सकता है।
- Cytotoxicity माप:
- संकेत समय अंक (जैसे, 4 घंटे बाद संक्रमण) में, प्रत्येक 24 अच्छी तरह से और हस्तांतरण करने से तीन बार 200 मिलीलीटर को दूरएक 96 अच्छी तरह से थाली।
- अच्छी तरह से एक नए सिरे से 96 अच्छी तरह से थाली में, 1500 XG पर प्रत्येक से 5 मिनट और हस्तांतरण 100 मिलीलीटर 96 अच्छी तरह प्लेटें स्पिन। तीन प्रतियों में 96 अच्छी तरह से थाली की ताजा कुओं के लिए संक्रमण प्रयोगों के दौरान इस्तेमाल किया मीडिया के 100 एमएल (इन रिक्त स्थान के रूप में इस्तेमाल किया जाएगा) जोड़ें।
- लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) रिलीज परख एक LDH cytotoxicity का पता लगाने किट का उपयोग और निर्माता के निर्देशों का पालन बाहर ले।
- संक्षेप में, 25 की वेतन वृद्धि में जरूरत अभिकर्मक की राशि की गणना (62 नमूने मापा जा रहे हैं जैसे, अगर, 75 आदि के लिए पर्याप्त अभिकर्मक मिश्रण बनाने के लिए)।
- उदाहरण के लिए, 100 नमूने लिए, अभिकर्मक बी पलटना के 250 μl साथ अभिकर्मक ए की 11.25 मिलीलीटर मिश्रण, झाग से बचने के लिए भंवर नहीं है।
- एक मल्टी चैनल पिपेट साथ pipet करने में सक्षम होने के लिए एक जलाशय में मिश्रण डालो। प्रत्येक नमूने के लिए अभिकर्मक मिश्रण के 100 μl जोड़ें।
- आरटी पर थाली सेते हैं और 10, 20, 30 मिनट पर एक प्लेट रीडर पर 490 एनएम पर absorbance पढ़ा। सेल नियंत्रण नमूना के absorbance उच्च लेकिन अभी भी प्लेट पाठक (आमतौर पर, 2-3 absorbance इकाइयों) के रैखिक सीमा के भीतर है, जिसके लिए डेटा सेट का विश्लेषण करें।
- रूपांतरण के लिए निम्न सूत्र का उपयोग,% cytotoxicity के रूप में परिणाम एक्सप्रेस:
- बैक्टीरियल आसंजन की माप:
- संकेत समय अंक (जैसे, एक घंटे बाद संक्रमण) में सेल परत से मीडिया को दूर।
- अच्छी तरह से किसी भी संयुक्त राष्ट्र जुड़ी कोशिकाओं को हटाने के लिए बाँझ, पूर्व गर्म पीबीएस (1 मिलीलीटर पीबीएस प्रत्येक के कम से कम 3-4 जलरंग) के साथ सेल परत धो लें।
- पीबीएस में ट्राइटन X-100 समाधान वी एक बाँझ 1% वी के 1 मिलीलीटर जोड़ने / प्रति अच्छी तरह से Lyse मेजबान कोशिकाओं। 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली सेते हैं।
- 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों अलग करने के लिए अच्छी तरह से प्रत्येक की सामग्री स्थानांतरित करने से पहले प्रत्येक नमूना ऊपर और नीचे कई बार पिपेट। नमूनों में से 10 गुना धारावाहिक dilutions तैयारबाँझ पीबीएस में (जैसे, नमूने के 100 मिलीग्राम और पीबीएस के 900 मिलीलीटर का उपयोग करें)।
- प्लेट 100 एमएलबी अगर पर प्रत्येक नमूने की मिलीलीटर और एक सेल स्प्रेडर का उपयोग कर फैल गया। जीवाणु उपभेदों और समय बिंदु के आधार पर थाली करने के लिए dilutions जो अनुकूलन। नोट: वर्णित प्रयोगात्मक स्थापना के लिए, 10 5 या 10 6 गुना dilutions CFUs का एक उपयुक्त संख्या दे।
- 37 डिग्री सीओ / एन प्लेटें सेते और कॉलोनी गिनती से बैक्टीरिया की गणना करें।
Representative Results
वी parahaemolyticus adhesin MAM7 मेजबान सतह रिसेप्टर्स की मान्यता में शामिल सात मिलकर स्तनधारी सेल प्रविष्टि (एम) डोमेन में शामिल है। हम वी के साथ प्रतिस्पर्धा करने के लिए इन सामग्रियों की क्षमता का परीक्षण करने के लिए सभी सात मिलकर एम डोमेन (MAM7) या केवल प्रथम एम डोमेन (MAM1) या तो शामिल किया पॉलीस्टीरिन पुनः संयोजक करने के लिए मिलकर मोती, शुद्ध टुकड़े इस्तेमाल किया बाध्यकारी मेजबान सेल के लिए parahaemolyticus और आसंजन अवरोधकों के रूप में इन सामग्रियों के परिणामस्वरूप प्रभावकारिता। हेला कोशिकाओं वी से संक्रमित थे इन विट्रो संक्रमण से उत्पन्न parahaemolyticus तनाव POR1, और cytotoxicity 4 घंटा (चित्रा 3) के बाद मूल्यांकन किया गया था। 0.1% ट्राइटन X-100 (सकारात्मक सेल नियंत्रण) के साथ हेला कोशिकाओं का इलाज पूरा सेल में हुई, असंक्रमित कोशिकाओं POR1 साथ अनुपचारित कोशिकाओं की इन विट्रो संक्रमण सेल का बहुत ही उच्च स्तर में हुई। Cytotoxicity का स्तर बहुत कम दिखाया और इस MAM7-सह द्वारा हिचकतेमोती upled लेकिन MAM1 युग्मित नहीं या जीएसटी युग्मित नियंत्रण मोती (चित्रा 3)।
विब्रियो parahaemolyticus की चित्रा 3. विशेषता प्रतियोगिता assays के दौरान उपकला कोशिकाओं में cytotoxicity प्रेरित किया। प्रकोष्ठों वी के साथ इलाज किया गया parahaemolyticus (उपाध्यक्ष), (+) के साथ संकेत दिया है, या कोई बैक्टीरिया (-) विभिन्न प्रतिस्पर्धा संस्थाओं (। COMP) की उपस्थिति में संकेत के रूप में। ये या तो कोई कंप्यूटर अनुप्रयोग शामिल थे। (-), MAM7 मोती (MAM7), MAM1 मोती (MAM1) या जीएसटी नियंत्रण मोती (जीएसटी)। नियंत्रण के रूप में, कोशिकाओं ट्राइटन X-100 (ट्राइटन, सेल नियंत्रण) के साथ या तो इलाज किया, या असंक्रमित (uninf) छोड़ दिया गया। धारा 3 में वर्णित के रूप में 4 घंटे के बाद LDH रिहाई मापा गया था, और परिणाम ट्राइटन नियंत्रण (100%) और ऊपर वर्णित के रूप में कारतूस (0%) के लिए सामान्यीकृत। परिणाम तीन प्रतियों प्रयोगों से ± SEM के साधन हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
वी के गणन MAM7-, MAM1-, या जीएसटी नियंत्रण मोती, साथ incubated अनुपचारित हेला कोशिकाओं, या कोशिकाओं या तो से जुड़ी parahaemolyticus MAM7-मोती लेकिन MAM1- नहीं या GST- नियंत्रण मोती वी outcompete पता चला है कि कुर्की के लिए parahaemolyticus कोशिका की सतह रिसेप्टर्स (चित्रा 4) की मेजबानी करने के लिए।
प्रतियोगिता प्रयोगों के दौरान बैक्टीरियल लगाव की चित्रा 4. विशेषता। हेला कोशिकाओं वी से संक्रमित थे parahaemolyticus अभाव में POR2 (उपाध्यक्ष +), (-) या संस्थाओं प्रतिस्पर्धा की उपस्थिति इस प्रकार है: MAM7 मोती (MAM7), MAM1 मोती (MAM1) या जीएसटी नियंत्रण मोती (जीएसटी) (कंप्यूटर अनुप्रयोग।)। बैक्टीरियल आसंजन के रूप में, एक घंटे के बाद मापा गया था खंड में वर्णित 3. परिणाम तीन प्रतियों प्रयोगों से ± SEM के साधन हैं। मीन्स (सीएफयू / एमएल में FLTR) 2.3010 6, 1.5310 5, 2.0510 6, 2.1210 6 कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Fluorophore लेबल मोती करने के लिए मिलकर adhesins कोशिकाओं की मेजबानी के लिए जीवाणु आसंजन की नकल और सेलुलर इमेजिंग (चित्रा 5) के लिए शक्तिशाली उपकरण हैं कि सामग्री की पीढ़ी में परिणाम। MAM7 युग्मित फ्लोरोसेंट नीले मोती का प्रयोग, हम उपकला कोशिकाओं को MAM7 की मध्यस्थता कुर्की की प्रक्रिया होती है। कोशिकाओं की मेजबानी के लिए MAM7 की कुर्की rearrangements और सह-कल्पना की एफ actin (चित्रा 5 ब) के लिए दाग rhodamine-phalloidin उपयोग कर रहे थे, जो तनाव फाइबर के गठन actin में हुई।
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हेला को MAM7 युग्मित मोतियों की चित्रा 5. तैयारी और fluorophore का उपयोग फ्लोरोसेंट नीले biomimetic मोतियों की (ए) सस्पेंशन (सही ट्यूब, 10x शेयर)। इमेजिंग प्रयोजनों के लिए biomimetic मोती लेबल और नियंत्रण (बाएं ट्यूब) बफर। (बी) के अनुलग्नक actin rearrangements और तनाव फाइबर गठन में कोशिकाओं का परिणाम है। (Rhodamine-phalloidin के साथ दाग लाल,) फ्लोरोसेंट नीले मोती की कुर्की और जिसके परिणामस्वरूप actin तनाव फाइबर माइक्रोस्कोपी द्वारा imaged थे। बार, 10 माइक्रोन। पैनल बी में छवियां लिम एट अल। 1 से अनुकूलित और क्रिएटिव कॉमन्स रोपण लाइसेंस के तहत reproduced किया गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Discussion
इस के साथ साथ, हम क्रमश: amine- को युगल thiol प्रोटीन युक्त करने के लिए इस्तेमाल किया है या कार्बोक्सिलेट संशोधित polystyrene मोती किया जा सकता है, जो दो प्रोटोकॉल, का वर्णन है। कारण प्रक्रिया में आसानी के लिए, thiol-एमाइन युग्मन के लिए बेहतर है, लेकिन वांछित मनका विनिर्देश (व्यास, प्रतिदीप्ति गुण) पर निर्भर करता है, अमाइन-क्रियाशील मोतियों के उपयोग संभव नहीं हो सकता और इसलिए हम कार्बोक्सिलेट परिवर्तित कर देंगे, जो एक प्रोटोकॉल को शामिल किया है - एक amine आधा भाग में शोधकर्ता पाड़ के चुनाव में सबसे बड़ी संभव लचीलापन देने के लिए। प्रोटीन, दिशात्मक युग्मन युक्त किसी भी सिस्टीन के लिए दोनों thiol-एमाइन और thiol-कार्बाक्सिल युग्मन काम (यानी, इसकी एन टर्मिनस प्रति प्रोटीन, सतह प्रदर्शन नकल उतार का स्थिरीकरण) सिस्टीन अवशेषों के बिना एक प्रोटीन की आवश्यकता है, कि जीएसटी संलयन के रूप में उत्पादन किया जाता है प्रोटीन, या उस साइट के द्वारा शुरू की गई एक टर्मिनल सिस्टीन अवशेषों उत्परिवर्तजनन निर्देशित होता है। कई प्रतिक्रियाशील cysteines समाहित कर रहे हैंप्रोटीन के भीतर, इस प्रोटीन समारोह में बाधा हो सकती है, जो बिना सोचे समझे स्थिरीकरण को बढ़ावा मिलेगा। कई बैक्टीरियल adhesins स्वाभाविक रूप से cysteines शामिल नहीं है। इस देशी संरचना और समारोह उत्परिवर्ती में रखा जाता है यह सुनिश्चित करने के लिए व्यापक assays की आवश्यकता होगी, हालांकि दूसरों के लिए, ये साइट निर्देशित उत्परिवर्तजनन द्वारा हटाया जा सकता है। जीएसटी संलयन प्रोटीन के लिए, मोती करने के लिए मिलकर शुद्ध जीएसटी टैग एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। ये अक्सर एक साथ पेड़ों का झुरमुट या गैर विशेष कोशिकाओं का पालन करने के लिए एक उच्च प्रवृत्ति के रूप में एक नियंत्रण के रूप में uncoupled मोती का प्रयोग, बचा जाना चाहिए। केवल ईडीसी का उपयोग करने का प्रोटोकॉल 1.2। एक सरलीकृत संस्करण है, इस मामले युग्मन दिशात्मक युग्मन की गारंटी नहीं है इसलिए प्रोटीन में प्राथमिक amines के माध्यम से जगह ले लेता है और फिर भी में, कार्बाक्सिल-क्रियाशील बहुलक मोती युगल प्रोटीन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एक एजेंट को कम करने के रूप में TCEP ऐसे dithiothr के रूप में अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है और आमतौर पर इस्तेमाल एजेंटों को कम करने के साथ बदल नहीं किया जाना चाहिएeitol (डीटीटी) या 2-mercaptoethanol (बीएमई), उनके भीतर निहित thiols thiol-maleimide युग्मन कदम में प्रोटीन युग्मन के साथ प्रतिस्पर्धा करेंगे। पीबीएस अन्य buffers के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है, लेकिन निम्न विचार के साथ: बफ़र प्राथमिक amines में नहीं हो सकता है (ताकि Tris युक्त बफ़र्स उपयुक्त नहीं हैं)। बहुत कम (<10mm) नमक सांद्रता वाले buffers के उपयोग clumping मनका की ओर जाता है और यह भी बचा जाना चाहिए। प्रोटीन पवित्रता भी एक महत्वपूर्ण कारक इस प्रक्रिया के दौरान विचार करने के लिए, और उच्च गुणवत्ता वाले डेटा प्राप्त करने के लिए है, शुद्ध प्रोटीन का प्रयोग किया जाना चाहिए। हम नियमित रूप से कम से कम एक समानता शुद्धि और जेल निस्पंदन कदम सहित कई चरणों में प्रोटीन को शुद्ध, लेकिन विनिमय क्रोमैटोग्राफी आयन कुछ मामलों में एक तीसरे कदम के रूप में किया जाता है। एसडीएस पृष्ठ से न्याय के रूप में एक परिणाम के रूप में युग्मन के लिए इस्तेमाल किया प्रोटीन की पवित्रता, आमतौर पर 90% या उससे अधिक है।
यह वीं के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रारंभिक प्रतिक्रिया मिश्रण में दोनों प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करने के लिए सिफारिश की हैप्रतिक्रिया पूरा होने के बाद ई सतह पर तैरनेवाला। यह स्पष्ट मनका मिलकर प्रोटीन की एकाग्रता, और इस प्रकार युग्मन घनत्व निर्धारित करने में मदद मिलेगी। दोनों मूल्यों का निर्धारण भी युग्मन दक्षता की गणना के लिए अनुमति देगा। वांछित अंतिम एकाग्रता और युग्मन के घनत्व को प्राप्त करने के लिए, बाद प्रतिक्रियाओं में प्रारंभिक प्रोटीन समाधान तैयार करते समय यह ध्यान में रखा जा सकता है। प्रतिक्रिया में पदार्थों में से कोई भी इस्तेमाल किया सांद्रता में डाई जटिल गठन के साथ हस्तक्षेप के रूप में ब्रैडफोर्ड अभिकर्मक विशेष रूप से, पहले और युग्मन प्रतिक्रिया के बाद प्रोटीन एकाग्रता के निर्धारण के लिए अनुकूल है। कम प्रोटीन सांद्रता इस्तेमाल हो रहे हैं, तो इस विधि में एक और अधिक संवेदनशील पता लगाने विधि द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता है, हालांकि ध्यान यह युग्मन प्रतिक्रिया के भीतर निहित पदार्थों के साथ संगत हो गया है इस तथ्य को भुगतान किया जाना है। यह भी देखभाल के साथ पाउडर अभिकर्मकों हौसले से तैयार अभिकर्मकों का उपयोग करें और संभाल करने के लिए सिफारिश की है (उदाहरण के लिए, स्टोरएक मोहरबंद कंटेनर में और सिलिका मोती का उपयोग करें, युग्मन दक्षता को प्रभावित करती है अभिकर्मकों की गुणवत्ता के बाद से नमी ड्राइंग अभिकर्मकों) से बचने के लिए। युग्मन दक्षता अपेक्षा से कम है, तो संभव उपचार प्रारंभिक मनका और प्रोटीन सांद्रता बढ़ शामिल हैं। उच्च सांद्रता का इस्तेमाल किया जा रहा है, युग्मन अभिकर्मकों की एकाग्रता आनुपातिक वृद्धि होने के लिए पर्याप्त दाढ़ अतिरिक्त सुनिश्चित करने के लिए है। मनका / प्रोटीन सांद्रता में संशोधन करना आम तौर पर एक बेहतर अनुकूलन की दिशा में कदम बजाय प्रतिक्रिया समय बढ़ रही है। मनका युग्मन के लिए प्रोटोकॉल लंबा कर रहे हैं, हम आमतौर पर सामग्री की एक बड़ी खेप तैयार करते हैं। निलंबन की aliquots तरल नाइट्रोजन में स्नैप-जमे हुए हैं और कई महीनों के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है। Thawed aliquots refrozen नहीं किया जाना चाहिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखा और 1-2 दिनों के भीतर किया जाना चाहिए। बहरहाल, यह शुरू में एक छोटे बैच पर परीक्षण किया जाना चाहिए के रूप में इस्तेमाल प्रोटीन की प्रकृति और स्थिरता के साथ अलग अलग होंगे।
विब्रियो parahaemolyticus साथ हेला उपकला कोशिकाओं के संक्रमण को बाधित करने के लिए मनका युग्मित mams की क्षमता को मापने के लिए किया जाता है या एक पढ़ने के लिए बाहर के रूप में cytotoxicity कम हो जाता है । दोनों ही मामलों में, तैयारी और प्रतियोगिता assays के ही प्रोटोकॉल का पालन करें। वी के readout के आधार पर, विभिन्न प्रकारों parahaemolyticus इस्तेमाल किया जा रहा है: POR1 cytotoxicity मापन के लिए प्रयोग किया जाता है साइटोटोक्सिक तनाव, गैर साइटोटोक्सिक तनाव POR2 बैक्टीरियल आसंजन को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है, जबकि कोशिका मृत्यु और सेल टुकड़ी संलग्न बैक्टीरिया बढ़ाता के लिए प्रक्रिया समझौता के बाद से।
प्रारंभ में, प्रतियोगिताtition प्रयोगों मेजबान कोशिकाओं बैक्टीरिया के अलावा करने से पहले मोतियों के साथ पूर्व incubated पहले थे, जहां एक कदम वार प्रोटोकॉल, के रूप में स्थापित किया गया था। वी के लिए parahaemolyticus और इस्तेमाल मनका विनिर्देशों (MAM7 करने के लिए मिलकर 2 माइक्रोन मोती), दोनों माला और बैक्टीरिया जिसके परिणामस्वरूप cytotoxicity में बदलाव के बिना एक ही समय में जोड़ा जा सकता है। यानी, इस प्रयोगात्मक सेटअप में, मोती मेजबान सेल बाइंडिंग के लिए बैक्टीरिया outcompete। इस्तेमाल किया प्रजातियों के जीवाणु और मनका ज्यामिति पर निर्भर करता है, दो अलग-अलग चरणों के रूप में मनका आसंजन और बैक्टीरिया के संक्रमण को बनाए रखने के लिए अच्छे कारण हो सकता है। उदाहरण के लिए, गैर गतिशील बैक्टीरिया के साथ कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए, प्लेटें आमतौर पर संक्रमण मीडिया के अलावा के बाद centrifuged हैं। इस सेल परत पर मोतियों का एक बेहद असमान वितरण के लिए होता है लेकिन, जब से मनका निलंबन युक्त प्लेटों की centrifugation, बचा जाना चाहिए। छोटे कण आकार का इस्तेमाल किया जा रहा है, मोती, कोशिका की सतह पर व्यवस्थित करने के लिए लंबे समय तक ले जाएगा, जो मामले सु मेंfficient समय संक्रमण के लिए पहले मनका कुर्की के लिए अनुमति दी जानी चाहिए। बैक्टीरियल आसंजन बाहर पढ़ने के लिए एक के रूप में प्रयोग किया जाता है जब मेजबान कोशिकाओं को संक्रमित करने में काफी तनाव से क्षतिग्रस्त नहीं कर रहे हैं, जहां नमूने संलग्न बैक्टीरिया की मात्रा का ठहराव समझौता कर सकते हैं सेल टुकड़ी और सेल के रूप में, समय बिंदुओं पर लिया जाना चाहिए।
इसके बजाय कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा बैक्टीरियल आसंजन की गणना की, नमूने वैकल्पिक इमेजिंग (चित्रा 5) के लिए कार्रवाई की जा सकती है। इस मामले में, टिशू कल्चर कोशिकाओं बल्कि सीधे कुओं में से, कांच कवर फिसल जाता है पर वरीयता प्राप्त किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त फ्लोरोसेंट माला और बैक्टीरिया के संक्रमण-विशिष्ट मेजबान सेल मार्कर के साथ-साथ इस्तेमाल किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, प्रतियोगिता प्रयोगों आमतौर पर मेजबान कोशिकाओं 'actin cytoskeleton दाग और फ्लोरोसेंट नीले मोती और फ्लोरोसेंट के साथ एक साथ, संक्रमण से उत्पन्न रूपात्मक परिवर्तन का आकलन करने के लिए फ्लोरोसेंट लाल rhodamine-phalloidin का उपयोग imaged हैंहरे (GFP व्यक्त या SYTO18 दाग) बैक्टीरिया।
स्ताफ्य्लोकोच्चुस FnBPA, स्ट्रैपटोकोकस pyogenes एफ 1 FUD और विब्रियो parahaemolyticus एमएएम सहित मनका युग्मित adhesins की एक श्रृंखला, आसंजन, आसंजन निषेध और आसंजन के योगदान का अध्ययन करने के biomimetic माल के रूप में इस्तेमाल किया गया है रोगज़नक़ की मध्यस्थता cytotoxicity 1, 7, 8। मचानों के रूप में इस्तेमाल बहुलक मोती रंग (जैसे, नीले, फ्लोरोसेंट लाल, नीले, हरे, नारंगी) की एक विस्तृत रेंज में उपलब्ध हैं के बाद से इस दृष्टिकोण का उपयोग कर के लाभ में से एक लगाव घटनाओं के दृश्य में आसानी है। इस प्रकार, समारोह के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, जो प्रत्यक्ष प्रोटीन लेबलिंग, बचा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, इस प्रकार घुलनशील प्रोटीन की तुलना में एक अधिक physiologically प्रासंगिक रचना को दर्शाती है, युग्मन mimics बैक्टीरियल सतह पर adhesins की multivalent प्रदर्शन सतह।
बरकरार बैक्टीरिया या bacteri का उपयोग अध्ययन की तुलनाअल म्यूटेंट, मनका दृष्टिकोण बैक्टीरिया विकास के साथ जुड़ी समस्याओं में गतिरोध उत्पन्न। नकारात्मक मेजबान कोशिकाओं को प्रभावित मध्यम विकास और पोषक तत्वों की कमी के अम्लीकरण, और बैक्टीरियल प्रतिकृति अंततः समझौता - उदाहरण के लिए, लंबी अवधि (जैसे, हे / एन) बरकरार बैक्टीरिया का उपयोग कोशिकाओं की मेजबानी के लिए जीवाणु आसंजन का अध्ययन अक्सर बैक्टीरिया विकास के साथ घटना के द्वारा समझौता कर रहे हैं इमेजिंग गुणवत्ता।
हाल ही में, मनका-युग्मित adhesins का उपयोग बैक्टीरियल लगाव के बहाव प्रक्रियाओं संकेतन में शामिल मेजबान सेलुलर कारकों की आत्मीयता purifications के लिए उपकरण के रूप में उनके उपयोग शामिल करने के लिए बढ़ा दिया गया है। वी parahaemolyticus MAM7, मेजबान कोशिका झिल्ली में phosphatidic एसिड के लिए बाध्य के माध्यम से, RhoA सक्रियण और actin rearrangements 1, 3 से चलाता है। एमएएम-मिलकर मोती को शुद्ध और एमएएम-मेजबान सेल का एक परिणाम के रूप में इकट्ठा संकेतन प्लेटफार्मों में शामिल प्रोटीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है बंधन। मोती सकता है, क्योंकिआसानी से एक छोटी centrifugation कदम से सतह पर तैरनेवाला से अलग किया, और ब्याज की प्रोटीन covalently युग्मित है, इस तरह के प्रोटिओमिक्स या वेस्टर्न रूप में बहाव के अनुप्रयोगों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो प्रासंगिक प्रोटीन परिसरों दूषित पदार्थों को प्रोटीन से जुदाई को प्राप्त करने और बेहतर बनाने के लिए एक अच्छा तरीका है, सोख्ता।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
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- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
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