Protocol
ポリマービーズへのタンパク質の1。化学カップリング
- チオールアミン方向性結合
注意：このプロトコルは、タンパク質が、スルホスクシンイミジル4-（p個の -maleimidophenyl）ブチレート架橋剤として（スルホSMPB）（ 図1）を使用して 、ポリマービーズを官能アミンを含有するシステインの結合に適しています。
図1の架橋ポリマービーズへのタンパク質の方向性チオール-アミンカップリングのために使用される戦略を。アミン変性ポリスチレンビーズは、スルホSMPBで活性化されています。マレイミドは、ビーズに方向性結合タンパク質に遊離システインと反応する。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。- 試薬の調製：
- PBS（100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.0）で、オートクレーブを準備します。 使用直前に100倍の株式TCEP（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィン）の（PBS中0.5 Mまたは287 mg / mlの）を準備します。
- 使用直前に5倍の株式（10 mm以上の dH 2 O中4.58 mg / mlの）スルホSMPBのを準備します。
- 使用直前にシステイン（PBS、pHを7.0 mlの500 mMのか、88ミリグラム/）10倍の在庫を準備します。
- ビーズの活性化：
- 静かに反転させてビーズ懸濁液を混合し、1ミリリットル滅菌PBS、pHが7.0を含む滅菌1.5mlチューブにビーズ懸濁液（例えば、12ミリリットル）の必要量を転送します。
- 静かに微量（16,000×gで2分間）で遠心分離することにより、ビーズ、ペレットを洗浄するために上下にピペットと。
- 慎重にピペットで上清を除去し、廃棄します。新鮮な滅菌PBS 1mlにビーズペレットを再懸濁し、洗浄工程を繰り返します。 PBS 0.8 ml中にビーズペレットを再懸濁。
- 、新たに調製した10mMのスルホSMPBの200ミリリットルを追加し、最終的なコンセントを与えること2 mMのの比。
- 回転ホイール上で25℃で1時間のためのビーズ懸濁液をインキュベートします。
- タンパク質の削減：
- それはすぐに活性化したビーズに添加することができるように、活性化工程のインキュベーション期間中、次のカップリング工程のためのタンパク質を調製します。
注：この還元工程は、常に、GST（グルタチオンSトランスフェラーゼ）融合タンパク質のために必要とされていないが、それは高い結合効率を確保することをお勧めします。- タンパク質濃度を確認し、カップリング反応に必要な最終濃度に調整。注：PBSで6 mMのタンパク質、および1 mlの容量は、通常使用されています。
- 5 mMのの最終濃度を得TCEPの株式を追加します。 RTで30分間溶液をインキュベートします。
注：反応混合物を直接、次のカップリング反応のために使用することができます。 - プロを決定するためにタンパク質溶液の少量（数ml）を保持テイン濃度および結合効率の計算（セクション2を参照）。
- それはすぐに活性化したビーズに添加することができるように、活性化工程のインキュベーション期間中、次のカップリング工程のためのタンパク質を調製します。
- タンパク質カップリング工程：
- 遠心分離（2分、微量で16,000 XG）によって活性化ビーズをペレット化し、新鮮な滅菌PBS 1 mlに一回ペレットを洗浄。
- 所望のタンパク質濃度を与えるように、調製したタンパク質溶液（ 例えば 、1 ml）にペレットを再懸濁。
注：カップリング工程中のタンパク質濃度は平均カップリング効率（結合効率のための決意セクション2を参照）、（1.1.4.3で計算されるように）所望の結合密度に依存します。カップリング工程中のタンパク質濃度は約6mmであるべきであるので、効率は、約85％と10倍ビーズ懸濁液中の所望の最終濃度5 mMです。 - 以下の式を使用してカップリング密度を計算します。
JPG "/>ここで、
ρcの結合密度[タンパク質分子の数/ nmで2]
タンパク質濃タンパク質濃度[mg / mlの】
タンパク質M、タンパク質分子量[ダ] ワット
ビーズ濃ビーズ濃度[ビーズの数/ L]、
Dビーズ直径[NM 2]
アボガドロ数 - 平均リガンド間隔を計算するために、結合密度を使用します。
- 回転ホイール上で25℃で2時間のためのタンパク質 - ビーズ懸濁液をインキュベートします。
注：一部のタンパク質は、室温で安定していない可能性があります。これらの場合、反応は4°CO / Nで行うことができます。 - 50mMの最終濃度にシステインストックを添加することによって、ビーズ上の残りの活性基を失活し、回転ホイール上で25℃で30分間、懸濁液をインキュベートします。遠心分離（2分、微量で16,000 XG）によりビーズをペレット化。
- タンパク質濃度との結合効率の計算を決定するために、上清を保持し（セクション2を参照）。
- 最終生成物を得た新鮮なPBS 1ml中に1mlのPBS再懸濁で二回ビーズペレットを洗浄します。
注：上記の手順は、通常、次の実験のための10×ストックとして使用することができる5mMのタンパク質、（セクション3参照）の最終濃度で、結合したタンパク質を1mlを与えます。 - プロトコルのセクション3に進むには、ビーズストックの100ミリリットル/ mlの仕事、または500 nmのタンパク質の最終濃度で。注：このprocedurための良い出発点eは2 nm以下、直径2mmのビーズ上の57ナノメートルの平均間隔は3×10 -4タンパク質/平均結合密度が得られ、2×10 12ビーズ/ mlとなります。
- 試薬の調製：
- チオールカルボキシ方向性結合
注意：このプロトコルは、カルボキシル官能化ポリスチレンビーズのタンパク質を含有するシステインを結合するのに適しています。カルボキシル部分は、最初に、修正されたアミン、次 に架橋スルホSMPB（ 図2）を用いて、1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（EDC）/ N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）を用いて活性化されます。
図2架橋ポリマービーズへのタンパク質の方向性チオールカルボキシルカップリングのために使用される戦略である。カルボキシル化ポリスチレンビーズは、最初にEDCで活性化し、半安定NHSエステルを形成するために、NHSで修飾されています。 ethylenediのその後のアミンカップリングスルホSMPBと反応する遊離アミン基、アミン結果。マレイミドは、ビーズが、その後ビーズに方向性結合タンパク質に遊離システインと反応することができる活性化した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。- 試薬の調製：
- PBS（100 mMリン酸ナトリウム、150mMのNaCl、pH7.0）で、オートクレーブを準備します。
- 使用直前のTCEP（PBS中0.5 Mまたは287 mg / mlの、）100×ストックを準備します。
- 使用直前に、EDC（1-エチル-3-（3-ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）の10Xストック（20mMの、またはPBS中に4mg / ml）を準備します。
- 10倍株式のNHS（PBS中の50mM、または6 mg / mlの）（N-ヒドロキシ）使用直前に準備をします。
- 使用直前に5倍の株式（10 mm以上の dH 2 O中4.58 mg / mlの）スルホSMPBのを準備します。
- システインの10倍の株価（500 mm以上のPBS、pH7.0の中で88 mg / mlの）を準備し、すぐにBEFORE使用。
- ビーズの活性化：
- 静かに反転させてビーズ懸濁液を混合し、1ミリリットル滅菌PBS、pHが7.0を含む滅菌1.5mlチューブにビーズ懸濁液（例えば、12ミリリットル）の必要量を転送します。
- 静かに微量（16,000×gで2分間）で遠心分離することにより、ビーズ、ペレットを洗浄するために上下にピペットと。
- 慎重にピペットで上清を除去し、廃棄します。
- 新鮮な滅菌PBS 1mlにビーズペレットを再懸濁し、洗浄工程を繰り返します。
- PBS 0.8 ml中にビーズペレットを再懸濁。
- 10倍のEDCの株式の100ミリリットル（2 mMの最終濃度）とビーズ懸濁液に10倍のNHSストック溶液（5 mMの最終濃度）の直後に100ミリリットルを追加します。
- 回転ホイール上で25℃で30分間、ビーズ懸濁液をインキュベートします。
- 一度0.8ミリリットルでPBSおよび再懸濁し、1mlの新鮮な滅菌PBSでビーズを洗浄します。
- 200ミリリットルエチレンジアミンを追加し、INC回転ホイール上で25℃で1時間のためのビーズ懸濁液をubate。
- 1mlのPBSで一回ビーズを洗浄し、新鮮なPBS 0.8 ml中にビーズを再懸濁します。
- セクション1.1.2で説明したようにセクション1.1.2.4（スルホSMPBとビーズ活性化）から進み、セクション1.1（チオール - アミン方向性結合）に記載されているプロトコルの残りの部分に従ってください。 1.1節で説明したものと同一の方法で、タンパク質調製物とタンパク質カップリング手順を実行します。
注：（約75％）は、このプロトコルを使用する典型的なカップリング効率は、従って、同一の結合密度を達成するために、それに応じて、最初のタンパク質濃度を調節セクション1.1と比較して、わずかに低いです。
- 試薬の調製：
結合効率の2決意
注：以下のようにブラッドフォード試薬10と比色アッセイ、タンパク質濃度を決定するために使用します。
- 静かEにブラッドフォード試薬を反転試薬のnsure均一。
- 10 mg / mlのBSAストック溶液を用いて、緩衝液中で0.1〜1.5 mg / mlのBSAの濃度をカバーするタンパク質標準を準備します。
- 96ウェルプレートのウェルにブラッドフォード試薬の250ミリリットルを追加します。 （緩衝液のみ）すべてのサンプル、タンパク質標準および陰性対照のための十分な井戸を準備します。
- 96ウェルプレート中の試薬に（ネガティブコントロールのためのタンパク質標準またはバッファ）タンパク質試料の5ミリリットルを追加します。
- 室温で10分間、オービタルシェーカー上でプレートをインキュベートします。
- プレートリーダーを用いて595 nmの吸光度を測定します。
- A595 nmの対BSA濃度の標準曲線を作成し、初期および上清サンプル中のタンパク質濃度を決定するために、これを使用しています。
- 次のように結合したタンパク質の濃度を計算します。
- などのカップリング効率を計算します。
00eq4.jpg "/>
競合アッセイでビーズ結合アドヘシンの3.
- 調製：
- 細胞は、実験前に開始し、約80％コンフルエンシーに到達させるために24ウェルプレートにシード15万細胞/ mlの濃度でHeLa細胞のウェルあたり1 mlの競合アッセイの前日、。
- 三連で各実験条件を設定します。ネガティブコントロールのウェル（競合アッセイの間に追加された細菌なし）、陽性対照および（細胞毒性実験のための）溶解コントロール（のみの競合アッセイの間に追加された融合タグに結合された制御ビーズ）が挙げられます。
- Vの新鮮なコロニーを5ミリリットル海洋LB（MLB）培養物に接種腸炎と揺れ、30℃でO / Nを育てます。
- 部1（カップリング）で説明したように、十分なビーズ結合MAMを準備します。ウェル当たり10倍のビーズストックの100ミリリットルのために許可します。
- 競合アッセイ：
- competitの日にイオン実験は、細菌培養物のOD 600を測定します 。
- 添加剤を含まない無色のDMEMに細菌培養物を希釈することにより、感染培地を用意し、10％（v / v）のビーズ懸濁液を含む37℃、（アドヘシン結合ビーズまたはコントロールビーズのいずれか）に予め温め、1ミリリットルを準備し10のMOIを与えること/ウェルとサンプルあたり10〜20％の過剰量。注：上記の条件（24ウェルプレート、 腸炎ビブリオ 、10 MOI）、O / N培養の必要量について培養3 / OD 600として計算されたウェル（ミリリットル/ ml）をあたりに添加されます。例えば、感染培地1mlを、典型的には、細菌培養の数mlを100 mlのビーズ懸濁液を含み、無色、非補充DMEMで1 mlまでなされます。
- 井戸から古い培地を除去し、各ウェルに37℃に予め温めておいた滅菌PBSを1mlを追加することで、培養したHeLa細胞を洗います。
- PBSを削除して、ウェル当たりの感染培地1mlを加えます。また、ソリューションの続きを加えることで、コントロールを設定0.1％トリトンX-100（細胞毒性の測定のために、唯一の必要な溶解制御）を含有する対照ビーズおよび細菌（陽性対照）または付着ビーズおよび細菌なし（陰性対照）、またはDMEMをaining。
- 所望の時間（例えば、細胞毒性の測定のために4時間、または接着の測定のために1時間）37℃で組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートします。
注：宿主細胞における細菌の接着および細胞毒性の両方は阻害の有効性のために読みアウトとして使用することができます。細胞毒性および接着の測定の時点とが一致した場合、細胞毒性は、培養上清を使用して決定されるので、両方のアッセイは、同一のウェルからのサンプルを用いて行ってもよいし、付着アッセイは、残りの細胞層に由来するサンプルを使用。
- 細胞毒性の測定：
- 示された時点（ 例えば 、4時間後に感染症）で、各24ウェルから3回200ミリリットルを削除してに転送96ウエルプレート。
- 1,500×gで96ウェルプレートを回転、5分間よく新鮮な96ウェルプレートにそれぞれから100 mlのを転送します。 （これらはブランクとして使用されます）三連で96ウェルプレートのウェルに新鮮な感染実験の際に使用されるメディアの100ミリリットルを追加します。
- LDH細胞毒性検出キットを用い、製造業者の説明書に従って、乳酸脱水素酵素（LDH）放出アッセイを行います。
- 簡単に述べると、25単位で必要な試薬の量を計算する（62サンプルが測定される場合、例えば 、75などのための十分な試薬混合物を構成します）。
- 例えば、100サンプルに対して、試薬Bの反転の250μlの試薬Aの11.25ミリリットルを混ぜ、発泡避けるために渦をしないでください。
- マルチチャンネルピペットでピペッティングすることができるように容器内の混合物を入れてください。各サンプルに100μlの試薬混合物を追加します。
- 室温でプレートをインキュベートし、10、20、30分でプレートリーダーで490 nmの吸光度を読み取ります。 溶解コントロールサンプルの吸光度が高いが、それでもプレートリーダー（典型的には、2-3吸光度単位）の線形範囲内にあるために、データセットを分析します。
- 変換のために次の式を使用して、％細胞毒性として結果を表現します：
- 細菌付着の測定：
- 示された時点（ 例えば 、1時間後に感染症）で、細胞層からメディアを削除します。
- 徹底的に任意の非付着細胞を除去するために、滅菌、予め温めておいたPBS（1mlのPBSそれぞれの少なくとも3〜4回の洗浄）で細胞層を洗浄します。
- ウェルあたりPBS中のTriton X-100溶液vの/無菌の1％vの1ミリリットルを添加することにより溶解する宿主細胞。 5分間37℃でプレートをインキュベートします。
- 各サンプルを上下に数回、1.5 mlチューブを分離するために、各ウェルの内容を転送する前にピペット。サンプルの10倍連続希釈液を調製します無菌PBSに（例えば、サンプルの100ミリリットルのPBS 900ミリリットルを使用します）。
- プレートMLB寒天上で、各サンプルの100 mlの細胞スプレッダーを用いて広げました。細菌株および時点に応じて、プレートに希釈をする最適化します。注：記載された実験のセットアップについては、10 5または10 6倍希釈は、CFUの適切な数を与えます。
- 37°のCO / Nでプレートをインキュベートし、コロニー計数によって細菌を列挙。
Representative Results
V.腸炎付着MAM7は、ホスト表面受容体の認識に関与する7タンデム哺乳類細胞侵入（MCE）ドメインを含みます。我々は、精製されたフラグメントは、V.と競合するこれらの材料の能力を試験するために、すべての7タンデムMCEドメイン（MAM7）または最初MCEドメイン（MAM1）のいずれかを包含する、組換えに結合されたポリスチレンビーズを使用しました結合宿主細胞のための腸炎及び接着阻害剤としてのこれらの材料の結果として得られる効果。 HeLa細胞を感染させたV. in vitroでの感染から生じる腸炎株 POR1、および細胞傷害性は、4時間（ 図3）後に評価しました。 0.1％トリトンX-100（正の溶解制御）によるHela細胞の処理完全な細胞溶解をもたらし、非感染細胞は細胞毒性の非常に低いレベルを示した。 インビトロ POR1と未処理の細胞の感染は、細胞溶解の非常に高いレベルをもたらし、そしてこのMAM7 - コによって阻害されましたupledビーズではなくMAM1結合またはGST-結合された制御ビーズ（ 図3）。
腸炎ビブリオの図3.キャラは競合アッセイの間、上皮細胞における細胞毒性を誘導した。細胞をVで処理しました異なる競合する事業体の存在下で示されるように- 腸炎 （VP）は、（+）で示されていない、または全く細菌（）（COMP）。これらには、COMPのどちらかが含まれていません。 （ - ）、MAM7ビーズ（MAM7）、MAM1ビーズ（MAM1）またはGSTコントロールビーズ（GST）。対照として、細胞をトリトンX-100（トリトン、溶解制御）のいずれかで処理した、または感染していない（uninf）に放置しました。 4時間後のLDH放出はセクション3で説明したように測定し、そして上記のように、結果は、トリトン対照（100％）とブランク（0％）に対して正規化しました。結果は、三連の実験からの平均±SEMで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Vの列挙MAM7-、MAM1-、またはGSTコントロールビーズとインキュベートした未処理のHeLa細胞、または細胞のいずれかに接続されている腸炎は 、MAM7ビーズことを明らかにしたが、MAM1-またはGST-制御ビーズは、Vを負かすありません細胞表面受容体（ 図4）をホストに取り付けるための腸炎 。
競合実験中に細菌付着の図4キャラクタリゼーション。HeLa細胞を感染させたV. （ - ）非存在下における腸炎 POR2（VP +）、または競合実体の存在、以下のように（COMP。）：MAM7ビーズ（MAM7）、MAM1ビーズ（MAM1）またはGSTコントロールビーズ（GST）を。細菌付着のように、1時間後に測定しましたセクション3に記載した結果は、三連の実験からの平均±SEMで。手段（CFU / mlの中FLTR）が2.3010 6、1.5310 5、2.0510 6、2.1210 6です。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
フルオロフォア標識されたビーズに結合されたアドヘシンは、宿主細胞への細菌の付着を模倣した （図5）は、細胞イメージングのための強力なツールである物質の生成につながります。 MAM7結合青色蛍光ビーズを使用して、我々は、上皮細胞にMAM7媒介添付ファイルのプロセスを特徴とします。宿主細胞に対するMAM7の結合は、F-アクチン（ 図5B）のために染色するためにローダミン-ファロイジンを用いた共可視化したストレスファイバーのアクチン再構成および形成されました。
_upload / 53400 / 53400fig5.jpg "/>
ヒーラにMAM7結合ビーズの図5の調製およびフルオロフォアの使用は青色蛍光バイオミメティックビーズの（A）サスペンション （右チューブ、10倍株式）。画像化目的のためにバイオミメティックビーズを標識し、コントロール（左チューブ）をバッファリングする。（B）アタッチメントアクチン再構成及びストレスファイバー形成の細胞をもたらします。 （ローダミン - ファロイジンで染色した赤、）青色蛍光ビーズの添付ファイルと結果のアクチンストレスファイバーは、顕微鏡によって画像化しました。バー、10μmです。パネルBの画像はリムら 1から適応し、クリエイティブコモンズのライセンスの下で再現された。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
本明細書において、我々は、それぞれ、ポリスチレンビーズのアミン - またはカルボキシレート変性に結合チオール含有タンパク質に使用することができる2つのプロトコルを説明します。手順の容易さ、チオール、アミンカップリングであることが好ましいが、所望のビード仕様（直径、蛍光特性）に応じて、アミン官能化ビーズを使用することはできない場合があり、我々は、したがって、カルボン酸に変換するプロトコルが含まれています - アミン部分に研究者に足場の選択に最大限の柔軟性を提供します。タンパク質を含有する任意のシステインのためのチオール、アミンおよびチオールカルボキシル結合作業の両方が、方向性結合（すなわち、表面ディスプレイを模倣するそのN末端 あたりタンパク質の固定化）をGST融合物として生成されたシステイン残基なしでタンパク質を必要としますタンパク質、またはそれは部位特異的突然変異誘発によって導入された単一の末端システイン残基が含まれています。複数の反応性システインが含まれている場合タンパク質内で、このタンパク質の機能を妨げることがあり、ランダムな固定化につながります。多くの細菌の付着は自然にシステインが含まれていません。これは、天然の構造および機能は、変異体に保持されるように広範囲のアッセイを必要とするが、他のもののために、これらは、部位特異的突然変異誘発により除去することができます。 GST融合タンパク質を、ビーズに結合した精製GSTタグは、適切な陰性対照として使用することができます。これらは多くの場合、一緒に凝集または非特異的に細胞に付着する高い傾向を持っているように、対照として非結合ビーズを使用することは、避けるべきです。プロトコル1.2の単純化されたバージョンのみEDCを用いたが、ただし、この場合、結合は、タンパク質中の第一級アミンを介して行われるので、方向性結合を保証しない、カルボキシル官能性ポリマービーズに結合するタンパク質を使用することができます。
還元剤としてTCEPは、dithiothrなど、他の市販されており、一般的に使用される還元剤に置き換えてはいけませんeitol（DTT）または2-メルカプトエタノール（BME）、その中に含まれるチオールは、チオール - マレイミドカップリング工程でタンパク質の結合と競合するように。 PBSは、他のバッファに置き換えてもよいが、次の考慮事項に：バッファは第一級アミンを含めることはできません（そうトリス含有緩衝液は適していません）。非常に低い（<10mMの）塩濃度を含むバッファーの使用は、凝集をビーズにつながり、また避けるべきです。タンパク質の純度は、純粋なタンパク質を使用する必要があり、この手順の間に考慮すると、高品質のデータを達成するために重要な因子です。我々は、日常的に少なくともアフィニティー精製およびゲル濾過工程を含む多段階でタンパク質を精製し、場合によっては、イオン交換クロマトグラフィーは、第三の工程として行われます。 SDS-PAGEによって判断されるように、結果としてカップリングに使用されるタンパク質の純度は、通常90％以上です。
それは、目のと同様に、最初の反応混合物中の両方のタンパク質濃度を決定することをお勧めします反応終了後の電子上清。これは、見かけ上、ビーズ結合タンパク質の濃度、ひいてはカップリング密度を決定するのに役立ちます。両方の値の決意も、カップリング効率の計算を可能にします。所望の最終濃度とカップリング密度を達成するために、その後の反応における最初のタンパク質溶液を調製するときに考慮することができます。反応中の物質のいずれも使用される濃度での色素複合体形成を妨害しないようにブラッドフォード試薬は、カップリング反応の前および後のタンパク質濃度の決意に特に適しています。低いタンパク質濃度が使用される場合、この方法は、より高感度な検出法で交換する必要がある可能性があり、しかし、注意は、カップリング反応の中に含まれる物質と相溶性でなければならないという事実に支払わなければなりません。それはまた、注意して粉末状の試薬 を新たに調製した試薬を使用して処理するために推奨される（例えば、店密閉容器内と試薬の品質は、結合効率に影響を与えるため）に水分を描画する試薬を回避するために、シリカビーズを使用します。カップリング効率は、予想よりも低い場合には、可能な治療薬は、最初のビーズおよびタンパク質濃度の増加が挙げられます。より高い濃度が使用されている場合は、カップリング試薬の濃度が比例して増加するのに十分なモル過剰量を確保しなければなりません。ビーズ/タンパク質濃度を変更すると、通常、より良い最適化への第一歩ではなく、反応時間が増加しています。ビーズカップリングのためのプロトコルは長いですので、我々は一般的に材料の大規模なバッチを準備します。懸濁液のアリコートを液体窒素中でスナップ凍結し、数ヶ月間-20℃で保存することができます。解凍した溶液は、再凍結すべきではないし、4℃に保ち、1〜2日以内に使用する必要があります。しかし、これは、最初に小さなバッチでテストすべきであるとして使用されるタンパク質の性質および安定性に応じて変化します。
腸炎ビブリオとヘラ上皮細胞の感染を阻害するために、ビーズ結合MAMSの容量を測定するために実施または読み出しとして細胞毒性を減少させます。両方の場合において、製剤及び競合アッセイは、同じプロトコルに従います。 Vの読み出しに応じて、異なる株腸炎が使用されている ：POR1は細胞毒性を測定するために使用される細胞毒性菌株を、非細胞毒性株POR2が細菌付着を測定するために使用されている間、細胞死および細胞の剥離が付着した細菌を定量化するための手順を損なうからです。
当初、コンペtition実験は、宿主細胞が細菌を添加する前にビーズとプレインキュベートした最初の段階的なプロトコルとして設定しました。 V.について腸炎 、使用するビーズの仕様（MAM7に結合された2μmのビーズ）を、ビーズおよび細菌の両方が得られる細胞毒性の変化なしに同時に添加することができる。 すなわち、この実験では、ビーズは、結合、宿主細胞のための細菌を負かします。使用細菌種およびビード形状に応じて、二つの別々のステップとして、ビーズの付着や細菌感染を維持するための十分な理由があるかもしれません。例えば、非運動性細菌で細胞を感染させるために、プレートは、一般に、感染培地を加えた後、遠心分離します。これは、細胞膜上にビーズの非常に不均一な分布をもたらすので、ビーズ懸濁液を含むプレートを遠心分離は、避けるべきです。より小さい粒子サイズが使用されている場合、ビーズは、細胞表面上に沈降する時間がかかります。その場合においてSUfficient時間は、感染前にビーズ結合のために許可する必要があります。読み出しとして細菌付着が使用される場合、細胞剥離及び溶解が付着した細菌の定量化を損ない得るように、サンプルは、宿主細胞が著しく感染株によって損傷されていない時点で取られるべきです。
代わりに希釈プレーティングすることによって細菌の付着を列挙のサンプルは、代替的に（ 図5）画像化のために処理されてもよいです。この場合には、組織培養細胞を、ガラスカバースリップ上に播種し、直接ではなくウェルにすべきです。また、蛍光タンパク質を発現する蛍光ビーズおよび細菌感染、特定の宿主細胞マーカーと共に使用することができます。例えば、競合実験は、一般的に、宿主細胞のアクチン細胞骨格の染色、蛍光青色ビーズおよび蛍光と共に、感染に起因する形態学的変化を評価するために、蛍光赤ローダミン - ファロイジンを用いて画像化されます緑（GFPを発現またはSYTO18染色）細菌。
黄色ブドウ球菌 FnBPA、 ストレプトコッカス・ピオゲネス F1 FUDと腸炎ビブリオの MAMを含むビーズに結合アドヘシンの範囲は、接着、接着阻害および病原体媒介性細胞傷害1、図7、図8との密着性の寄与を研究するための生体模倣材料として使用されています。足場として使用されるポリマービーズは、色（例えば、青色蛍光赤、青、緑、オレンジ）の広い範囲で利用可能であるので、このアプローチを使用する利点の一つは、添付イベントの視覚化の容易さです。したがって、機能を妨げる可能性が直接タンパク質標識は、回避することができます。このように可溶性タンパク質と比較して、より生理学的に関連する立体構造を反映さらに、表面結合模倣細菌表面上の付着の多価ディスプレイを。
無傷の細菌やbacteriを用いた研究と比較するとらの変異体は、ビーズのアプローチは、細菌増殖に関連する問題を回避します。増殖培地および栄養枯渇の酸性化は、負の宿主細胞に影響を与え、細菌の複製は、最終的には妥協-例えば、無傷の細菌を用いて細胞をホストする細菌付着の長期（ 例えば、O / N）の研究は、多くの場合、細菌の増殖を伴う現象によって危険にさらされています結像品質。
より最近では、ビーズに結合したアドヘシンの使用は、細菌付着の下流のプロセスのシグナリングに関与する宿主細胞因子の親和性精製の ためのツールとしてのそれらの使用を含むように拡張されている。V.腸炎 MAM7は、宿主細胞膜におけるホスファチジン酸への結合を介して、RhoAの活性化およびアクチン再配列1,3をトリガする 。MAM結合ビーズを精製し、MAM-宿主細胞の結果として組み立てシグナリングプラットフォームに関与するタンパク質を同定するために使用されています結合。ビーズができるので、簡単に短い遠心分離工程によって上清から分離され、そして目的のタンパク質を共有結合的に結合され、これは、夾雑タンパク質からの分離を達成するための優れた方法であり、そのようなプロテオミクスまたはウェスタンなどの下流の用途に使用することができ、関連するタンパク質複合体を、豊かブロッティング。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
