Protocol
폴리머 비즈에 단백질의 1. 화학 결합
- 티올 - 방향성 아민 커플
주 :이 프로토콜은 단백질 Sulfosuccinimidyl 4- (p의 -maleimidophenyl) 부티레이트 가교제로서 (설포 SMPB) (도 1)를 사용하여, 중합체 비드 - 작용 아민 함유 시스테인 결합하기에 적합하다.
그림 1. 가교 중합체 비드에 단백질의 티올 방향성 아민 커플 링에 사용되는 전략. 아민 변성 폴리스티렌 비드 설포 SMPB으로 활성화된다. 말레이 미드 구슬에 결합 단백질을 방향성 무료로 시스테인과 반응. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.- 시약의 조제 :
- PBS (100 mM의 인산 나트륨, 150 mM의 NaCl을, pH를 7.0)와 오토 클레이브를 준비합니다. 사용 직전 100X TCEP의 스톡 (0.5 M PBS 또는 287 ㎎ / ㎖) (트리스 (2- 카르복시 에틸) 포스 핀)을 준비한다.
- 5 배 재고 설포 SMPB의 (DH 10 MM 또는 4.58 ㎎ / ㎖ 2 O)를 사용하기 직전를 준비합니다.
- 10 배 주식 (500 MM 또는 88 밀리그램 / PBS에서 ml의 pH를 7.0) 사용 직전에 시스테인을 준비합니다.
- 구슬 활성화 :
- 부드럽게 반전시킴으로써 비드 현탁액을 혼합하고 1 mL의 멸균 PBS, pH가 7.0를 함유하는 1.5 mL의 멸균 튜브에 비드 현탁액 (예, 12 ㎖)의 요구량을 전송.
- 조심스럽게 마이크로 원심 (16,000 XG에 2 분)에서 원심 분리하여 구슬과 펠렛을 씻어 아래로 피펫합니다.
- 조심스럽게 피펫 및 폐기에 뜨는을 제거합니다. 신선한 멸균 PBS 1 ㎖에 비드 펠렛을 재현 탁하고 세정 공정을 반복한다. PBS 0.8 ㎖에 비드 펠렛을 재현 탁.
- , 새로 제조 된 10 mM의 설포 SMPB 200 ㎖를 추가하여 최종 승낙을주고2 mm의 비율.
- 회전 바퀴에 25 ℃에서 1 시간 동안 비드 서스펜션을 품어.
- 단백질 감소 :
- 활성화 단계의 인큐베이션 기간이므로 즉시 활성화 비드에 첨가 할 수있는 다음 단계의 결합 단백질을 제조.
주 :이 환원 단계가 항상 GST (글루타티온 S 트랜스퍼) 융합 단백질을 위해 필요하지 않지만, 그것이 높은 커플 링 효율을 보장하기 위해 추천된다.- 단백질 농도를 검사하고, 커플 링 반응에 필요한 최종 농도로 조정. 주 : PBS 6mm의 단백질, 및 1 ml의 부피는 일반적으로 사용된다.
- 5 mM의 최종 농도를 수득 TCEP 스톡을 추가한다. RT에서 30 분 동안 용액을 배양한다.
주의 : 반응 혼합물을 직접적으로 다음의 커플 링 반응을 위해 사용될 수있다. - 프로를 결정하는 단백질 용액의 소량 (몇 ㎖) 유지 TEIN 농도 및 커플 링 효율의 계산 (섹션 2 참조).
- 활성화 단계의 인큐베이션 기간이므로 즉시 활성화 비드에 첨가 할 수있는 다음 단계의 결합 단백질을 제조.
- 단백질 결합 단계 :
- 원심 분리 (2 분의 microcentrifuge에 16,000 XG)에 의해 활성화 된 구슬 펠렛, 신선한 멸균 PBS 1 ㎖에 한 번 펠렛을 씻는다.
- 목적 단백질의 농도를 제공하기 위해 제조 된 단백질 용액 (예를 들어, 1 ml)에 펠렛을 재현 탁.
주 : 커플 링 단계 동안 단백질 농도는 평균 결합 효율 (커플 링 효율을 결정 섹션 2 참조) 및 (1.1.4.3에서 계산 된) 원하는 결합 밀도에 의존 할 것이다. 커플 링 단계 동안 단백질 농도가 약 6 mm 이상이어야한다 있으므로 효율은 약 85 %와 10 배 비드 현탁액의 원하는 최종 농도 5 mm이다. - 다음 식을 사용하여 결합 밀도를 산출 :
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ρ의 C 결합 밀도 [단백질 분자의 수 / 나노 2]
진한 단백질의 단백질 농도 [ml의 밀리그램 /]
단백질 M, 단백질 분자량 [다] W
비드 진한 비드 농도 [구슬의 수 / L],
D 비드 직경 [나노 2]
아보가드로 수 - 리간드 평균 간격을 계산하도록 결합 밀도를 사용
- 회전 바퀴에 25 ℃에서 2 시간 동안 단백질 비드 현탁액을 배양한다.
참고 : 일부단백질은 실온에서 안정되지 않을 수 있습니다. 이러한 경우, 반응은 4 ° CO / N에서 행할 수있다. - 50 mM의 최종 농도 시스테인 스톡을 첨가하여 비드에 남아있는 활성화 그룹을 비활성화하고 회전 바퀴에 25 ° C에서 30 분 동안 현탁액을 배양한다. 원심 분리 (2 분의 microcentrifuge에 16,000 XG)에서 구슬을 펠렛.
- 단백질 농도 및 커플 링 효율의 계산을 결정하는 상등액을 유지 (섹션 2 참조).
- 최종 생성물을 수득 신선한 PBS 1 ㎖에 1 ㎖의 PBS로 두 번 재현 탁하고 비드 펠렛을 세척 하였다.
주 : 상기 프로토콜은 일반적으로 다음의 실험 (섹션 3 참조)에 대한 10 배 스톡로서 사용될 수 5mM의 단백질의 최종 농도에서, 결합 된 단백질을 1 ㎖를 줄 것이다. - 프로토콜 부 (3)로 진행 비드 스톡 100 ㎖ / ㎖ 작업, 또는 500 nM의 단백질의 최종 농도. 참고 :이 procedur을위한 좋은 출발점을E는 2 내지 3 × 10-4 단백질 / 평균 결합 밀도 또는 제 2 mm 직경의 비드에 57 nm의 평균 간격 결과 2 × 10 12 비드 / ㎖가 될 것이다.
- 시약의 조제 :
- 티올 카르복시 방향 커플 링
참고 :이 프로토콜은 카르 복실 기능화 된 폴리스티렌 비즈에 단백질을 포함하는 시스테인 결합에 적합하다. 카르복시 잔기는 우선, 변성 아민 및 후 가교 설포 SMPB (도 2)를 이용하여 1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카르 보디이 미드 (EDC) / N 히드 록시 숙신이 미드 (NHS)를 사용하여 활성화된다.
도 2 가교 중합체 비드에 단백질의 방향성 티오 카복실 커플 링에 사용되는 전략. 카복실 폴리스티렌 비즈 제 EDC 활성화 및 세미 안정 NHS 에스테르를 형성하는 NHS로 변형된다. ethylenedi의 후속 아민 커플 링설포 SMPB 반응 유리 아민 기, 아민 결과. 말레이 미드 구슬 후. 구슬에 결합 단백질을 방향성 무료로 시스테인과 반응 할 수있는 활성 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.- 시약의 조제 :
- PBS (100 mM의 인산 나트륨, 150 mM의 NaCl을, pH를 7.0)와 오토 클레이브를 준비합니다.
- 사용 직전에 TCEP의 (PBS 0.5 M 또는 287 ㎎ / ㎖) 100 배 재고를 준비합니다.
- 배 스톡 사용 직전의 EDC (20 mM의 PBS, 4 ㎎ / ㎖) (1- 에틸 -3- (3- 디메틸 아미노 프로필) 카르 보디이 미드)를 준비한다.
- 10 배 재고 NHS의 (PBS에서 50 밀리미터, 또는 6 ㎎ / ㎖) (N- 히드 록시) 사용하기 직전를 준비합니다.
- 5 배 재고 설포 SMPB의 (DH 10 MM 또는 4.58 ㎎ / ㎖ 2 O)를 사용하기 직전를 준비합니다.
- 바로 B 시스테인의 10 배 주식 (500 MM 또는 88 밀리그램 / PBS에서 ml의 pH를 7.0)를 준비는 efore 사용.
- 구슬 활성화 :
- 부드럽게 반전시킴으로써 비드 현탁액을 혼합하고 1 mL의 멸균 PBS, pH가 7.0를 함유하는 1.5 mL의 멸균 튜브에 비드 현탁액 (예, 12 ㎖)의 요구량을 전송.
- 조심스럽게 마이크로 원심 (16,000 XG에 2 분)에서 원심 분리하여 구슬과 펠렛을 씻어 아래로 피펫합니다.
- 조심스럽게 피펫 및 폐기에 뜨는을 제거합니다.
- 신선한 멸균 PBS 1 ㎖에 비드 펠렛을 재현 탁하고 세정 공정을 반복한다.
- PBS 0.8 ㎖에 비드 펠렛을 재현 탁.
- 10 배 EDC 주식의 100 ㎖ (2 mM의 최종 농도)와 비드 서스펜션에 10 배 NHS 주식 솔루션 (5 mM의 최종 농도)의 즉시 100 ㎖를 추가합니다.
- 회전 바퀴에 25 ° C에서 30 분 동안 비드 현탁액을 배양한다.
- 0.8 ml의 신선한 멸균 PBS에 PBS 및 재현 탁의 1 ㎖에 한 번 구슬을 씻으십시오.
- 200 ml의 에틸렌을 추가하고, INC회전 바퀴에 25 ℃에서 1 시간 동안 비드 현탁액을 ubate.
- 한 ML PBS로 한 번 구슬을 세척하고 신선한 PBS 0.8 ㎖에 구슬을 재현 탁.
- 섹션 1.1.2.4 (설포 SMPB와 비드 활성화)로 섹션 1.1.2에서 설명에서 진행 및 섹션 1.1 (티올 아민 방향 커플 링)에 설명 된 프로토콜의 나머지 부분을 따릅니다. 1.1 절에 설명 된 것과 동일한 방식으로 제조 된 단백질과 단백질 결합 단계를 수행한다.
주 : (. 약 75 %)이 프로토콜을 이용하여 전형적인 결합 효율 따라서 동일한 결합 밀도를 달성하기 위해 적절히 초기 단백질 농도를 조절 섹션 1.1에 비해 약간 더 낮다.
- 시약의 조제 :
커플 링 효율 2. 결정
참고 : 다음과 같이 브래드 포드 시약 (10)과 비색 분석을, 단백질 농도를 측정 사용하려면 :
- 부드럽게 전자에 브래드 포드 시약을 반전 시약 nsure 균질성.
- 버퍼에서 0.1 내지 1.5 ㎎ / ㎖ 농도로 BSA를 덮는 단백질 표준을 제조, 10 ㎎ / ㎖ BSA 스톡 용액을 사용.
- 96 웰 플레이트의 우물에 브래드 포드 시약의 250 ML을 추가합니다. 모든 샘플, 단백질 표준과 음성 대조군 (전용 버퍼)에 대한 충분한 우물을 준비합니다.
- 96 웰 플레이트에 시약에 (부정적인 제어를위한 단백질 표준 또는 버퍼) 단백질 시료 5 mL를 추가합니다.
- 실온에서 10 분 동안 진탕 기에서 플레이트를 배양한다.
- 플레이트 리더를 사용하여 595 nm에서 흡광도를 측정한다.
- A595의 나노 대 BSA 농도의 표준 곡선을 생성하고 초기 및 상등액 시료에서 단백질 농도를 측정 할 수.
- 다음과 같이 결합 단백질의 농도를 구한다
- 커플 링 효율로 계산 :
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경쟁 분석에서 비드 결합 Adhesins의 3.
- 예비:
- 씨 24- 웰 플레이트에 150,000 세포 / ml의 농도로 경쟁 분석 하루 전에 HeLa 세포의 웰 당 1 ㎖를 세포에 앞서 실험을 시작하기 대략 80 % 컨 플루 언시에 도달 할 수 있도록한다.
- 세중의 각 실험 조건을 설정합니다. 음성 대조군을위한 우물 (경쟁 분석 중에 추가없이 박테리아), 양성 대조군과 (세포 독성 실험) 용해 컨트롤 (만 경쟁 분석 중에 추가 융합 태그에 연결된 제어 구슬)를 포함한다.
- V.의 새로운 식민지로 5 ml의 해양 LB (MLB) 문화를 접종 비브리오 떨고, 30 ℃에서 O / N 성장.
- 제 1 절 (커플 링)에 설명 된대로 충분한 비드 결합 MAM을 준비합니다. 10 배 구슬 주식의 100 ㎖에 대해 허용을 당 잘.
- 경쟁 분석 :
- competit의 날이온 실험, 세균 문화의 OD 600을 측정한다.
- 첨가제없이 무색 DMEM에 박테리아 문화를 희석하여 감염 매체를 준비, 10 % v / V를 구슬 현탁액 (중 어드 결합 구슬 또는 제어 구슬), (10)의 MOI 1 ml의 준비를 제공하기 위해 포함, 37 ° C까지 사전은 예열 / 잘 샘플 당 10 내지 20 %의 초과 볼륨. 참고 : 위에서 언급 한 조건 (24 웰 플레이트, V. 비브리오 균, 10 MOI), O / N 문화의 필요한 볼륨에 대한 문화의 3 / OD 600으로 계산됩니다 잘 (㎖ / ㎖) 당 추가합니다. 예를 들어, 감염 배지 1 ㎖ 일반적 세균 배양의 수 ml를 100 ml의 비드 현탁액을 포함하고, 무색, 비추 DMEM으로 1 ml의 구성 될.
- 우물에서 오래된 매체를 제거하고 각 웰에 37 ° C로 멸균 PBS의 미리 예열 1 ㎖를 첨가하여 배양 된 헬라 세포를 씻는다.
- PBS를 제거하고 잘 당 감염 배지 1 ㎖를 추가합니다. 또한 솔루션을 계속 추가하여, 컨트롤을 설정0.1 % 트리톤 X-100 (세포 독성 측정을 위해, 필요한 경우에만 제어 용해)을 함유 제어 구슬과 박테리아 (양성 대조군) 또는 어드 비드없이 박테리아 (음성 대조군), 또는 DMEM을 aining.
- 시간에 원하는 양 (예를 들면 세포 독성 측정을 위해 4 시간 또는 접착 측정 1 시간) 37 ℃에서 조직 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 플레이트.
주 : 숙주 세포에 박테리아 부착 및 세포 독성 모두 억제 효능에 대한 판독 아웃로서 사용될 수있다. 세포 독성 및 밀착성 측정 시점이 일치하는 경우에는 세포 독성이 배양 상청 및 첨부 분석법 나머지 셀 층 유래의 시료를 사용하여 결정되므로, 두 분석은, 동일한 웰에서 샘플을 사용하여 수행 될 수있다.
- 세포 독성 측정 :
- 지정된 시점 (예를 들어, 4 시간 게시물 감염)에서 각각 24 웰 및 전송에에서 세 번 200 ml의 제거96 웰 플레이트.
- 잘 신선한 96- 웰 플레이트에, 1500 XG에서 각각 5 분 및 전송 100ml로 96 웰 플레이트 스핀. 세중의 96 웰 플레이트의 신선한 우물에 감염 실험시 사용 된 미디어의 100 ㎖를 (이 공백으로 사용됩니다)를 추가합니다.
- 젖산 탈수소 효소 (LDH) 릴리스 분석 LDH의 세포 독성 검출 키트를 사용하고 제조업체의 지침을 다음을 수행하십시오.
- 간략하게, 25 단위로 필요한 시약의 양을 계산 (62 샘플을 측정 할 경우에는 예를 들면, 75 등을위한 충분한 반응물 믹스 메이크업).
- 예를 들어, 100 샘플, 시약 비 반전의 250 μL와 시약의 11.25 ml의 혼합, 거품을 피하기 위해 소용돌이를하지 않습니다.
- 멀티 채널 피펫을 피펫으로 할 수 있도록 저장조 내의 혼합물을 넣어. 각 샘플에 시약 믹스 100 μl를 추가합니다.
- 실온에서 판을 품어, 10, 20, 30 분에 플레이트 리더에 490 nm에서 흡광도를 참조하십시오. 용해 대조군 샘플의 흡광도가 높은 여전히 플레이트 판독기 (통상 2 ~ 3 흡광도 단위)의 선형 범위 내에있는 데이터 세트를 분석한다.
- 변환을 위해 다음 식을 사용하여 % 세포 독성 등의 결과를 표현 :
- 세균 부착의 측정 :
- 지정된 시점 (예를 들어, 1 시간 후 감염)에서, 세포 층에서 용지를 제거합니다.
- 철저하게 모든 취소 부착 세포를 제거하는 살균, 미리 예열 PBS (1 ml의 PBS 각각의 적어도 3-4 세척)과 세포 층을 씻는다.
- PBS에 트리톤 X-100 용액 V 멸균 1 % V 1 ㎖를 추가 / 웰 당를 Lyse 의해 숙주 세포. 5 분 동안 37 ℃에서 플레이트를 배양한다.
- 1.5 ㎖의 튜브를 분리하는 각 웰의 내용물을 이동시키기 전에, 각각의 샘플 위아래로 수회 피펫. 샘플의 10 배 연속 희석을 준비멸균 PBS로 (예를 들면, 샘플을 100 ml의 PBS 및 900 ml의 사용).
- 판 (100) MLB 한천 각 샘플 ml의 세포를 사용하여 확산 확산기. 균주와 시점에 따라 판에 희석하는 최적화 할 수 있습니다. 참고 : 설명 실험 장치를 들어, 105 또는 106 배 희석 CFUs의 적절한 수를 제공합니다.
- 37 ° CO / N에서 번호판을 품어과 식민지 계산에 의해 박테리아를 열거합니다.
Representative Results
V. 비브리오 균 어드 MAM7 호스트 표면 수용체의 인식에 관여하는 일곱 직렬 포유 동물 세포 항목 (MCE) 도메인이 포함되어 있습니다. 우리는 V.과 경쟁하기 위해 이러한 자료의 능력을 테스트하기 위해 일곱 직렬 MCE 도메인 (MAM7) 또는 첫 번째 MCE 도메인 (MAM1)를 포괄 폴리스티렌 재조합에 연결된 구슬, 정제 된 조각을 사용 결합을위한 숙주 세포 비브리오 접착 억제제로서 이들 물질의 생성 효율. HeLa 세포는 감염되었다 V. 생체 외 감염으로 인한 비브리오 균주 POR1 및 세포 독성은 4 시간 (그림 3) 후 평가 하였다. 0.1 % 트리톤 X-100 (양의 용해 제어)와 헬라 세포의 치료는 완전한 세포 용해 결과는 감염되지 않은 세포는 POR1와 미처리 세포의 시험 관내 감염 세포 용해 매우 높은 수준의 결과. 세포 독성이 매우 낮은 레벨을 표시하고,이 MAM7 공동으로 억제되었다구슬을 upled하지만 MAM1 결합하지 않거나 GST 결합 제어 비즈 (그림 3).
장염 비브리오 균의 그림 3. 특성화 경쟁 분석시 상피 세포에서 세포 독성을 유발. 세포가 V. 처리 하였다 비브리오 균 (Vp를), (+)로 표시, 또는 어떤 박테리아 (-) 다른 경쟁 기관 (. 완)의 존재가 표시되지있다. 이 중 하나를 더 빌려 포함되지 않습니다. (-), MAM7 비드 (MAM7) MAM1 비드 (MAM1) 또는 GST 제어 비드 (GST). 컨트롤로, 세포는 트리톤 X-100 (트리톤, 용해 제어)와 하나 처리, 또는 감염되지 않은 (uninf을) 남았다. 제 3 항에 기재된 바와 같이 4 시간 후 방출 LDH 측정하고, 결과는 트리톤 컨트롤 (100 %) 및 전술 한 바와 같이 블랭크 (0 %)로 정규화. 결과는 세중의 실험에서 평균 ± SEM이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
V.의 열거 MAM7-, MAM1-, 또는 GST 제어 구슬, 배양 치료 HeLa 세포, 또는 셀 하나에 부착 된 비브리오 균은 MAM7 - 비즈하지만 MAM1-하지 않거나 GST- 제어 비즈 V.을 outcompete 것으로 나타났다 첨부 비브리오는 세포 표면 수용체 (도 4)를 호스팅한다.
경쟁 실험을하는 동안 세균 첨부 그림 4. 특성화. 헬라 세포는 V.에 감염되었다 비브리오 균이 없을 POR2 VP (+), (-) 또는 개체 경쟁의 존재를 다음과 같이 MAM7 비즈 (MAM7)를 MAM1 비즈 (MAM1) 또는 GST 제어 구슬 (GST) (완.). 박테리아 부착은 다음과 같이, 1 시간 후에 측정 하였다 절에 설명 3. 결과는 세중의 실험에서 평균 ± SEM이다. 수단 (CFU / ㎖의 FLTR)는 2.3010 (6), 1.5310 (5), (6) 2.0510, 2.1210 (6)이다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
형광 표지 된 구슬에 결합 Adhesins는 숙주 세포에 세균 부착을 모방 및 세포 이미징 (그림 5)를위한 강력한 도구입니다 물질의 생성을 초래한다. MAM7 결합 청색 형광 비드를 사용하여, 우리는 상피 세포에 MAM7 매개의 부착 과정을 특징으로한다. 세포를 호스트 MAM7의 첨부 파일은 재 배열 및 공동 시각화 F - 굴지 (그림 5B)에 대한 얼룩 로다 민 - 팔로이 딘을 사용했다 스트레스 섬유의 형성을하는 걸 귀착되었다.
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헬라에 MAM7 결합 구슬의 그림 5. 준비 및 형광의 사용은 형광 블루 생체 모방 구슬 (A) 서스펜션 (오른쪽 튜브, 배 주). 이미징 목적으로 생체 모방 구슬을 표시 및 제어 (왼쪽 튜브)를 버퍼. (B) 첨부 액틴 재배 열과 응력 섬유화 세포 결과. (로다 민 - 팔로이 딘 염색 빨간색) 형광 파란색 구슬의 첨부 파일 및 결과 액틴 스트레스 섬유는 현미경으로 몇 군데 있었다. 바, 10 μm의. 패널 B의 이미지 임 등. 1에서 적응 및 크리에이티브 커먼즈 저작자 표시 라이센스로 재현되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서, 우리는 각각 아민에 결합 티올 - 함유 단백질으로 사용되거나 카복실 변성 폴리스티렌 비드 될 수있는 두 가지 프로토콜을 기술한다. 인해 절차의 용이성, 티올 - 아민 커플 링은 바람직하지만, 원하는 비드 규격 (직경, 형광 특성)에 따라, 아민 - 작용 비드의 사용이 가능하지 않을 수 있으며, 따라서 우리는 카르 복실 레이트로 변환하는 프로토콜을 포함했다 - 아민 부분에 연구원에게 발판의 선택에 최대한의 유연성을 제공합니다. 단백질, 방향성 결합을 함유하는 임의의 시스테인 모두 티올 - 아민 및 티오 카복실 결합 작업 (즉, 그 N 말단 당 단백질, 표면 디스플레이를 흉내 고정화)는 시스테인 잔기가없는 단백질을 필요로하지만, 그는 GST 융합으로 생성된다 단백질, 또는 사이트에 의해 도입 된 단일 터미널 시스테인 잔기는 돌연변이 유발 지시가 포함되어 있습니다. 여러 반응 시스테인이 포함되어있는 경우단백질 내에서,이 단백질의 기능을 방해 할 수 랜덤 고정으로 이어질 것입니다. 많은 세균 adhesins 자연스럽게 시스테인을 포함하지 않습니다. 이 기본 구조와 기능이 돌연변이에 유지되도록하기 위해 광범위한 분석을 요구하더라도 타인 들어, 이들은, 위치 지정 돌연변이 유발에 의해 제거 될 수있다. GST 융합 단백질의 경우, 비드에 결합 된 정제 된 GST-태그 적절한 음성 대조군으로서 사용될 수있다. 이들은 종종 서로 응집 또는 비특이적 세포에 접착 높은 경향을 가지고 대조군으로 비 결합 된 비드를 사용은 피해야한다. 만 EDC 사용하는 프로토콜 1.2. 단순화 된 버전은,이 경우 커플 링 방향 커플 링을 보장 할 수 없습니다, 따라서 단백질 급 아민을 통해 발생하고 그러나에, 카르 복실 기능화 고분자 비드에 결합 단백질로 사용할 수 있습니다.
환원제로서 TCEP 그러한 dithiothr 다른 시판 및 일반적으로 사용되는 환원제로 대체되지 않아야eitol (DTT) 또는 2- 머 캅토 에탄올 (BME), 그 안에 포함되는 티올은 티올 말레이 미드 커플 링 단계에서 단백질의 결합과 경쟁하는 바와 같이. PBS가 다른 버퍼로 대체 될 수 있지만, 다음과 같은 고려 사항 : 버퍼가 차 아민을 함유하지 않을 수 (그래서 트리스 - 함유 버퍼는 적합하지 않다). 매우 낮은 (<하는 10mM) 염 농도를 함유하는 완충제를 사용하면 비드 응집을 유도하고 또한 피해야한다. 단백질 순도도 중요한 요인이 절차 동안에 고려하고, 고품질의 데이터를 달성하는, 순수한 단백질을 사용하여야한다. 우리는 통상적으로 적어도 친화 정제와 겔 여과 단계를 더 포함하는 다단계로 단백질을 정제하지만, 이온 교환 크로마토 그래피 어떤 경우에는 제 3 단계로 이루어진다. SDS-PAGE에 의해 판단하여 그 결과 커플 링에 사용 된 단백질의 순도는 통상 90 % 이상이다.
그것의 일뿐만 아니라, 초기 반응 혼합물 중 두 단백질 농도를 결정하도록 권장반응이 완료된 후 전자 상등액. 이것은 명백한 비드 결합 단백질의 농도 및 이에 결합 밀도를 결정하는 것을 도울 것이다. 두 값의 결정은 또한 커플 링 효율의 계산을 허용한다. 원하는 최종 농도 및 결합 밀도를 달성하기 위해, 후속 반응에서 초기 단백질 용액을 제조 할 때 고려 될 수있다. 반응 물질 중에 사용 농도에서 염료 복합체 형성을 방해하지 않기 때문에 브래드 포드 (Bradford) 시약은 특히, 이전 및 커플 링 반응 후, 단백질 농도의 측정에 적합하다. 낮은 단백질 농도가 사용되는 경우,이 방법은 더 민감한 검출 방법으로 대체 할 필요가있다, 그러나주의는 커플 링 반응에 포함 된 물질과 호환되어야하는 사실에 지불한다. 그것은 또한 치료와 분말 시약을 새로 제조 된 시약을 사용하여 처리하는 것이 좋습니다 (예를 들어, 저장밀폐 용기 및 실리카 비드를 사용하여, 커플 링 효율에 영향을 미칠 것이다 시약의 품질 보낸 수분 드로잉 시약)을 방지한다. 커플 링 효율이 예상보다 낮은 경우, 가능한 치료는 초기 비드와 단백질 농도를 증가시키는 것을 포함한다. 높은 농도가 사용되는 경우, 결합제의 농도가 비례 적으로 증가 될 수있는 충분한 몰 과량을 보장한다. 비드 / 단백질 농도를 수정하는 것은 일반적으로 더 나은 최적화를 향해 단계보다는 반응 시간이 증가하고있다. 비드 커플 링에 대한 프로토콜이 긴이기 때문에, 우리는 일반적으로 재료의 큰 배치를 준비합니다. 현탁액의 분취 량을 액체 질소에서 스냅 동결 몇 달 동안 -20 ℃에서 저장 될 수있다. 해동 분취 액은 다시 냉동하지 않아야하고 4 ℃로 유지 1-2 일 이내에 사용해야합니다. 그러나, 이것은 처음에 작은 배치 테스트되어야로서 사용 된 단백질의 특성 및 안정성에 따라 다를 것이다.
장염 비브리오와 헬라 상피 세포의 감염을 억제하는 비드 결합 MAMS의 능력을 측정하기 위해 수행되거나 판독로서 세포 독성을 감소 . 두 경우에서, 제조 및 경쟁 분석은 동일한 프로토콜을 따른다. V.의 판독에 따라 다른 균주 비브리오가 사용되고 : POR1 세포 독성 측정을 위해 사용되는 세포 독성 균주, 비 독성 균주 POR2는 박테리아 부착을 측정하는데 사용되는 반면, 세포 사멸 및 세포 분리 결합 박테리아 정량화 과정을 절충하기 때문이다.
처음 COMPEtition 실험은 숙주 세포가 세균의 첨가에 앞서 비드 미리 인큐베이션했다 제 단계적 프로토콜로 설정 하였다. V. 들어 비브리오 및 사용 비드 사양 (MAM7 결합, 2㎛ 비드) 모두 비즈 박테리아 얻어진 세포 독성 변화없이 동시에 첨가 될 수있다. 즉, 본 실험 구성에서, 비드는 숙주 세포 결합에 대해 박테리아 outcompete. 사용 된 박테리아 종과 비드 형상에 따라, 별도의 두 단계로 비드 부착 및 세균 감염을 유지하기위한 좋은 이유가있을 수 있습니다. 예를 들어, 비 - 운동성 박테리아 세포를 감염시키기 위해, 플레이트는 일반적으로 감염 배지를 첨가 한 후 원심 분리 하였다. 이 전지 층에 구슬의 매우 불균일 한 분포를 초래하기 때문에, 비드를 함유하는 현탁액을 원심 분리 판은 피해야한다. 작은 입자 크기가 사용되는 경우, 비드는, 세포 표면에 정착하는 데 시간이 오래 걸릴 경우 스와fficient 시간은 감염 이전에 비드 부착 허용해야합니다. 박테리아 부착은 판독로서 사용하는 경우에는 숙주 세포에 감염이 크게 변형에 의해 손상되지 않는 경우, 시료는 박테리아의 부착을 정량화 할 수 손상 세포 용해 및 박리와 같은 시점에서 취해 져야한다.
대신 희석 도금에 의해 박테리아의 부착을 열거, 샘플은 대안 영상 (도 5)에 대해 처리 될 수있다. 이 경우, 조직 배양 세포는 오히려 직접 우물에 비해, 유리 커버 슬립 상에 파종한다. 또한, 형광 단백질을 발현하는 형광 비드와 박테리아 감염 특정 숙주 세포 마커와 함께 사용할 수있다. 예를 들어, 경쟁 실험은 흔히 숙주 세포의 액틴 세포 골격을 염색하고 형광 청색 형광 비드와 함께, 감염에 의한 형태 학적 변화를 평가하는 적색 형광 - 로다 민 팔로이 딘을 사용하여 묘화되고녹색 (GFP가 발현 또는 SYTO18 스테인드) 박테리아.
황색 포도상 구균 FnBPA 스트렙토 화농 F1 FUD 및 비브리오 파라 헤 몰리 티 커스의 MAM 포함한 비드 결합 adhesins의 범위는, 밀착성, 부착 억제와의 밀착성의 기여를 연구 생체 모방 재료로서 사용되어왔다 병원체 - 매개 세포 독성 (1), (7), (8). 지지체로서 사용되는 중합체 비드 색 (예를 들면, 청색 형광체, 적색, 청색, 녹색, 오렌지)의 넓은 범위에서 사용할 수 있기 때문에이 방법을 사용하는 장점 중 하나는, 부착 이벤트의 시각화의 용이성이다. 그러므로, 기능을 방해 할 수 직접 표지 단백질은 피할 수있다. 또한, 이렇게 용해 단백질에 비해 더 생리 학적으로 관련 형태를 반영, 커플 링 모방에게 박테리아 표면에 adhesins의 다가 디스플레이 표면.
그대로 세균이나 bacteri를 사용하여 연구에 비해알 돌연변이, 비드 접근 방법은 세균의 증식과 관련된 문제를 회피. 음으로 숙주 세포에 영향을주는 성장 배지와 영양 결핍 산성화하고, 박테리아 복제 결국 타협 - 예를 들어, 장기간 (예를 들면, O / N) 그대로 박테리아를 이용하여 숙주 세포 세균의 유착 연구는 종종 박테리아의 성장을 수반 현상에 의해 손상된 영상 품질.
최근 비드 결합 adhesins의 사용은 박테리아의 부착 하류 신호 전달 프로세스에 관련된 숙주 세포 인자의 친 화성 정제를위한 도구로서의 그의 용도를 포함하도록 확장되었다. V. 비브리오 MAM7는 숙주 세포막의 포스 폰산의 결합을 통해에서 RhoA 활성화 악틴 재구성 1,3- 트리거. MAM 결합 비즈 정화 MAM-숙주 세포의 결과로서 조립 된 시그널링 플랫폼에 관여하는 단백질을 식별하는 데 사용되는 제본. 구슬 수 있기 때문에쉽게 짧은 원심 분리 단계에 의해 상등액으로부터 분리하고, 관심의 단백질에 공유 결합되고, 이는 프로테오믹스 또는 웨스턴 같은 하류 애플리케이션에 사용될 수 관련된 단백질 복합체를 오염 단백질로부터의 분리를 달성하고 풍부하게 할 수있는 좋은 방법이다 블로 팅.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
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- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
