Protocol
1. Kemisk Koppling av proteiner till Polymerpärlor
- Tiol-amin riktningskoppling
Anmärkning: Detta protokoll är lämpligt för koppling av cysteininnehållande proteiner till amin-funktionaliserade polymerpärlor, med användning Sulfosuccinimidyl 4- (p -maleimidophenyl) butyrat (sulfo-SMPB) som tvärbindningsmedel (figur 1).
Figur 1. Tvärbindnings strategi som används för riktad tiol-amin koppling av proteiner till polymerpärlor. Amin modifierade polystyrenkulor aktiveras med Sulfo-SMPB. Maleimiden reagerar med fria cysteiner att riktnings par proteiner till pärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.- Framställning av reagens:
- Bered PBS (100 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0) och autoklav. Förbered en 100x lager (0,5 M eller 287 mg / ml i PBS) i TCEP (tris (2-karboxietyl) fosfin) omedelbart före användning.
- Förbered en 5x lager (10 mM eller 4,58 mg / ml i dH 2 O) av Sulfo-SMPB omedelbart före användning.
- Bered en 10x lager (500 mM eller 88 mg / ml i PBS, pH 7,0) av cystein omedelbart före användning.
- Pärla aktivering:
- Blanda pärlsuspensionen genom att försiktigt vända och överföra det begärda beloppet av pärlsuspension (t.ex. 12 ml) i en steril 1,5 ml rör innehållande 1 ml steril PBS, pH 7,0.
- Pipett försiktigt upp och ner för att tvätta pärlor och pellets genom centrifugering i en mikro (2 min vid 16000 xg).
- Försiktigt bort supernatanten med en pipett och kassering. Resuspendera pärlpelleten i 1 ml färsk steril PBS och upprepa tvättningssteget. Resuspendera pärlpelleten i 0,8 ml PBS.
- Tillsätt 200 ml nyberedd 10 mM Sulfo-SMPB, att ge en slutlig concentranson av 2 mM.
- Inkubera vulsten suspension 1 h vid 25 ° C på ett roterande hjul.
- Protein reduktion:
- Under inkubationstiden för aktiveringssteget, förbereda protein för följande kopplingssteget så att den kan omedelbart till de aktiverade pärlorna.
Obs: Även om denna reduktionssteg inte alltid krävs för GST (glutation S-transferas) fusionsproteiner, är det rekommenderat att säkerställa en hög kopplingseffektivitet.- Kontrollera proteinkoncentrationen, och justera den till den slutliga koncentration som krävs för kopplingsreaktionen. Obs: 6 mM protein i PBS och en volym av 1 ml används vanligtvis.
- Lägg TCEP lager för att ge en slutlig koncentration av 5 mM. Inkubera lösningen under 30 min vid RT.
Notera: reaktionsblandningen kan direkt användas för den följande kopplingsreaktionen. - Behålla en liten mängd (några ml) av proteinlösningen för bestämning av pro tein koncentration och beräkning av kopplingseffektiviteten (se avsnitt 2).
- Under inkubationstiden för aktiveringssteget, förbereda protein för följande kopplingssteget så att den kan omedelbart till de aktiverade pärlorna.
- Proteinkopplingssteget:
- Pellets de aktiverade pärlorna genom centrifugering (2 min, 16 tusen xg i en mikrocentrifug), och tvätta pelleten en gång i 1 ml färsk steril PBS.
- Återsuspendera pelleten i den framställda proteinlösningen (t.ex. 1 ml), till bildning av den önskade proteinkoncentrationen.
Obs: Proteinkoncentrationen under kopplingssteget kommer att bero på den genomsnittliga kopplingseffektiviteten (se avsnitt 2 för bestämning av kopplingseffektiviteten) och önskade kopplingsdensitet (enligt beräkningen i 1.1.4.3). Verkningsgraden är ca 85% och den önskade slutkoncentrationen 5 mM i 10x kulsuspensionen, så proteinkoncentration under kopplingssteget bör vara ungefär 6 mM. - Beräkna kopplingstätheten med hjälp av följande formel:
jpg "/> där
ρ c kopplingstäthet [antal proteinmolekyler / nm 2],
protein konc proteinkoncentration [mg / ml]
protein Mw protein molekylvikt [Da]
pärla konc pärla koncentration [antal pärlor / L]
d pärldiameter [nm 2]
Avogadros tal - Använd kopplings densitet för att beräkna den genomsnittliga liganden Avstånd:
- Inkubera protein kulsuspensionen för 2 timmar vid 25 ° C på ett roterande hjul.
Obs! Vissaproteiner kanske inte är stabil vid RT. I dessa fall kan reaktionen utföras vid 4 ° CO / N. - Deaktivera återstående aktiverade grupper på kulorna genom tillsättning av cystein lager till en slutlig koncentration av 50 mM och inkubera suspensionen under 30 min vid 25 ° C på ett roterande hjul. Pelle pärlorna genom centrifugering (2 min, 16 tusen xg i en mikrocentrifug).
- Håll supernatanten för bestämning av proteinkoncentrationen och beräkning av kopplingseffektiviteten (se avsnitt 2).
- Tvätta pärlpelleten två gånger med 1 ml PBS och återsuspendera i 1 ml färsk PBS för att ge den slutliga produkten.
Obs: Det ovanstående protokollet kommer typiskt att ge en ml kopplat protein, vid en slutkoncentration av 5 mM protein, vilket kan användas som en 10x lager för efterföljande experiment (se avsnitt 3). - För att gå vidare till avsnitt 3 i protokollet, arbeta med 100 ml / ml pärla lager, eller vid en slutlig koncentration av 500 nM protein. Obs: En bra utgångspunkt för denna procedure kommer att bli 2 x 10 12 pärlor / ml, vilket resulterade i en genomsnittlig kopplingsdensitet av 3 x 10 -4 proteiner / nm 2 eller en genomsnittlig mellanrum av 57 nm på en sträng av 2 mm i diameter.
- Framställning av reagens:
- Tiol-karboxi riktningskoppling
Obs: Detta protokoll är lämplig för koppling cysteininnehållande proteiner till karboxyl-funktion polystyrenpärlor. Karboxylgruppen först aktiveras genom att använda en-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid (EDC) / N-hydroxisuccinimid (NHS), amin modifieras och sedan tvärbindas med användning av sulfo-SMPB (Figur 2).
Figur 2. Tvärbindnings strategi som används för riktad tiol-kar koppling av proteiner till polymerpärlor. Karboxylerade polystyrenpärlor först aktiveras med EDC och modifierad med NHS att bilda en halvstabila NHS-ester. Efterföljande amin koppling av ethylenediaminresulterar i en fri amingrupp, som reagerar med Sulfo-SMPB. Maleimide aktiverade pärlor kan sedan reagera med fria cysteiner att riktnings par proteiner till pärlor. Klicka här för att se en större version av denna siffra.- Framställning av reagens:
- Bered PBS (100 mM natriumfosfat, 150 mM NaCl, pH 7,0) och autoklav.
- Förbered en 100x lager (0,5 M eller 287 mg / ml i PBS,) av TCEP omedelbart före användning.
- Bered en 10x lager (20 mM, eller 4 mg / ml i PBS) EDC (1-etyl-3- (3-dimetylaminopropyl) karbodiimid) omedelbart före användning.
- Bered en 10x lager (50 mM, eller 6 mg / ml i PBS) NHS (N-hydroxisuccinimid) omedelbart före användning.
- Förbered en 5x lager (10 mM eller 4,58 mg / ml i dH 2 O) av Sulfo-SMPB omedelbart före användning.
- Bered en 10x lager (500 mM eller 88 mg / ml i PBS, pH 7,0) av cystein omedelbart böre användning.
- Pärla aktivering:
- Blanda pärlsuspension genom att försiktigt vända och överföra det begärda beloppet av pärlsuspension (t.ex. 12 ml) i en steril 1,5 ml rör innehållande 1 ml steril PBS, pH 7,0.
- Pipett försiktigt upp och ner för att tvätta pärlor och pellets genom centrifugering i en mikro (2 min vid 16000 xg).
- Försiktigt bort supernatanten med en pipett och kassering.
- Resuspendera pärlpelleten i 1 ml färsk steril PBS och upprepa tvättningssteget.
- Resuspendera pärlpelleten i 0,8 ml PBS.
- Tillsätt 100 ml av 10x EDC lager (2 mM slutlig koncentration) och omedelbart 100 ml 10x NHS-stamlösning (5 mM slutlig koncentration) till pärlsuspensionen.
- Inkubera kulsuspensionen för 30 min vid 25 ° C på ett roterande hjul.
- Tvätta pärlorna en gång i 1 ml PBS och återsuspendera i 0,8 ml färsk steril PBS.
- Tillsätt 200 ml etylendiamin och incUbate vulsten suspension 1 h vid 25 ° C på ett roterande hjul.
- Tvätta pärlorna en gång med 1 ml PBS och återsuspendera pärlorna i 0,8 ml färsk PBS.
- Utgå från avsnitt 1.1.2.4 (pärla aktivering med Sulfo-SMPB) som beskrivs i avsnitt 1.1.2 och följ resten av protokollet som beskrivs i avsnitt 1.1 (Tiol-amin riktad koppling). Utför proteinberedning och proteinkopplingsstegen på ett sätt som är identiska med dem som beskrivs i avsnitt 1.1.
Obs: Den typiska kopplingseffektivitet med användning av detta protokoll är något lägre jämfört med avsnitt 1,1, därför justera den inledande proteinkoncentrationen i enlighet med detta för att uppnå samma kopplingsdensitet (ca 75%.).
- Framställning av reagens:
2. Bestämning av kopplingseffektiviteten
Obs: För att bestämma proteinkoncentration, använd Bradford reagens 10 och kolorimetriska analyser enligt följande:
- Vänd försiktigt Bradford reagens till e Nsure homogenitet av reagenset.
- Med användning av en 10 mg / ml BSA utgångslösning bereds proteinstandarder som täcker koncentrationer från 0,1 till 1,5 mg / ml BSA i buffert.
- Tillsätt 250 ml av Bradford-reagens till brunnar i en 96-brunnsplatta. Förbered tillräckligt brunnar för alla prover, proteinstandarder och negativa kontroller (endast buffert).
- Tillsätt 5 ml proteinprov (proteinstandarder eller buffert, till den negativa kontrollen) till reagenset i 96-brunnar.
- Inkubera plattan på en orbital skakanordning vid rumstemperatur under 10 minuter.
- Mät absorbansen vid 595 nm med användning av en plattläsare.
- Generera en standardkurva av BSA koncentration kontra A595 nm och använda detta för att avgöra proteinkoncentrationer i grund- och supernatant prover.
- Beräkna koncentrationen av kopplat protein enligt följande:
- Beräkna kopplingseffektiviteten som:
00eq4.jpg "/>
3. Användning av Bead-kopplade adhesiner i konkurrensanalyser
- Förberedelse:
- Seed 1 ml per brunn av Hela-celler vid en koncentration av 150.000 celler / ml i en 24-brunnsplatta dagen innan kompetitiv analys, för att tillåta cellerna att nå ca 80% konfluens före start av experimentet.
- Ställa in varje experimentell betingelse i triplikat. Inkludera brunnar för negativa kontroller (inga bakterier tillkommit under konkurrensanalyser), positiva kontroller (kontroll pärlor kopplade till fusion-tagg endast läggas under konkurrensanalyser) och lys kontroller (för cytotoxiska experiment).
- Inokulera 5 ml marin LB (MLB) kultur med en ny koloni av V. parahaemolyticus och växa O / N vid 30 ° C, skakning.
- Förbered tillräckligt pärla kopplade MAM, som beskrivs i avsnitt 1. (koppling). Låt för 100 ml 10x pärla lager per brunn.
- Konkurrensanalys:
- På dagen för den competition experiment, mäta OD 600 av bakteriekulturen.
- Förbered infektion medier genom att späda bakteriekulturer till färglös DMEM utan tillsatser, värmts upp till 37 ° C, innehållande 10% volym / volym pärlsuspension (antingen adhesin-kopplade pärlor eller kontrollpärlor), för att ge en MOI på 10. Bered 1 ml / brunn och 10 till 20% överskottsvolym per prov. Anmärkning: För de ovan nämnda villkoren (24-brunnar, V. parahaemolyticus, MOI 10), den nödvändiga volymen av O / N-kulturen som skall tillsättas per brunn (ml / ml) beräknas som 3 / OD 600 av kulturen. Till exempel kommer en ml av infektionsmediet typiskt innehålla 100 ml pärlsuspension, några ml bakteriekultur och göras upp till 1 ml med färglös, okompletterat DMEM.
- Avlägsna gammalt medium från brunnarna och tvätta odlade Hela-celler genom att tillsätta 1 ml steril PBS förvärmda till 37 ° C till varje brunn.
- Ta bort PBS och tillsätt 1 ml infektionsmedium per brunn. Också inrätta kontroller, genom att lägga till lösningar fortsaining kontrollkulor och bakterier (positiv kontroll) eller adhesin pärlor och inga bakterier (negativa kontroller), eller DMEM innehållande 0,1% Triton X-100 (lyseringskontroll, endast nödvändigt för cytotoxicitet mätningar).
- Inkubera plattan i en vävnadsodlingsinkubator vid 37 ° C under den önskade mängden tid (t.ex. 4 timmar med avseende på cytotoxicitet mätningar eller en timme för mätningar vidhäftnings).
Obs: Både bakteriell vidhäftning och cytotoxicitet på värdceller kan användas som lästa-outs för effekten av inhibering. Om tidpunkterna för cytotoxicitet och vidhäftningsmätningar sammanfaller, kan båda analyserna utföras med prover från samma brunn, eftersom cytotoxicitet bestäms med hjälp odlingssupematanten och fäst analyser använder prover från den kvarvarande cellskiktet.
- Cytotoxicitet mätningar:
- Vid angivna tidpunkter (t.ex. 4 h efter infektion), ta bort tre gånger 200 ml från varje 24-brunn och överföring tillen 96-brunnsplatta.
- Spin 96-brunnsplattor vid 1500 x g, 5 min och överföra 100 ml från varje brunn i en ny 96-brunnsplatta. Tillsätt 100 ml av media som används vid infektionsexperiment till nya brunnar i 96-brunnar i tre exemplar (dessa kommer att användas som ämnen).
- Utför laktatdehydrogenas (LDH) frisättningsanalys med användning av en LDH-cytotoxicitet detektionskit och enligt tillverkarens instruktioner.
- I korthet, beräkna reagens som behövs i steg om 25 (t.ex. om 62 prover ska mätas, göra upp tillräckligt reagens mix för 75 mm).
- Till exempel för 100 prov, blanda 11,25 ml reagens A med 250 pl reagens B. Invertera, inte virvel för att undvika skumbildning.
- Placera blandningen i en behållare för att kunna pipettera med en multikanalpipett. Tillsätt 100 ni reagensblandning till varje prov.
- Inkubera plattan vid RT och läs av absorbansen vid 490 nm på en plattläsare vid 10, 20, 30 min. Analysera datauppsättningen för vilken absorbansen hos prov lys kontrollen är hög men fortfarande inom det linjära området för plattläsare (typiskt, 2-3 absorbansenheter).
- Uttryck resultaten som% cytotoxicitet med hjälp av följande formel för konvertering:
- Mätning av bakteriell adhesion:
- Vid angivna tidpunkter (t.ex., en timme efter infektion), avlägsna media från cellskiktet.
- Tvätta cellagret med sterilt, förvärms PBS (minst 3-4 tvättar med 1 ml PBS vardera) för att avlägsna eventuella un lösa celler.
- Lyse värdceller genom tillsats av 1 ml av en steril 1% volym / volym Triton X-100-lösning i PBS per brunn. Inkubera plattan vid 37 ° C under 5 minuter.
- Pipettera varje prov upp och ned flera gånger innan överföring av innehållet i varje brunn för att separera 1,5 ml rör. Preparera 10-faldiga seriespädningar av proveri steril PBS (t.ex. använda 100 ml prov och 900 ml PBS).
- Plate 100 ml av varje prov på MLB agar och sprida användning av en cellspridare. Optimera vilken utspädning för att plattan beroende på bakteriestammar och tidpunkt. Obs! För den beskrivna experimentuppställning, 10 5 eller 10 6 faldiga utspädningar ger ett lämpligt antal CFU.
- Inkubera plattorna vid 37 ° CO / N och räkna bakterier genom koloniräkning.
Representative Results
Den V. parahaemolyticus adhesin MAM7 innehåller sju tandem däggdjurscellinträde (MCE) domäner som är involverade i ett erkännande av värd ytreceptorer. Vi använde polystyrenkulor kopplade till rekombinant, renade fragmenten omfattar antingen alla sju tandem MCE domäner (MAM7) eller bara den första MCE domänen (MAM1) för att testa förmågan hos dessa material att konkurrera med V. parahaemolyticus värdcellbindning och den resulterande effekten av dessa material som vidhäftnings hämmare. Hela-celler infekterades med V. parahaemolyticus stam POR1, och cytotoxicitet till följd av in vitro-infektion utvärderades efter 4 h (fig 3). Behandling av Hela-celler med 0,1% Triton X-100 (positiv lys kontroll) resulterade i fullständig cell-lys, oinfekterade celler uppvisade mycket låga nivåer av cytotoxicitet. In vitro-infektion av obehandlade celler med POR1 resulterade i mycket höga nivåer av cellys, och detta inhiberades av MAM7-samupled pärlor men inte MAM1 kopplade eller GST kopplade kontroll pärlor (Figur 3).
Figur 3. Karakterisering av Vibrio parahaemolyticus inducerad cytotoxicitet i epitelceller under kompetitiva analyser. Celler behandlades med V. parahaemolyticus (Vp), anges med (+) eller inga bakterier (-) i närvaro av olika konkurrerande enheter (. comp) som anges. Dessa inkluderade antingen ingen comp. (-), MAM7 pärlor (MAM7), MAM1 pärlor (MAM1) eller GST kontrollpärlor (GST). Som kontroller behandlades celler antingen med Triton X-100 (triton, lys kontroll), eller lämnas oinfekterade (uninf). LDH-frisättning efter 4 timmar mättes som beskrivs i avsnitt 3, och resultaten normaliserades till Triton kontroller (100%) och ämnen (0%) som beskrivits ovan. Resultaten är medelvärden ± SEM från trippelexperimenten. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Räkning av V. parahaemolyticus fäst antingen obehandlade HeLa-celler eller celler inkuberade med MAM7-, MAM1- eller GST kontrollkulor, avslöjade att MAM7-pärlor men inte MAM1- eller GST kontrollpärlor konkurrerar V. parahaemolyticus för fastsättning till värd cellytreceptorer (Figur 4).
Figur 4. Karakterisering av bakteriell vidhäftning under kompetitionsexperiment. Hela-celler infekterades med V. parahaemolyticus POR2 (Vp ^), i frånvaro (-) eller närvaro av konkurrerande enheter enligt följande: MAM7 pärlor (MAM7), MAM1 pärlor (MAM1) eller GST kontrollpärlor (GST) (för.). Bakteriell vidhäftning mättes efter 1 timme, såsom beskrivs i avsnitt 3. Resultaten är medelvärden ± sem från trippelexperimenten. Medel (FLTR i CFU / ml) är 2,3010 6, 1,5310 5, 2,0510 6, 2,1210 6. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Adhesiner kopplade till fluoroformärkt pärlorna resulterar i generering av material som efterliknar bakteriell vidhäftning till värdceller och är kraftfulla verktyg för cellulär avbildning (fig 5). Använda MAM7-kopplade fluorescerande blå pärlor, vi kännetecknas förfarandet enligt MAM7-medierad bindning till epitelceller. Vidhäftning av MAM7 till värdceller resulterade i aktin omlagringar och bildning av stressfibrer, som var sam-visualiseras med rodamin-falloidin för att färga för F-aktin (fig 5B).
_upload / 53400 / 53400fig5.jpg "/>
Figur 5. Upprättande och användning av fluoroformärkt biomimetiska pärlor för avbildningsändamål. (A) Upphävande av fluorescerande blå biomimetiska kulor (höger tub, 10x lager) och buffertkontroll (vänster rör). (B) Montering av MAM7-kopplade pärlor till Hela celler resulterar i aktin omarrangemang och stress fiberbildningen. Fäst av fluorescerande blå pärlor och resulterande aktin spänningsfibrer (röd, färgade med rodamin-falloidin) avbildades av mikroskopi. Bar, 10 ^ m. Bilder i panel B anpassades från et al. Lim 1 och återges under Creative Commons Attribution-licens. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Häri beskriver vi två protokoll, som kan användas för att koppla tiolinnehållande proteiner till amin- eller karboxylat-modifierade polystyrenkulor, respektive. På grund av att underlätta förfarandet, är tiol-aminkoppling föredra, men beroende på önskad pärla specifikation (diameter, fluorescensegenskaper) kan användning av aminfunktionaliserade pärlorna inte vara möjligt och vi har därför inkluderat ett protokoll som kommer att konvertera karboxylat - i en amingrupp för att ge forskaren största möjliga flexibilitet i valet av byggnadsställning. Även om både tiol-amin och tiol-karboxyl kopplings verk för alla cystein innehållande protein, riktningskoppling (dvs immobilisering av proteinet per dess N-terminal, imitera ytpresentation) kräver ett protein utan cysteinrester, är den som produceras som ett GST-fusions protein eller som innehåller en enda terminal cysteinrest infördes genom riktad mutagenes. Om flera reaktiva cysteiner ingårinom proteinet, kommer detta att leda till slumpmässiga immobilisering som kan hindra proteiners funktion. Många bakteriella adhesiner inte innehåller cysteiner naturligt. För andra kan dessa avlägsnas genom ställesriktad mutagenes, även om detta skulle kräva omfattande analyser för att säkerställa nativ struktur och funktion bibehålls i mutanten. För GST-fusionsproteiner, kan renade GST-taggen kopplad till pärlor användas som en lämplig negativ kontroll. Använda okopplade pärlor som en kontroll bör undvikas, eftersom dessa har ofta en större tendens att klumpa ihop sig eller vidhäfta till celler ospecifikt. En förenklad version av protokollet 1,2., Med användning av endast EDC, kan användas för att koppla proteiner till karboxyl-funktionaliserad polymerpärlor, men i detta fall koppling sker via primära aminer i proteinet och därför garanterar inte riktningskoppling.
TCEP som reduktionsmedel får inte ersättas med andra kommersiellt tillgängliga och vanligen använda reduktionsmedel, såsom dithiothreitol (DTT) eller 2-merkaptoetanol (BME), eftersom tioler som finns i dem kommer att konkurrera med proteinkoppling i tiol-maleimid kopplingssteg. PBS kan ersättas med andra buffertar, men med följande överväganden: Buffertar får inte innehålla primära aminer (så Tris-innehållande buffertar är inte lämpliga). Användning av buffertar som innehåller mycket låga (<10 mM) saltkoncentrationer leder till pärla klumpar och bör också undvikas. Protein renhet är också en viktig faktor att beakta under detta förfarande, och för att uppnå högkvalitativa data, bör rena proteiner användas. Vi rena rutinmässigt proteiner i flera steg, innefattande åtminstone en affinitetsrening och gelfiltreringssteg, men i vissa fall Jonbyteskromatografi sker som ett tredje steg. Som ett resultat renheten av proteiner som används för koppling är vanligen 90% eller högre, såsom bedömdes genom SDS-PAGE.
Det rekommenderas att bestämma proteinkoncentrationer både i den ursprungliga reaktionsblandningen liksom the supernatanten efter reaktionens fullbordan. Detta kommer att hjälpa till att avgöra den skenbara koncentrationen av pärla-kopplat protein, och därmed kopplingstäthet. Bestämning av båda värdena kommer också att möjliggöra beräkning av kopplingseffektiviteten. Detta kan tas i beaktande vid utarbetandet av den initiala proteinlösningen i efterföljande reaktioner, för att uppnå den önskade slutkoncentrationen och kopplingsdensitet. Bradford reagens är speciellt lämpad för bestämning av proteinkoncentration före och efter kopplingsreaktionen, eftersom inget av de ämnen i reaktionen stör färgämnet komplexbildning vid de koncentrationer som används. Om lägre proteinkoncentrationer som skall användas, kan denna metod måste ersättas med en mer känslig detektionsmetod, uppmärksamhet måste dock tas till det faktum att det måste vara kompatibla med de ämnen som finns i kopplingsreaktionen. Det rekommenderas också att använda nylagade reagenser och hantera pulver reagens med omsorg (t.ex. lagrai en sluten behållare och använda kiseldioxidpärlor, för att undvika reagensen ritning fukt) Eftersom kvaliteten på reagensen kommer att påverka kopplingseffektiviteten. Om kopplingseffektiviteten är lägre än väntat, bland annat eventuella åtgärder ökar de initiala pärla och proteinkoncentrationer. Om högre koncentrationer används, har koncentrationen av kopplingsreagens ökas proportionellt för att säkerställa tillräcklig molärt överskott. Ändra pärla / proteinkoncentrationer är oftast ett bättre steg mot optimering snarare än att öka reaktionstider. Eftersom protokollen för pärla koppling är lång, vi förbereda vanligtvis en stor sats av material. Alikvoter av suspensionen kan snabbfrystes i flytande kväve och lagrades vid -20 ° C under flera månader. Tinade portioner bör inte frysas och bör hållas vid 4 ° C och användas inom 1-2 dagar. Detta kommer dock att variera med naturen och stabiliteten hos proteinet som ska testas på en liten sats från början.
Vibrio parahaemolyticus, med användning av antingen en minskning i bakteriell vidhäftning till värdceller eller reducerad cytotoxicitet som en utläsning . I båda fallen, förberedelse och konkurrensanalyser följa samma protokoll. Beroende på avläsning, olika stammar av V. parahaemolyticus används: den cytotoxiska stammen POR1 används för cytotoxicitet mätningar, medan den icke-cytotoxiska stam POR2 används för mätning bakteriell vidhäftning, eftersom celldöd och cell lossnar äventyrar det förfarande för kvantifiering av bundna bakterier.
Initialt konkurrens experiment sattes upp som en stegvis protokoll, där värdceller var första förinkuberades med pärlor före tillsats av bakterier. För V. parahaemolyticus och pärla specifikationer som används (2 pm pärlor kopplade till MAM7), kan både pärlor och bakterier tillsättas samtidigt utan ändringar i den resulterande cytotoxicitet. Dvs, i denna experimentuppställning, pärlor konkurrerar bakterier värdcellbindning. Beroende på bakteriearter och pärla geometri som används, kan det finnas goda skäl för att upprätthålla pärla vidhäftning och bakterieinfektion som två separata steg. Till exempel, för att infektera celler med icke-rörliga bakterier, plattorna vanligen centrifug efter tillsats av infektionen media. Emellertid bör centrifugering av plattor innehållande pärlor suspensioner undvikas, eftersom detta leder till en mycket ojämn fördelning av pärlorna på cellskiktet. Om mindre partikelstorlekar används, kommer kulorna att ta längre tid att sätta sig på cellytan, i vilket fall SUfficient tid bör tillåtas för pärla fastsättning före infektionen. När bakteriell vidhäftning används som läste upp, bör prover tas vid tidpunkter där värdceller inte signifikant skadas av den infekterande stammen, som cell lossnar och lys kan äventyra kvantifiering av bifogade bakterier.
I stället för att räkna bakteriell vidhäftning av utspädningsplatt, kan proverna alternativt behandlas för avbildning (Figur 5). I detta fall bör vävnadsodlingsceller sås på täckglas, snarare än direkt i brunnar. Dessutom kan fluorescerande pärlor och bakterier som uttrycker ett fluorescerande proteinet användas tillsammans med infektionsspecifika värdcellmarkörer. Till exempel är konkurrensexperiment vanligen avbildas med fluorescerande röd rodamin-falloidin att färga värdcellerna "aktincytoskelettet och utvärdera morfologiska förändringar till följd av infektion, tillsammans med fluorescerande blå pärlor och fluorescerandegrön (GFP-uttryckande eller SYTO18 färgad) bakterier.
En rad bead kopplade adhesiner, inklusive Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes F1 FUD och Vibrio parahaemolyticus MAM, har använts som biomimetiska material för att studera adhesion, vidhäftning hämning och bidraget från vidhäftning till patogen-medierad cytotoxicitet 1, 7, 8. En av fördelarna med att använda detta tillvägagångssätt är den enkla visualisering av fäst händelser, eftersom polymerpärlorna som används som byggnadsställningar är tillgängliga i en mängd olika färger (t.ex. blå, fluorescerande röd, blå, grön, orange). Sålunda direkt proteinmärkning, som kan störa funktionen, kan undvikas. Dessutom ytan kopplings härmar värda visning av adhesiner på bakterieytan, vilket återspeglar en mer fysiologiskt relevant konforma jämfört med lösliga proteiner.
Jämfört med studier med intakta bakterier eller bacterial-mutanter, kringgår pärlan strategi problem som är förknippade med bakterietillväxt. Till exempel, på längre sikt (t.ex. O / N) studier av bakteriell vidhäftning till värdceller med hjälp av intakta bakterier ofta äventyras av fenomen som åtföljer bakterietillväxt - försurning av tillväxtmediet och näringsämnen utarmning påverkar värdceller negativt, och bakteriell replikering äventyrar slutligen bildkvalitet.
På senare tid har användningen av pärla kopplade adhesiner utvidgats till att omfatta deras användning som verktyg för affinitets reningar av värd cellulära faktorer som signalprocesser nedströms bakteriell vidhäftning. V. parahaemolyticus MAM7, via bindning till fosfatidinsyror i värdcellmembranet, utlöser RhoA aktivering och aktin omlagringar 1, 3. MAM kopplade pärlorna används för att rena och identifiera proteiner som är involverade i signaleringsplattformar hopsatta som en konsekvens av MAM-värdcell bindande. Eftersom pärlor kanlätt separeras från supernatanten genom en kort centrifugeringssteg, och proteinet av intresse kovalent, är detta en bra metod för att uppnå separation från förorenande proteiner och berika relevanta proteinkomplex, som kan användas för tillämpningar efter såsom proteomik eller västra Blotting.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
