Protocol
Polimer Beads Proteinlerin 1. Kimyasal Birleştirme
- Tiol-amin yönlü birleştirme
Not: Bu protokol, proteinler Sülfosukinimidil 4- (p -maleimidophenyl) bütirat, çapraz bağlama maddesi olarak (Sülfo-SMPB) (Şekil 1) kullanılarak, polimer boncukları işlevselleştirilmiş amin içeren sistein bağlanması için uygundur.
Şekil 1. Çapraz bağlama polimer taneleri proteinlerin yön tiyol-amin bağlanması için kullanılan stratejiyi. Amin modifiye polistiren boncuklar Sulfo-SMPB ile aktive edilir. Maleimid boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girer. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.- Reaktiflerin hazırlanması:
- PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın. Kullanımdan hemen önce bir 100x stok TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml) (tris (2-karboksietil) fosfin) hazırlayın.
- 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın.
- 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml PBS içinde, pH 7.0) kullanımdan hemen önce sisteinin hazırlayın.
- Boncuk aktivasyon:
- Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml'lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın.
- Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g'de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve.
- Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak. Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin. PBS 0,8 ml damla pelletini.
- , Taze hazırlanmış 10 mM Sulfo-SMPB 200 ml ekleyin nihai concent vermek2 mM oranı.
- Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C'de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin.
- Protein azaltma:
- Aktivasyon aşaması kuluçka süresi boyunca, bu nedenle hemen aktif boncuklara ilave edilebilir, aşağıdaki birleştirme adımı için protein hazırlamak.
Not: Bu indirgeme aşaması, her zaman GST (glutation-S-transferaz) füzyon proteinleri için gerekli değildir, ancak bu yüksek bağlanma özelliğine sağlamak için önerilir.- Protein konsantrasyonu kontrol edin ve birleştirme reaksiyonu için gerekli olan son konsantrasyona göre ayarlayın. Not: PBS içinde 6 mM proteini ve 1 ml'lik bir hacim genellikle kullanılır.
- 5 mM'lik bir son konsantrasyon elde etmek TCEP stokları ekleyin. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca çözelti inkübe edin.
Not: Reaksiyon karışımı, doğrudan aşağıdaki birleştirme reaksiyonu için kullanılabilir. - Pro belirlemek için, protein çözeltisine küçük bir miktar (bir kaç mi) koru tein konsantrasyon ve bağlanma verimliliği hesaplanması (bakınız bölüm 2).
- Aktivasyon aşaması kuluçka süresi boyunca, bu nedenle hemen aktif boncuklara ilave edilebilir, aşağıdaki birleştirme adımı için protein hazırlamak.
- Protein birleştirme aşaması:
- Santrifüjlemeden sonra (2 dk, bir mikrosantrifüj 16.000 x g) aktive boncuklar Pelet ve taze, steril 1 ml PBS içinde bir kez pelet yıkayın.
- Istenilen protein konsantrasyonu verecek şekilde, hazırlanan protein solüsyonu (örneğin, 1 ml) içinde pelletini.
Not: bağlanma adımı sırasında protein konsantrasyonu ortalama bağlanma verimliliğiyle (bağlanma etkinliği belirlenmesi için bakınız bölüm 2) ve (1.1.4.3 hesaplanan) istenen bağlanma yoğunluğuna bağlı olacaktır. Birleştirme adımı sırasında protein konsantrasyonu yaklaşık 6 mM olmalıdır, böylece etkinliği, yaklaşık% 85, 10x boncuk süspansiyonu, istenen nihai konsantrasyon 5 mM. - Aşağıdaki formülü kullanarak bağlama yoğunluğu hesaplayın:
jpg "/> Burada
ρ c bağlama yoğunluğu [protein moleküllerinin sayısı / nm 2],
Protein konsantre protein konsantrasyonu [mg / ml],
Protein M protein molekül ağırlığı [Da] w
boncuk boncuk kons konsantrasyonu [boncuk sayısı / L],
d boncuk çapı [nm 2]
Avogadro sayısı - Ortalama ligand aralığı hesaplamak için birleştirme yoğunluğu kullanın:
- Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C 'de 2 saat süre ile, protein-boncuk süspansiyonu inkübe edin.
Not: Bazıproteinler, oda sıcaklığında stabil olmayabilir. Bu gibi durumlarda, reaksiyon 4 ° CO / N üzerinden gerçekleştirilebilir. - 50 mM'lik nihai bir konsantrasyona kadar sistein stok ekleyerek boncuklar üzerinde kalan aktif gruplar devre dışı bırakın ve dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C'de 30 dakika boyunca bir süspansiyon inkübe edin. Santrifüj (2 dk, bir mikrosantrifüjde 16.000 xg) boncuk pelet.
- Protein konsantrasyonunu ve bir bağlanma verimliliğiyle hesaplanmasını belirlemek için süpernatan tutun (bakınız bölüm 2).
- Son ürünü vermek üzere, taze PBS, 1 ml 1 ml PBS ve tekrar süspansiyon ile iki kez kordon pelet yıkayın.
Not: Yukarıdaki protokol, tipik olarak, daha sonraki deneyler (bakınız bölüm 3) için 10x stoklar olarak kullanılabilir 5 mM bir son protein konsantrasyonu, önceki, birleştirilmiş proteinin 1 ml verecektir. - Protokol bölüm 3 devam etmek için, boncuk stoğu 100 ml / ml çalışma ya da 500 nM proteinin bir nihai yoğunlukta yürütüldüler. Not: Bu prosedüründe için iyi bir başlangıç noktasıe 2 nm 3 x 10 -4 protein / ml'lik bir ortalama bağlanma yoğunluğu ya da 2 mm çapa sahip olan bir boncuk 57 nm'lik bir ortalama mesafe ile sonuçlanan, 2 x 10 12 boncuk / ml olacaktır.
- Reaktiflerin hazırlanması:
- Tiol-karboksi yönlü birleştirme
Not: Bu protokol, karboksil işlevselleştirilmiş polistiren boncuklara proteinler içeren sistein bağlanması için uygundur. Karboksil yarımı, ilk olarak, değiştirilmiş amin ve daha sonra çapraz bağlı Sülfo-SMPB (Şekil 2) ile 1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid (EDC) / N-hidroksisukinimid (NHS) kullanılarak aktive edilir.
Şekil 2. Çapraz bağlama polimer boncuklara proteinler yönlü tiol, karboksil bağlanması için kullanılan stratejiyi. Karboksillenmiş polistiren taneleri, ilk EDC aktive edilen ve yarı-kararlı NHS-esteri oluşturmak için NHS ile modifiye edilir. Ethylenedi sonradan amin birleştirmeSülfo-SMPB ile reaksiyona giren bir serbest amin grubu, amin oluşur. Maleimid boncuklar sonra. Boncuk çift proteinleri yönlü ücretsiz sistein ile reaksiyona girebilen aktif bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.- Reaktiflerin hazırlanması:
- PBS (100 mM sodyum fosfat, 150 mM NaCI, pH 7.0) ve otoklav hazırlayın.
- Kullanımdan hemen önce TCEP içinde (PBS içinde 0.5 M veya 287 mg / ml), bir 100 x stok hazırlayın.
- 10x stok kullanımdan hemen önce EDC (PBS içinde 20 mM ya da 4 mg / ml) (1-Etil-3- (3-dimetilaminopropil) karbodiimid) hazırlayın.
- 10x stok NHS (PBS içinde 50 mM ya da 6 mg / ml) (N-hidroksisukkinimid) kullanımdan hemen önce hazırlayın.
- 5x stok Sülfo-SMPB ve (dH 10 mM ya da 4.58 mg / ml 2 O) kullanımdan hemen önce hazırlayın.
- Hemen b sistein 10x stok (500 mM veya 88 mg / ml'lik son yoğunluğa seyreltildi, pH 7.0) hazırlamakefore kullanımı.
- Boncuk aktivasyon:
- Hafifçe ters çevirerek boncuk süspansiyonu karıştırın ve 1 ml steril PBS, pH 7.0 ihtiva eden bir steril 1.5 ml'lik bir tüp içine boncuk süspansiyonu (örneğin, 12 mi) gerekli miktarda aktarın.
- Yavaşça bir mikrosantrifüj (16.000 x g'de 2 dakika) santrifüj boncuk ve pelet yıkamak için aşağı yukarı pipet ve.
- Dikkatle bir pipet ve ıskarta ile süpernatant kaldırmak.
- Taze steril 1 ml PBS boncuk pelletini ve yıkama adımı tekrar edin.
- PBS 0,8 ml damla pelletini.
- 10x EDC stokunun 100 ml (2 mM nihai konsantrasyon) ve boncuk süspansiyonuna 10x NHS stok çözeltisi (5 mM nihai konsantrasyon) hemen 100 ml ekleyin.
- Dönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C'de 30 dakika boyunca boncuk süspansiyonu inkübe edin.
- 0,8 ml taze, steril PBS PBS ve tekrar süspansiyon 1 ml'lik bir kez boncuk yıkayın.
- 200 ml etilendiamin ekleyin ve incdönen bir tekerlek üzerinde 25 ° C'de 1 saat boyunca boncuk süspansiyonu Ubate.
- 1 ml PBS ile bir kez boncuk yıkayın ve taze PBS 0.8 ml içinde yeniden süspanse boncuklar.
- Bölüm 1.1.2.4 (Sulfo-SMPB ile boncuk aktivasyon) Bölüm 1.1.2 altında anlatılan itibaren devam ve bölüm 1.1 (Tiyol-amin yönlü kavrama) tarif protokol kalanını izleyin. Bölüm 1.1 de tarif edilenlere benzer bir şekilde proteinin hazırlanması ve protein bağlama işlemleri gerçekleştirin.
Not: (. Yaklaşık% 75) Bu protokol kullanılarak, tipik bağlanma randımanı, bu nedenle, aynı birleştirme yoğunluğu elde etmek için uygun şekilde, ilk protein konsantrasyonunu ayarlamak bölüm 1.1 ile karşılaştırıldığında, biraz daha düşüktür.
- Reaktiflerin hazırlanması:
Kavrama Etkinliğinin Belirlenmesi 2.
Not: aşağıda Bradford reaktifi 10 ve kolorimetrik tahlilleri, protein konsantrasyonu belirlemek kullanmak için:
- Yavaşça e Bradford Reaktifini ters reaktifin şekilde almalarının sağlanması homojenliği.
- Tampon maddesi içinde 0.1 ila 1.5 mg / ml BSA konsantrasyonları kapsayan protein standartlarının hazırlanması, 10 mg / ml BSA stok solüsyonu kullanılması.
- Bir 96-kuyulu plakanın kuyularına Bradford reaktifi 250 ml ekleyin. Tüm örneklerde, Protein standartlarının ve negatif kontroller (sadece tampon) için yeterli kuyu hazırlayın.
- 96-çukurlu plaka içinde reaktifi (negatif kontrol için Protein standartlarının veya tamponu), protein örneğinin 5 ml ekleyin.
- 10 dakika boyunca oda sıcaklığında orbital bir karıştırıcı üzerinde plaka inkübe edin.
- Bir plaka okuyucusu kullanılarak 595 nm'de absorbansı ölçülür.
- A595 nm'ye karşı BSA konsantrasyonu standart bir eğri oluşturmak ve ilk ve süpernatan numuneler içindeki protein yoğunluklarının belirlenmesi için kullanabilir.
- Şöyle bağlanmış protein konsantrasyonu hesaplanır:
- Bağlanma verimliliğini olarak hesaplayın:
00eq4.jpg "/>
Rekabet tahlilleri Boncuk-bağlanmış adezinlerin 3.
- Hazırlık:
- Tohum, 24 oyuklu bir plakaya 150,000 hücre / ml 'lik bir konsantrasyonda bir rekabet deneyinde bir gün önce de Hela hücreleri, oyuk başına 1 mi, hücreler önce, deney başlamadan yaklaşık% 80 birleşik duruma ulaştılar izin vermek.
- Üçlü olarak her deneysel koşul ayarlayın. Negatif kontroller için kuyular (rekabet deneyleri sırasında eklenen hiçbir bakteri), pozitif kontroller ve (sitotoksisite deneyleri için) lizis kontrolleri (sadece yarışma deneyleri sırasında eklenen füzyon etiketi bağlanmış kontrol boncuk) ekleyin.
- V. taze bir kolonisi olan 5 ml deniz LB (MLB) kültür aşılamak parahaemolyticus ve sallayarak, 30 ° C'de O / N büyür.
- Bölüm 1. (Kuplaj) 'de tarif edildiği gibi, yeterli bir kordon ile birleştirilmiş MY hazırlayın. 10x boncuk stoğu 100 ml Veren ile sabitleştirilir.
- Rekabet deneyi:
- Competit günündeiyon deneyi, bakteri kültürü OD 600 ölçün.
- Katkı maddesi olmadan, renksiz bir DMEM içinde bakteri kültürleri seyreltilmesi ile enfeksiyon ortamı hazırlanır,% 10 v / v boncuk süspansiyonu (her iki adezin-bağlanmış taneleri veya kontrol tanesi), 10 MOl'de 1 ml hazırlayın vermek üzere ihtiva eden 37 ° C önceden ısıtılmış / oyuk ve örnek başına 10-20% -fazla hacmi. Not: Yukarıda belirtilen koşullar altında (24 oyuklu plaka, V. parahaemolyticus, 10 İB), O / N kültürü gerekli hacim için kültür 3 / OD 600 olarak hesaplanır oyuk (ml / ml) başına eklenmelidir. Örneğin, enfeksiyon ortamı, 1 ml tipik haliyle, bakteri kültürü, birkaç ml 100 mi boncuk süspansiyonu içerecek ve renksizdir, katkısız DMEM 1 ml'ye kadar yapılır.
- Kuyulardan eski orta çıkarın ve her bir 37 ° C, steril PBS önceden ısıtılmış 1 ml ekleyerek kültürlenmiş Hela hücreleri yıkayın.
- PBS çıkarın ve oyuk başına enfeksiyon ortamı 1 ml. Ayrıca çözümler cont ekleyerek, kontrolleri kurmak% 0.1 Triton X-100 (sitotoksisite ölçümleri için, sadece gerekli liziz kontrol) içeren kontrol boncuklar ve bakteriler (pozitif kontrol) ya da adezin boncuk ve hiçbir bakteri (negatif kontroller) veya DMEM Tahliye.
- Istenen süre (örneğin, sitotoksisite ölçümleri için 4 saat ya da yapışma ölçümleri için 1 saat) 37 ° C 'de, bir doku kültürü inkübatörü içinde, plaka inkübe edin.
Not: konakçı hücreler bakteriyel yapışma ve sitotoksisite Hem inhibisyon etkinliği için okuma-çıkışları olarak kullanılabilir. Sitotoksiklik ve yapışma ölçümlerinin zaman noktaları uyuşuyorlarsa sitotoksisite kültür süpernatanı ve bağlanma tahlilleri, kalan hücre katmanı elde edilen numuneleri kullanmak kullanılarak tespit edilir, çünkü her iki çalışma, aynı kaynaktan örnekler kullanılarak gerçekleştirilebilir.
- Sitotoksisite ölçümleri:
- Belirtilen zaman noktalarında (örn 4 saat sonrası enfeksiyon), her 24 kuyu ve transfer için üç kez 200 ml kaldırmakBir 96-yuvalı plaka.
- De yeni bir 96 oyuklu bir plakaya, 1500 x g'de, her 5 dakika ve transfer 100 ml, 96 gözlü levhalar dönerler. Üç kopya halinde 96 oyuklu bir plakanın oyuklarına taze enfeksiyon deneyleri sırasında kullanılan ortamın 100 ml (bu boş olarak kullanılacaktır) ekleyin.
- Laktat dehidrogenaz (LDH) salım deneyi bir LDH sitotoksisite belirleme kiti kullanılarak ve üreticinin yönergeleri izleyerek gerçekleştirin.
- Kısaca, 25 artışlarla ihtiyaç duyulan reaktif miktarını hesaplamak (62 numune ölçülecek ise, örneğin, 75 vs. için yeterli reaktif karışımı makyaj).
- Örneğin, 100 numune için, reaktif B Invert 250 ul reaktif A 11,25 ml karışımı, köpük önlemek için girdap yok.
- Çok kanallı bir pipet ile pipetleme edebilmek için bir hazne karışımı koyun. Her bir örnek için reaktifi karışımı 100 ul ekle.
- Oda sıcaklığında inkübe ve plaka 10, 20, 30 dakika sonra, bir plaka okuyucusu üzerinde 490 nm'de absorbans okunur. Liziz kontrol numunesinin absorpsiyonunu yüksek ama yine plaka okuyucu (tipik haliyle, 2-3 absorbans birimi) lineer aralığında olduğu veri kümesi analiz edin.
- Dönüşüm için aşağıdaki formül kullanılarak,% sitotoksisite gibi sonuçları Express:
- Bakteriyel yapışma ölçümü:
- Belirtilen zaman noktalarında (örn 1 saat sonrası enfeksiyon) olarak, hücre tabakasından ortamı çıkarın.
- İyice herhangi bir un bağlı hücreleri çıkarmak için, steril, önceden ısıtılmış PBS (1 ml PBS her birinin en az 3-4 yıkama) hücre tabakası yıkayın.
- PBS içinde Triton X-100 çözeltisi h steril% 1 v 1 ml / eklenerek göz başına Lyse konakçı hücreler sunar. 5 dakika boyunca 37 ° C 'de plaka inkübe edin.
- 1.5 ml tüpler ayırmak için de her içeriğini aktarmadan önce her bir örnek yukarı ve aşağı birkaç kez pipetle. Örneklerin 10 kat seri dilüsyonları hazırlayınsteril PBS içine (örneğin, numune 100 ml PBS 900 ml kullanım).
- Levha 100 MLB agarı üzerinde her bir numunenin mi ve bir hücre dağıtıcı kullanılarak yayıldı. Bakteri suşları ve zaman noktasına bağlı olarak plaka sulandırmalarda hangi optimize edin. Not: Açıklanan deney düzeneği için, 10 5 ya da 10 6 kat seyreltme CFU sayısını uygun bir sayı verir.
- 37 ° CO / N plakaları inkübe ve koloni sayımı ile bakteri numaralandırma.
Representative Results
V. parahaemolyticus adezinin MAM7 konak yüzey reseptörleri tanınması katılan yedi tandem memeli hücre girişi (MCE) etki içerir. Bu V ile rekabet etmek için, bu malzemelerin kabiliyetini test etmek için yedi ardışık MCE etki (MAM7) ya da sadece ilk MCE alanını (MAM1) ya da polistiren kapsayan rekombinant bağlanmış boncuklar, saflaştırılmış fragmanlar kullanılır bağlama konakçı hücre için parahaemolyticus ve yapışma inhibitörleri olarak, bu maddelerin elde edilen etkinlik. Hela hücreleri V. ile enfekte edildi in vitro enfeksiyonundan kaynaklanan parahaemolyticus streyn POR1 ve sitotoksisite 4 saat (Şekil 3) sonra değerlendirilmiştir. % 0.1 Triton X-100 (pozitif liziz kontrol) Hela hücrelerinin tedavisi tam hücre lizizi ile sonuçlanmıştır, enfekte olmamış hücreler POR1 ile muamele edilmemiş olan hücreler üzerinde in vitro enfeksiyonu hücre lizizi çok yüksek seviyelerine yol açtı. Sitotoksisite, çok düşük seviyelerde gösterilir ve bu MAM7-co ile inhibe edilmiştirboncuklar upled ancak MAM1-bağlanmış olmayan ya da GST-bağlanmış kontrol tanesi (Şekil 3).
Vibrio parahaemolyticus Şekil 3. Karakterizasyonu rekabet deneyleri sırasında epitel hücrelerinde sitotoksisitesine neden olmuştur. Hücreler, V ile tedavi edildi parahaemolyticus (Vp), (+) ile gösterilir, ya da bakteriler (-) farklı rakip öğeler (. bileşik) mevcudiyetinde gösterildiği gibi. Bunlar ya hiç comp dahil. (-), MAM7 boncukları (MAM7), MAM1 boncukları (MAM1) ya da GST kontrol tanesi, (GST). Kontroller olarak, hücreler Triton X-100 (triton, liziz kontrolü) ya da muamele edilmiş ya da enfekte edilmeden (uninf) kalmıştı. Bölüm 3'te tarif edildiği gibi 4 saat sonra LDH salınımı ölçüldü ve sonuçlar Triton kontroller (% 100) ve yukarıda tarif edildiği gibi boşlukları (% 0) normalize edilmiş. Sonuçlar üçlü deneylerden elde edilen ortalama ± SEM araçlardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
V. numaralandırma MAM7-, MAM1-, ya da GST Kontrol taneleri ile inkübe muamele edilmemiş Hela hücreleri, ya da hücrelerin ya da bağlı parahaemolyticus MAM7 boncuklar fakat MAM1- olmayan ya da GST kontrol tanesi, V outcompete ortaya eki için parahaemolyticus hücre yüzey reseptörleri (Şekil 4) ev sahipliği yapacak.
Yarışma deneyler sırasında bakteriyel ekin Şekil 4. Karakterizasyonu. Hela hücreleri V ile enfekte edildi parahaemolyticus yokluğunda POR2 (Vp +), (-) ya da birim rekabet mevcudiyeti aşağıdaki gibi MAM7 boncukları (MAM7), MAM1 boncukları (MAM1) ya da GST kontrol tanesi, (GST) (blş.). Bakteriyel yapışma olarak 1 saat sonra ölçülmüştür bölümünde anlatılan 3. Sonuçlar üçlü deneyler ± SEM araçlardır. Araçlar (CFU / ml FLTR) 2,3010 6, 1,5310 5, 2,0510 6, 2,1210 6 bulunmaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Fluorofor etiketli boncuklara bağlanmış adhesinler konukçu hücrelere bakteriyel yapışmayı taklit ve hücresel görüntüleme (Şekil 5) güçlü araçlardır maddelerin oluşumuna yol açar. MAM7-birleştiğinde floresan mavi boncuk kullanarak, epitel hücrelerine MAM7 aracılı eki sürecini karakterize. Konukçu hücrelere MAM7 bağlanması yeniden düzenlenmesi ve birlikte görüntülenmiştir F-aktine (Şekil 5B) için leke rodamin Phalloidin kullanıyorlardı stres elyafların biçimlendirilmesine aktin ile sonuçlanmıştır.
_upload / 53400 / 53400fig5.jpg "/>
Hela için MAM7-birleştiğinde boncuk Şekil 5. hazırlanması ve floroforun kullanımı floresan mavi biomimetic boncuk (A) Süspansiyon (sağ tüp, 10x stok). Görüntüleme amaçlı biomimetic boncuk etiketli ve kontrol (sol tüp) tampon. (B) Ek aktin düzenlenmeleri ve stres lif oluşumu hücreler sonuçları. (Rodamin-Phalloidin ile boyanmış kırmızı) floresan mavi boncuk Bağlanma ve elde edilen aktin stres lifleri mikroskobu ile görüntülendi. Bar, 10 um. Panel B Görüntüler Lim ve ark. 1 uyarlanmıştır ve Creative Commons Attribution lisansı altında yeniden üretildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Burada, sırasıyla amin- akuple tiol içeren proteinler için kullanılan veya karboksilat ile modifiye edilmiş polistiren boncuklar gibi iki protokol, tarif eder. İşleme bağlı kolaylığı, tiol-amin birleştirme tercih edilir, ancak arzu edilen boncuk tarifnamede (çap, flüoresan özellikleri) bağlı olarak, bir amin-işlevselleştirilmiş boncuk kullanılması mümkün olmayabilir ve bu nedenle karboksilat dönüştürecek bir protokol dahil ettik - Bir amin kısma Araştırmacı iskele seçiminde mümkün olan en büyük esnekliği sağlamak için. Protein, yönlü kavrama ihtiva eden herhangi bir sistein hem tiyol-amin ve tiol, karboksil birleştirme çalışmaları (yani, N-terminusunda başına protein, yüzey görüntüsünü taklit immobilizasyonu) sistein artıklarının olmayan bir protein gerektirir, ancak, bu bir GST füzyon olarak üretilir Protein ya da bu site tarafından tanıtılan tek bir terminal sistein kalıntısı mutagenezini yönetti içerir. Birden çok reaktif sistein ihtiva edilmesi halindeprotein içinde, bu proteinin fonksiyonunu engelleyebilir rastgele immobilizasyon yol açacaktır. Pek çok bakteriyel adezin doğal sistein içermez. Bu yerel yapısı ve fonksiyonu mutant korunur sağlamak için kapsamlı deneyler gerektirecektir, ancak diğerleri için, bu, bir yere yöneltilmiş mutagenesis ile ayrılabilmektedir. GST füzyon proteinleri için, boncuklara bağlanmış saflaştırılmış GST-eklentisi uygun bir negatif kontrol olarak da kullanılabilir. Bu genellikle bir araya gelme veya non-spesifik olarak hücrelere bağlı için daha yüksek bir eğilimi olduğu gibi, bir kontrol olarak bağlanmamış boncuklar kullanılarak, kaçınılmalıdır. Ancak EDC kullanılarak protokol 1,2. Basitleştirilmiş bir versiyonu, bu durumda, bağlantı yönlü bağlantıyı garanti etmez, bu nedenle protein, birincil aminler ile gerçekleşir ve bununla birlikte in, karboksil işlevselleştirilmiş polimer boncuklara birkaç proteinlere kullanılabilir.
Bir indirgeme maddesi olarak TCEP gibi dithiothr gibi diğer ticari olarak temin edilebilir ve yaygın olarak kullanılan indirgeme maddeleri ile ikame edilmesi gerekmezeitol (DTT) ya da 2-merkaptoetanol (BME), içlerindeki tioller tiol maleimid bağlama adımında, protein bağlama ile rekabet edecek şekilde. PBS diğer tamponlar ile ikame edilebilir, ancak aşağıdaki hususlar ile: Tamponlar birincil aminler içermeyebilir (nedenle Tris ihtiva eden tamponlar uygun değildir). Çok düşük (<10 mM) tuzu konsantrasyonlarını ihtiva eden tampon maddeler kullanılması topaklanma boncuk yol açar ve de kaçınılmalıdır. Protein saflığı da önemli bir faktör, bu işlem sırasında dikkate ve yüksek kaliteli veri elde etmek için olan, saf proteinler, kullanılmalıdır. Rutin olarak, en az bir afinite arıtma ve jel filtrasyon aşaması da dahil olmak üzere, birden fazla adımda proteinleri saflaştırmak ama değiştirme kromatografisi, iyon bazı durumlarda, bir üçüncü adım olarak yapılır. SDS-PAGE ile değerlendirildiği gibi bir sonucu olarak bağlamak için kullanılan proteinler saflığı genellikle% 90 veya daha fazladır.
Bu inci gibi, ilk reaksiyon karışımında hem protein konsantrasyonlarını belirlemek için önerilirReaksiyon tamamlandıktan sonra e süpernatant. Bu bariz Boncuk bağlanmış protein konsantrasyonunu ve dolayısıyla bağlanma yoğunluğu belirlemek için yardımcı olacaktır. Her iki değerin belirlenmesi, aynı zamanda bağlanma randımanı hesaplanmasına izin verir. Istenen son konsantrasyon ve bağlanma yoğunluğu elde etmek için, daha sonraki reaksiyonlarda ilk protein çözeltisinin hazırlanması, bu göz önüne alınabilir. Reaksiyonun maddelerin yok kullanılan konsantrasyonlarda boya kompleksi oluşumu ile karışabilir Bradford reaktifi, özellikle, önce ve birleştirme reaksiyonundan sonra protein konsantrasyonu belirlenmesi için uygundur. Düşük protein konsantrasyonu kullanılacak ise, bu yöntem, daha hassas bir saptama yöntemi ile ikame edilmesi gerekebilir, ancak ilgi bu birleştirme reaksiyonu içinde ihtiva edilen maddeler ile uyumlu olması gerekir için ödenmesi gereken yer alır. Aynı zamanda özenle toz reaktifleri taze hazırlanmış reaktifleri kullanmak ve işlemek için tavsiye edilir (örneğin, mağazakapalı bir kap içinde ve silis boncuklar kullanarak birleştirme etkinliğini olumsuz etkileyecektir reaktifler kalitesi yana nem çekme reaktifler) önlemek için. Bağlanma verimliliği beklenenden daha düşük ise, olası çözümler başlangıç kordon ve protein artan konsantrasyonlarda içerir. Daha yüksek konsantrasyonlar kullanılıyorsa, eşleme reaktif konsantrasyonu, orantılı olarak artırılacaktır için yeterli molar fazlalığı temin etmelidir. Boncuk / protein konsantrasyonlarını değiştirerek genellikle daha iyi bir optimizasyon yolunda adım ziyade tepki süreleri artmaktadır. Boncuk bağlanması için protokoller uzun olduğundan, biz bunlara malzemenin büyük bir toplu hazırlar. Süspansiyon örnekleri, sıvı nitrojen içinde hızlı bir şekilde dondurulup birkaç ay boyunca -20 ° C 'de muhafaza edilebilir. Çözülmüş alikotları refrozen olmamalıdır ve 4 ° C 'de tutulur ve 1-2 gün içinde kullanılmalıdır. Bununla birlikte, bu ilk olarak küçük bir parti test edilmelidir olarak kullanılan protein maddelerinin tabiatına ve stabilitesine bağlı olarak değişecektir.
Vıbrıo parahaemolyticus ile Hela epitel hücrelerin enfeksiyonunu inhibe etmek için, boncuk bağlanmış MAM kapasitesinin ölçülmesi için yapıldı ya da okuma olarak sitotoksisite azalır . Her iki durumda da, hazırlanması ve rekabet analizleri aynı protokolü uygulayın. V. okuma bağlı olarak, farklı suşlar parahaemolyticus kullanılmaktadır: POR1 sitotoksisite ölçümleri için kullanılan sitotoksik suşu, sitotoksik olmayan streyn POR2 bakteriyel yapışmayı ölçmek için kullanılır ise, hücre ölümü ve hücre dekolmanı bağlı bakteri miktarının belirlenmesi için prosedür ödün yana.
Başlangıçta, yetYarışmaları'na deneyleri konakçı hücreler bakteriler eklenmesinden önce boncuklar ile önceden inkübe edildi, ilk adım adım bir protokol gibi oluşturulmuştur. V için parahaemolyticus ve ikinci topuk kısmı özellikleri (MAM7 bağlanmış 2 um boncuk), her iki boncuk ve bakteri elde edilen sitotoksisite değişiklik olmaksızın, aynı anda ilave edilebilir. Yani, bu deney sisteminde, taneler konakçı hücre bağlama bakterileri outcompete. Kullanılan bakteri türleri ve boncuk geometrisine bağlı olarak, iki ayrı adımlar olarak boncuk yapışma ve bakteriyel enfeksiyonu korumak için iyi nedenler olabilir. Örneğin, hareketsiz bakteri hücreleri enfekte etme plakalar genel olarak enfeksiyonun ortam ilave edildikten sonra santrifüje tabi tutulur. Bu hücre tabakası boncuk yüksek ölçüde düzensiz dağılımına yol açar Bununla birlikte, kordon süspansiyonlar ihtiva eden plakalar santrifüj kaçınılmalıdır. Daha küçük parçacık boyutları kullanılıyorsa, boncuk, hücre yüzeyindeki yerleşmek uzun sürer durumda su içindefficient süresi enfeksiyondan önce kordon bağlanması için izin verilmelidir. Bakteriyel yapışma üzerinden oku olarak kullanıldığında, konakçı hücreler önemli ölçüde enfekte eden soyun zarar görmezler burada numuneler bağlı bakterilerin miktarının tehlikeye hücre kopması ve yok edilmesi olarak, zaman noktalarında alınır.
Bunun yerine seyreltme plaka ile bakteriyel yapışmayı sıralandıran örnekler alternatif görüntüleme (Şekil 5) işlenebilir. Bu durumda, doku kültürü hücreleri, daha çok, doğrudan kuyulara daha cam kapak slipleri üzerine ekildi edilmelidir. Buna ek olarak, bir flüoresan proteini ifade flüoresan boncuklar ve bakteri enfeksiyonu özel konakçı hücre işaretleri ile birlikte kullanılabilmektedir. Örneğin, rekabet deneyleri genellikle konakçı hücrelerinin aktin hücre iskeleti leke ve floresan mavi boncuk ve floresan ile birlikte, enfeksiyondan kaynaklanan morfolojik değişiklikleri değerlendirmek için floresan kırmızı rodamin-Phalloidin kullanarak görüntülüYeşil (GFP ifade veya SYTO18 lekeli) bakteriler.
Staphylococcus aureus FnBPA, Streptococcus pyogenes ve Streptococcus F1 FUD ve Vibrio parahaemolyticus MAM de dahil olmak üzere topuk kısmı çiftli adezinler bir dizi, yapışma, yapışma inhibisyonu ve yapışma katkı çalışma biomimetik malzemeleri olarak kullanılmıştır patojen aracılı sitotoksisite 1, 7, 8. iskeleler olarak kullanılan polimer taneleri renk (örneğin, mavi, kırmızı flüoresan, mavi, yeşil, turuncu) geniş bir aralığında kullanılabilir, çünkü bu yaklaşımı kullanmanın avantajlarından biri, bağlanma etkinlikleri görselleştirme kolaylığıdır. Bu durumda, işlev müdahale edebilir doğrudan protein etiketleme, önlenebilir. Buna ek olarak, bu şekilde çözünür proteinler ile karşılaştırıldığında fizyolojik olarak daha uygun bir yapıyı yansıtan birleştirme taklit eder bakteriyel yüzey üzerindeki adezinlerin değerlikli görüntü yüzey.
Bozulmamış bakteri veya bacteri kullanıldığı çalışmalarda karşılaştırıldığındaal mutantlar, boncuk yaklaşımı bakteriyel büyüme ile ilgili sorunları circumvents. Olumsuz konak hücrelerini etkiler büyüme ortamı ve besin tüketme asitlenme ve bakteri çoğaltma sonunda ödün - Örneğin, uzun vadeli (örneğin, O / N) sağlam bakterileri kullanarak hücrelerin barındırmak için bakteriyel yapışma çalışmalar genellikle bakteri gelişimini eşlik olayların tarafından tehlikeye görüntü kalitesi.
Daha yakın zamanda, boncuk çiftli adezinlerin kullanımı bakteriyel eklenme alt sinyalleme işlemlerinin rol oynayan konak hücre faktörlerinin meyil saflaştırılması için bir araç olarak kullanımını içerecek şekilde genişletilmiştir. V. parahaemolyticus MAM7 konakçı hücre zarında fosfatidik asitler bağlanarak, RhoA aktivasyonu ve aktin yeniden düzenlemeleri 1, 3 tetikler. MAM çiftli taneler arındırmak ve MAM-konakçı hücre bir sonucu olarak bir araya toplanan sinyal platformları katılan proteinleri tanımlamak için kullanılmaktadır bağlama. Boncuklar can berikolayca kısa santrifüjleme aşaması süpernatanından ayrılması ve ilgili protein kovalent bağlanan, bu tür proteomik veya Western gibi alt uygulamalar için kullanılabilir, ilgili protein kompleksleri kirletici proteinlerden ayrılmasını sağlamak ve zenginleştirmek için iyi bir yöntem olup, Kurutma.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma | 646547 | Danger; corrosive can be bought as solution or freshly prepared |
| Sulfosuccinimidyl 4-(p-maleimidophenyl)butyrate (Sulfo-SMPB) | Fisher | PN22317 | Danger; toxic |
| L-cysteine | Sigma | 30089 | Danger; toxic |
| Latex beads, amine-modified polystyrene, fluorescent blue - aqueous suspension, 2.0 μm mean particle size | Sigma | L0280 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide (EDC) | Thermo scientific | 22980 | |
| N-hydroxysuccinimide (NHS) | Thermo scientific | 24500 | |
| Carboxylate-modified polystyrene beads | Sigma | CLB9 | harmful; a range of alternative particle sizes and colors is available |
| Ethylenediamine | Sigma | E26266 | Danger; flammable, corrosive, toxic, sensitizing |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Promega | W3841 | |
| Bradford reagent | Sigma | B6916 | Danger; corrosive and toxic |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - high glucose - With 4,500 mg/L glucose and sodium bicarbonate, without L-glutamine, sodium pyruvate, and phenol red, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture | Sigma | D1145 | for infection experiments |
| DMEM | Sigma | D6429 | for maintenance of cultured host cells |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| Penicillin-Streptomycin - Solution stabilized, with 10,000 units penicillin and 10 mg streptomycin/mL, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture |
Sigma | F9665 | supplement for tissue culture medium |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| LDH Cytotoxicity detection kit | Takara | MK401 | |
| Plasticware | |||
| reagent reservoirs (25ml) | SLS | F267660 | |
| 24-well plates | Greiner | 662160 | |
| 96-well plates | Greiner | 655182 | |
| Equipment | |||
| haemocytometer | |||
| microcentrifuge | |||
| plate reader | |||
| tissue culture facilities | |||
| multichannel pipette |
References
- Lim, J., Stones, D. H., Hawley, C. A., Watson, C. A., Krachler, A. M. Multivalent Adhesion Molecule 7 clusters act as signaling platform for host cellular GTPase activation and facilitate epithelial barrier dysfunction. PLoS Pathog. 10 (9), e1004421 (2014).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Outer membrane adhesion factor multivalent adhesion molecule 7 initiates host cell binding during infection by gram-negative pathogens. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (28), 11614-11619 (2011).
- Krachler, A. M., Orth, K. Functional characterization of the interaction between bacterial adhesin multivalent adhesion molecule 7 (MAM7) protein and its host cell ligands. J Biol Chem. 286 (45), 38939-38947 (2011).
- Joh, D., Speziale, P., Gurusiddappa, S., Manor, J., Hook, M. Multiple specificities of the staphylococcal and streptococcal fibronectin-binding microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules. Eur J Biochem. 258 (2), 897-905 (1998).
- Bingham, R. J., et al. Crystal structures of fibronectin-binding sites from Staphylococcus aureus FnBPA in complex with fibronectin domains. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105 (34), 12254-12258 (2008).
- Ensenberger, M. G., et al. Specific interactions between F1 adhesin of Streptococcus pyogenes and N-terminal modules of fibronectin. J Biol Chem. 276 (38), 35606-35613 (2001).
- Hawley, C. A., Watson, C. A., Orth, K., Krachler, A. M. A MAM7 peptide-based inhibitor of Staphylococcus aureus adhesion does not interfere with in vitro host cell function. PLoS One. 8 (11), e81216 (2013).
- Krachler, A. M., Ham, H., Orth, K. Turnabout is fair play: use of the bacterial Multivalent Adhesion Molecule 7 as an antimicrobial agent. Virulence. 3 (1), 68-71 (2012).
- Krachler, A. M., Mende, K., Murray, C., Orth, K. In vitro characterization of multivalent adhesion molecule 7-based inhibition of multidrug-resistant bacteria isolated from wounded military personnel. Virulence. 3 (4), 389-399 (2012).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
