Introduction
ثبت أن الحركة الخلايا السرطانية هي التنبؤية المحتملة المتنقل، بالنظر إلى أن مثل هذا السلوك يسهل الغزو من خلال الغشاء القاعدي والدخول في الدورة الدموية 1. وقد ركزت معظم البحوث على الحركة على كيفية سلوك الخلايا في ثنائي الأبعاد (2D) الإعداد، على الرغم من أنه أصبح من المسلم به على نطاق واسع أن حركة الخلايا في ثلاثية الأبعاد (3D) المصفوفة هي أكثر تمثيلا لكيف يمكن لهذه الخلايا نفسها سوف فعلا تتصرف في الجسم الحي 2. وتستخدم نظم الاستزراع 3D على نحو متزايد لدراسة السلوكيات الخلوية التي تتراوح من مورفولوجيا الخلايا، لحركية النمو وحساسية العقاقير 3. وقد أدى الرغبة في رصد سرطان غزو الخلايا في إطار محيط 3D لتوليف التقنيات المحددة سابقا التي تنطوي على جيل من المجاميع خلية 3D (الكروية) عن طريق أسلوب ثقافة الإفلات شنقا 4، تليها تضمين هذه الأجسام الشبه الكروية إلى خارج الخلية 3D مصفوفة (ECM) تتألف من الكولاجين والغشاء القاعدي المواد 5. ويسعى هذا الأسلوب إلى تحسين هذه التقنيات المحددة سابقا من خلال توفير نهج مبسط التي يمكن استخدامها بسهولة لمقارنة الغزو في إطار مجموعة من الظروف التجريبية.
الطرق التقليدية أكثر لتقييم حركية الخلية في المختبر هي فحص الجرح الصفر وفحص transwell 6. الفحص السابق يصور حركية الخلية في وضع 2D، وبالتالي فهي مستقلة عن مجموعة متنوعة من الميزات الهامة في الجسم الحي الغزو، مثل نشاط الأنزيم البروتيني 7. مقايسة transwell يمكن غزو الخلايا نموذج أفضل عندما تكون مغلفة يدرج بشكل جيد مع ركائز ECM، ولكن فقط معلمة واحدة، أي ظهور الخلايا على العكس سطح غشاء يقاس، والعديد من الفروق الدقيقة من غزو الخلايا وبالتالي لا يمكن ملاحظتها بسهولة. وعلى النقيض من هذه التقنيات، وفحص الخلايا السرطانية غزو كروي (الشكل 1 </ قوي>) يسمح للرصد في الوقت الحقيقي من غزو الخلايا في إعداد هذا ليس من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة فقط، ولكن أيضا يسمح الميزات الهامة خلية خط محدد لأن تصور، مثل هجرة الخلايا الفردية مقابل الجماعية 8. هذا الأسلوب يتيح أيضا مزايا أكثر من فحوصات النمو الثقافة 3D القياسية. توليد المجاميع الخلوية عبر طريقة انخفاض شنقا يحد في البداية حركة الخلية، بحيث يتم تحفيز الخلايا لغزو بعد رفع هذا القيد. وعلاوة على ذلك، حالما يتم رفع هذا القيد، والخروج خلية تسير في اتجاه موحد ويمكن بعد ذلك quantitated مريح.
المواد ECM الأكثر شعبية المستخدمة في الخلايا السرطانية الكروية المقايسات Matrigel والنوع الأول الكولاجين، حيث كل عنصر من هذه العناصر أدوارا هامة ومميزة في التأثير على سلوك النقيلي. Matrigel هو خليط يفرز من البروتينات التي تنتجها الخلايا ساركوما Engelbreth-هولم سرب الماوس، وأثرت في basemeبروتينات الغشاء الإقليم الشمالي مثل laminin، entactin، والنوع الرابع الكولاجين 9. لهذا السبب Matrigel يشار من الآن فصاعدا باسم "المواد الغشاء القاعدي". وتوفر هذه المواد الغشاء القاعدي بروابط الأساسية اللازمة لإنتغرين التصاق خلال السرطان غزو الخلايا 10 بالإضافة إلى العديد من البروتينات الأخرى التي تمارس مجموعة من الآثار على سلوك الخلية 11. في المقابل، النوع الأول الكولاجين، الذي أعد عادة من هضم الحمض الأوتار والهياكل الكولاجينية الكثيفة، 12، هو مادة مصفوفة أبسط من ذلك بكثير التي هي بمثابة العنصر الهيكلي الرئيسي للأنسجة وسدى دعم الأنسجة والأعضاء الضام في الجسم. وقد ثبت أن الخصائص الفيزيائية للالكولاجين يمكن أن تنظم عددا من ملامح الحركة الخلية؛ على سبيل المثال، في محاذاة الألياف الكولاجين في واجهة للورم انسجة تسمح الخلايا السرطانية للهجرة في وقت لاحق على طول تلك الألياف عند غزو في سدى 13. في مقايسة المقدمة هنا، سواء النوع الأول الكولاجين ويتم استخدام المواد الغشاء القاعدي وسيلة لدراسة سرطان 3D خلية سدى التفاعلات.
تأثير تثبيط أو تنشيط مسارات التي تتحكم يمكن رصدها الغزو بعد أن تم جزءا لا يتجزأ من الخلايا في مصفوفة 3D. يمكن سابقة التجهيز الخلايا أثناء النمو في قطرات شنقا أو عند نقله الى ثقافة 3D، اعتمادا على ما إذا كان سوف تكون هناك حاجة إلى علاج طويل لتعديل الغزو. لعلاج أقصر، فمن المستحسن أن العقار أن تكون مختلطة مع تعليق كروي بعد جمع، وكذلك وسائل الإعلام التي ستحيط الثقافات 3D، لتسهيل التعرض الكافي للخلايا المخدرات. المقبل، خلايا انسجة طبيعية أو المرتبطة الورم يمكن ممزوجة مع مواد مصفوفة لتقييم دورها في تحوير غزو الخلايا السرطانية، أو لتحديد كيفية يشير التأثيرات سلوك الخلية نظير الصماوي وautocrine. وقد أظهرت هذه الفكرة في الدراسة حيث coculture من العقيدعلى السرطانية والخلايا البطانية في قطرات شنقا أدى إلى شبكة الأوعية الدموية داخل الكروية 14. وأخيرا، يمكن أيضا مكونات ECM يمكن تغييرها، كما يتأثر غزو الخلايا السرطانية عن طريق ركائز مختلفة 15. وبالتالي فإن الطريقة المعروضة أدناه إطارا لتقييم غزو الخلايا السرطانية في إطار مجموعة من الشروط. بشكل عام تبين أن ليس جميع خطوط الخلايا خلق الكروية في قطرات شنقا وخطوط الخلايا الظهارية المظهر عادة تشكل مجالات العادية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. توليد الأجسام الشبه الكروية
- إعداد وحيدة الخلية تعليق لتعليق الثقافات قطرة فصل الثقافات الخلايا السرطانية ملتصقة من ~ 70٪ التقاء باستخدام PBS غسل تليها التعرض إلى 0.05٪ التربسين-EDTA الحل.
- تحييد الحل التربسين مع وسائل الإعلام ثقافة الخلية وعدد الخلايا باستخدام قسامة لتعليق الخلية. ملاحظة: وسائل الإعلام ثقافة الخلية معينا سوف تعتمد على خط الخلية التي يجري اختبارها. اتبع توصيات سائل الإعلام ATCC، حيث وسائل الإعلام ثقافة الخلية عادة DMEM + 10٪ FBS. ويمكن الاطلاع على مزيد من المعلومات في جدول المواد.
- إجراء تخفيف للسماح لزرع البذور من 500-1،000 الخلايا في 20 قطرة ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
- الحصول على صحن 10 سم وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة إلى أسفل. ملاحظة: هذه الخطوة تحمي قطرات شنقا من التبخر. من حيث التكلفة أقل "الصف البكتريولوجية" أطباق يمكن استخدامها في مكان من الأطباق الصف زراعة الخلايا، وكذلك الخلايا لا تابعالتصرف سطح الثقافة.
- استخدام الماصة متعدد القنوات لنقل 20 قطرات ميكرولتر من تعليق خلية المخفف إلى السطح الداخلي للغطاء.
- الماصة 40 قطرات (5 صفوف من 8 قطرات) على غطاء صحن 10 سم.
- عكس الغطاء ومكان على طبق الثقافة. احتضان الثقافات قطرة شنقا في 37 درجة مئوية لمدة 72 ساعة لتوليد الأجسام الشبه الكروية.
- الوجه الغطاء في اثقة، الطريقة التي تسيطر عليها حتى الان. ملاحظة: للقلب غطاء سريعة جدا أو بطيئة جدا قد يسبب قطرات للتحول. بعض خطوط الخلايا قد شكل الكروية في 48 ساعة أو أقل، في حين أن البعض الآخر قد يتطلب أكثر من 72 ساعة لإنتاج الركام المدمجة.
2. تضمين من الأجسام الشبه الكروية في مصفوفة 3D
- ذوبان الجليد قسامة من النمو انخفاض عامل الطابق السفلي المواد غشاء عند 4 درجات مئوية خلال الليل قبل تضمين الكروية.
- اختياري: آبار طبقة مع ECM مقدما لمنع التفاعل كروي محتمل مع cultu الأنسجةإعادة السطح.
- الماصة 200 ميكرولتر من ECM لكل بئر في لوحة 24-جيدا.
- إمالة لوحة للتأكد من أن ECM يغطي السطح جيدا بأكمله.
- إزالة بعناية ECM الزائد مع الماصة.
- احتضان لوحة حتى آبار جافة: 3 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
- اختياري: آبار طبقة مع ECM مقدما لمنع التفاعل كروي محتمل مع cultu الأنسجةإعادة السطح.
- جمع الكروية عن طريق إمالة غطاء صحن زراعة الأنسجة وتجمع وسائل الإعلام. نقل وسائل الإعلام مع الكروية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
- سماح 10 دقيقة للالكروية ليستقر على الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge. وينبغي أن يكون الكروية مرئية بالعين.
- مزيج 100 ميكرولتر من المواد الغشاء القاعدي مع 100 ميكرولتر من البرد (4 ° C) النوع الأول من الكولاجين في أنبوب قبل المبردة منفصل. نضع الخليط في 4 درجات مئوية لمنع أي هلام من ترسيخ قبل الأوان.
- استخدام نصائح الماصة قبل المبردة إذا نقل كميات صغيرة.
- تقديم الرعاية عندماخلط المواد الغشاء القاعدي والكولاجين النوع الأول لمنع تشكيل فقاعة الهواء. ملاحظة: فقاعات الهواء قد تعيق التصوير في وقت لاحق في البروتوكول إذا أصبحت جزءا لا يتجزأ من هلام.
- نضح الكروية من 40 ميكرولتر الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge، ويتحد مع المواد الغشاء القاعدي / النوع الأول الكولاجين الخليط. كن حذرا لمنع تشكيل فقاعة الهواء عند خلط. ملاحظة: محلول يحتوي على 100 ميكرولتر المواد الغشاء القاعدي، 100 نوع ميكرولتر أنا الكولاجين، و 40 ميكرولتر من الكروية سيخلق ما يكفي من المواد لمدة 4 الثقافات 3D مستقلة. يمكن زيادتها هذا أعلى أو لأسفل.
- الماصة 40 قطرات ميكرولتر من مزيج لزج في مراكز الآبار على طبق من ذهب 24-جيدا. يحافظ على لوحة لمنع خليط من الوقوع في جانب البئر. ملاحظة: A عمود واحد على لوحة 24-جيدا - يوصى لكل حالة لفحصها - 4 آبار.
- وضع لوحة الباحثالزراعة العضوية 37 ° C الحاضنة وترك دون عائق لمدة 30 دقيقة. إن ثقافة 3D تتبلمر خلال هذه الفترة.
- يغرق ببطء الثقافات 3D في 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية.
- تأكد من أن وسائل الإعلام دافئة عند إضافته إلى الآبار لزيادة تعزيز هلام البلمرة.
- خطوة حاسمة: إضافة بلطف وسائل الإعلام على ثقافات 3D. يمكن pipetting لوسائل الإعلام بسرعة كبيرة جدا في الآبار يؤدي إلى مفرزة من الثقافات 3D من سطح زراعة الأنسجة.
3. رصد وتحليل كروي الغزو
- غزو صورة من الكروية في مصفوفة 3D المحيطة في نقطة زمنية قررت من قبل المحقق. الحصول على الصور باستخدام مجهر مقلوب مع عدسة الهدف 20X. ملاحظة: تختلف مثالية نقاط الوقت اعتمادا على خط الخلية التي يجري اختبارها. وسوف تبدأ خطوط الخلايا أكثر الغازية الخروج بهم من الكروية بعد وقت قصير من الطلاء، وبالتالي تأخذ صورة أوليةالصورة في غضون بضع ساعات بعد الطلاء. عموما، يتم أخذ الصور في 0 ساعة (بعد الطلاء)، 24 ساعة، و 48 ساعة. الغزو يخلص عادة 24 إلى 48 ساعة بعد الطلاء.
- Quantitate القدرة الغازية باستخدام برمجيات تحليل الصور مثل صورة J.
- تحليل الغزو والمسافة خلية من على حافة كروي.
- استخدام أداة رسم مستقيم بمناسبة دائرة نصف قطرها و / أو المسافة الغازية القصوى.
- انقر على زر "تحليل" في القائمة العلوية، ثم انقر فوق "القياس" لعرض قياس الطول.
- تحليل الغزو كما إجمالي المساحة الغازية خارج كروي.
- استخدام أداة رسم حر لتتبع حدود كروي و / أو المساحة الإجمالية الغازية.
- انقر على زر "تحليل" في القائمة العلوية، ثم انقر فوق "القياس" لعرض قياس المنطقة.
- استخدام البرنامج المساعد مثل أدوات إدارة ROI لخلق قياسات كومة من الصور.
- تحليل الغزو والمسافة خلية من على حافة كروي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم اختبار باستخدام مقايسة غزو كروي (الشكل 1)، فريق من خطوط الخلايا السرطانية لقدرتها على تشكيل الأجسام الشبه الكروية، فضلا عن كمية من الخروج خلية عرضت بعد زرع في مصفوفة 3D تتكون من مواد الغشاء القاعدي والنوع الأول الكولاجين (الجدول 1). هذه النتائج تثبت أنه ما كل خط الخلايا السرطانية خلق الكروية بشكل جيد، حيث خطوط الخلايا الظهارية حيازة التشكل في المختبر تميل إلى إنتاج المجاميع العادية وعلى نحو سلس. وكانت قدرة خطوط مختلفة من الخلايا لغزو في مقايسة متغيرة أيضا. خطوط الخلايا التي تم تأسيسها باعتبارها الغازية مثل 4T1، E0771، وU-87 MG أظهرت درجة عالية من الخروج كروي في الفحص. خطوط الخلايا أقل عدوانية، مثل MCF-7، BT474، وMCF10DICS.com لم تغزو، كما كان متوقعا. غير متوقع، ومع ذلك، كان عدم وجود غزو المعروضة من قبل A-431 و 357 COLO خلايا PL. مثال على بيانات عن بعض هذهيتم عرض خطوط (الشكل 2). ل4T1 وE0771 الخلايا، صدر غزو بالفعل 24 ساعة بعد تضمين الكروية في مصفوفة 3D و، لU-87 MG، بدأ الغزو مباشرة بعد الزرع في المصفوفة.
التقييم النوعي لغزو الخلوية يمكن أن تدعم مزيدا من الكميات في برنامج تحليل الصور. يتم تضمين استراتيجيتين مختلفتين لquantitating مدى الغزو (الشكل 3)، واستراتيجية مختارة يعتمد على نوع من الغزو شهد. في يماغيج، ويتم تعيين حدود المسافة الغازية أو منطقة الغازية لأول مرة باستخدام أداة السحب الخاصة بالبرنامج، وبعد ذلك يتم إنشاؤها القيم النسبية للقياسات بكسل. يمكن استيراد الصور المجهري كما كومة لتمكين الحصول على البيانات أكثر كفاءة ولكن، إذا كان ذلك، فمن المستحسن المساعد مثل أدوات إدارة ROI لتسهيل قياس كفاءة.
| الخط الخلوي | نوع السرطان | القدرة على تشكيل المجال | مقايسة الغزو | |
| 4T1 | الثديية | فأر | +++ | ++ |
| A-431 | نظيرة الجلد | الانسان | +++ | - |
| BT-474 | ثدي | الانسان | ++ | - |
| COLO 357 PL | بنكرياس | الانسان | ++ | - |
| E0771 | الثديية | فأر | +++ | +++ |
| LNCaP | البروستات | الانسان | + | - |
| MCF-7 | ثدي | الانسان | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | ثدي | الانسان | ++ | - |
| MDA-MB-231 | ثدي | الانسان | - | ؟ |
| PANC-1 | بنكرياس | الانسان | + | ++ |
| PC-3 | البروستات | الانسان | - | ؟ |
| SK-BR-3 | ثدي | الانسان | - | ؟ |
| U-87 MG | ورم أرومي | الانسان | +++ | +++ |
وسجل المجال-تشكيل وغزو خطوط مختلفة من الخلايا خطوط الخلايا اختبار وفقا لقدرتها تشكيل المجال والغزو: الجدول 1.
الشكل 1: العمل البصري لغزو فحص كروي يتم إنشاء الأجسام الشبه الكروية في قطرات من وسائل الإعلام التي تتدلى من غطاء صحن زراعة الأنسجة لمدة 72 ساعة. بعد ذلك، يتم تجميع قطرات، والكروية وtransf أخطأت إلى 4 ° C خليط من المواد الغشاء القاعدي والنوع الأول الكولاجين. بعد إعادة تعليق كروي، وpipetted الخليط اللزج في الآبار من 24 لوحة جيدا، وبعد ذلك يتم منحها مدة 30 دقيقة في 37 ° C ليصلب في ثقافة 3D. ثم يتم إضافة وسائل الاعلام الحارة للآبار. ثم يتم رصد خروج الخلية من الكروية على مر الزمن.
الشكل 2: مثال لفحص البيانات و4T1، تظهر E0771، وU-87 خلايا MG الغزو من الكروية في حين أن A-431 و MCF-7 الخلايا لا. غزو U-87 الخلايا أكثر وضوحا بعد 24 ساعة، في حين غزو الأقصى من قبل الخلايا 4T1 وE0771 يحدث في وقت لاحق. لE0771 أكثر الغازية وU-87 خطوط الخلايا MG، يظهر الخروج خلية لتعويض الزيادة في حجم كروي احظت خلاف ذلك مع خطوط أقل الغازية. شريط النطاق، 200 ميكرون.OM / ملفات / ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 3: الكميات من الغزو يمكن quantitated الغزو عن طريق تحليل صورة، على سبيل المثال باستخدام البرمجيات صورة J. (أ) حساب الغزو بوصفها وظيفة من أطول مسافة الغازية الصادرة عن كروي. (ب) المساحة الإجمالية للغزو من قبل خلايا ترك كروي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
قيمت هذه الدراسة أداء لجنة من خطوط الخلايا السرطانية في مقايسة غزو كروي (الجدول 1). عموما، نجد أن تتعزز تشكيل كروي في المزيد من خطوط الخلايا الظهارية المظهر، حيث وجود تقاطعات خلية خلية يشجع على تشكيل بنية تشبه كروي. خطوط الخلايا المعروفة التي خضعت لالانتقالية الظهارية الوسيطة، مثل MDA-MB-231 الخلايا لا تشكل الأجسام الشبه الكروية في الثقافة انخفاض شنقا على الأرجح بسبب من انخفاض E-، N-، وP-كادهيرين التعبير 16.
بعض الخطوات في مقايسة غزو كروي تتطلب الالتزام قريب من البروتوكول. ومن الأهمية بمكان أن تعمل بسرعة عندما pipetting لالغشاء القاعدي والكولاجين الخليط، وأنه من الأهمية بمكان أن واحدة تحافظ على مزيج بالقرب 4 ° C أثناء العمل لأنها سوف تبدأ في يصلب في درجة حرارة الغرفة. أيضا، الاستعدادات الكولاجين للذوبان والحمضية، وإغراؤه جل من الخاأيون كمية صغيرة من هيدروكسيد الصوديوم والملح، يليه ارتفاع درجات الحرارة إلى 37 درجة مئوية. في أيدينا، لمجرد خلط كميات متساوية من الكولاجين مع المواد الغشاء القاعدي يجعلها هلام المختصة على ارتفاع درجة حرارة لأن عنصر الغشاء القاعدي غير قادرة على تحييد الكولاجين. إذا نسب صغيرة من الغشاء القاعدي: يتم التخطيط الكولاجين، وينبغي تحييد الكولاجين قبل إضافة الطابق السفلي خليط غشاء لتسهيل البلمرة. تشكلت مرة واحدة، فإن معظم الكروية هي مقاومة للتفكك وسوف البقاء على قيد الحياة إعادة تعليق في هذا مزيج لزج من شأنها أن تشكل ثقافة 3D. خلال خطوات إعادة تعليق، يجب على المرء أيضا بذل العناية للحد من تشكيل فقاعات الهواء، وهذه يمكن أن تعيق التصوير. عند إضافة سائل الإعلام والثقافة إلى الآبار بعد أن عزز الجل، فمن المهم أن أحد pipets ببطء لمنع الثقافات 3D من فصل من الطبق.
والخروج من الخلايا السرطانية في 3D مصفوفة المحيطة جنرلذ المترابطة مع القدرة الغازية من الخطوط، حيث E0771 و U-87 خلايا MG أظهرت معظم الغزو في لوحة من خطوط الخلايا درست هنا (الشكل 2). ومن المثير للاهتمام، هذين الخطين أيضا يحمل وسائط مختلفة من الغزو. في حين أن الخلايا E0771 تغزو بطريقة تدريجية والجماعية، عرض الخلايا MG U-87 خروج الأفراد والسريع من الكروية. وبالتالي الغزو فحص كروي يسمح احدة للمقارنة بين وسائط مختلفة المستخدمة من قبل خطوط لغزو الركيزة.
يتم تقديم أساليب مختلفة لتحليل الغزو في الشكل (3) والطريقة المفضلة للتحليل قد تعتمد على طريقة الغزو. بغض النظر عن نوع من التحليل المستخدمة، وقد صمم هذا الاختبار لإتاحة الكميات السريع لغزو من عدد كبير من الكروية. تجميع الكروية في خليط الثقافة 3D، ومن ثم aliquoting هذا الخليط لإنشاء 4 الثقافات تكرار مستقلة، ويؤدي إلى establishment من الكروية المتعددة التي يمكن رصدها لحالة تجريبية معينة (الشكل 1). الفحص هو بالتالي سهولة تعديل للمقارنة إحصائية نظرا لإمكانات كبيرة "ن"، والنمط الظاهري تتقاسمها الكروية من نفس النوع ويبدو أن يحمل الحد الأدنى من التقلبات. لاحظ أن خطوط الخلايا أقل عدوانية مثل خلايا BT-474 وMCFDCIS تشكل نحو سلس، والمجالات المدمجة التي تحتوي على حجم أصغر بكثير من خطوط أكثر عدوانية. ونتيجة لذلك، خلال زرع خلايا أولية في قطرات شنقا، يحتاج عدد الخلايا بدأت تعديلها وفقا لذلك.
بعض خطوط الخلايا المتنقل أداء ضد توقعاتنا، ولم يحمل السلوك الغازية في هذا الاختبار. ومن الأمثلة البارزة على A-431 والخلايا PL COLO 357. فمن الممكن أن عدم وجود غزو عرض بهذه الخطوط ويرجع ذلك إلى نوع من ECM الركيزة التي كانت جزءا لا يتجزأ من الأجسام الشبه الكروية في. في الواقع، أظهرت آخرون أن زميله الغشاء القاعديريال (على سبيل المثال Matrigel) والكولاجين يمكن أن يكون لها آثار متباينة على غزو الخلايا 17 ربما بسبب مختلف متطلبات مصفوفة metalloprotease للهجرة 18. وبالتالي، التغيير والتبديل في نسبة الكولاجين: مواد الغشاء القاعدي هو طريقة أخرى لتعديل نتائج الفحص، حيث يقلل من عنصر المواد الغشاء القاعدي إلى ثلث الخليط الكلي، مما يسمح للزيادة في كمية الكولاجين، يمكن تعزيز غزو بعض أنواع الخلايا. ويتمثل هذه الفكرة في دراسة حديثة أن وجدت علاقة طردية بين القدرة الغازية من organoids الثديية وعدد من النوع الأول الكولاجين الألياف الحاضر، حيث تمت ترقيته تشكيل الكولاجين ليفية من خلال توسيع 4 درجات فترة C حضن مسبق من الرقم الهيدروجيني تحييد الكولاجين 19.
اكتشاف أن بعض خطوط الخلايا تصرفت خلافا للتوقعات يظهر بعض القيود المفروضة على هذا الاختبار. على الرغم من أن الغزو رصد الخلايا السرطانية من سكروي اتحاد كرة القدم في خليط 3D تتكون من مواد الكولاجين والغشاء القاعدي هو أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية من الحركة فحص 2D، فإنه لا يزال نظام نموذجي أن يغفل بعض التعقيدات البيولوجية الموجودة على خلاف ذلك في الجسم الحي. على سبيل المثال، القدرة المتنقل ويمكن عن طريق التضمين في microenvironments المتميزة التي تدعم مقابل مثلي نمو الورم خارج الرحم 20 وعلى هذا النحو، فمن المهم أن نعترف بأن مجموعة متنوعة من العوامل يمكن أن تؤثر في انسجة عميقا في عملية النقيلي. وهناك عدد من هذه العوامل غائبة في مقايسة الغزو المعروضة هنا ويمكن أن يفسر بعض التناقضات الملحوظة.
وباختصار، فإن الخلايا السرطانية غزو كروي فحص المقدمة هنا يوفر إطارا مرنا لرصد الغزو في إعداد بيولوجيا، ويدعم اكتشاف آليات غزو الخلايا، ويحتمل أن تساعد في تطوير علاجات مضادة للالنقيلي جديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
بدعم من المعاهد الوطنية للصحة منح P30 CA051008 وT32 CA009686 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
