Introduction
यह कैंसर सेल गतिशीलता इस तरह के व्यवहार संचार प्रणाली 1 में तहखाने झिल्ली और प्रवेश के माध्यम से आक्रमण की सुविधा दी है कि, मेटास्टेटिक क्षमता का भविष्य कहनेवाला है कि स्थापित है। गतिशीलता पर अधिकांश अनुसंधान यह व्यापक रूप से एक तीन आयामी (3 डी) मैट्रिक्स में कोशिकाओं के आंदोलन होगा वास्तव में कैसे ये वही कोशिकाओं के अधिक प्रतिनिधि है कि मान्यता प्राप्त होता जा रहा है, हालांकि कोशिकाओं, एक दो आयामी (2 डी) की स्थापना में कैसे व्यवहार पर ध्यान केंद्रित किया है विवो 2 में व्यवहार करते हैं। 3 डी संस्कृति सिस्टम तेजी से विकास कैनेटीक्स और दवा संवेदनशीलता से 3, सेल आकृति विज्ञान से लेकर है कि सेलुलर व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। एक 3 डी वातावरण के संदर्भ में कैंसर सेल आक्रमण की निगरानी करने की इच्छा एक 3 डी कोशिकी में इन spheroids embedding द्वारा पीछा फांसी ड्रॉप संस्कृति विधि 4, के माध्यम से 3 डी सेल समुच्चय (spheroids) की पीढ़ी से जुड़े पहले से स्थापित तकनीक के संश्लेषण के लिए प्रेरित किया मैट्रिक्स (ईमुख्यमंत्री) कोलेजन और तहखाने झिल्ली सामग्री 5 की रचना की। इस विधि को आसानी से प्रयोगात्मक स्थितियों की एक किस्म के तहत आक्रमण की तुलना करने के लिए उपयोग किया जा सकता है कि एक सुव्यवस्थित दृष्टिकोण प्रदान करके इन पहले से स्थापित तकनीक को बेहतर बनाने का प्रयास है।
इन विट्रो में सेल गतिशीलता का आकलन करने के लिए और अधिक परंपरागत तरीके खरोंच घाव परख और transwell परख 6 हैं। पूर्व परख एक 2 डी सेटिंग में सेल गतिशीलता को दर्शाया गया है, और इन विवो आक्रमण के लिए महत्वपूर्ण सुविधाओं की एक किस्म है, जैसे प्रोटीज गतिविधि 7 की इसलिए स्वतंत्र है। transwell परख अच्छी तरह से सम्मिलित करता विपरीत झिल्ली सतह पर कोशिकाओं की उपस्थिति यानी, ईसीएम substrates लेकिन, केवल एक ही पैरामीटर के साथ बेहतर मॉडल सेल आक्रमण लेपित हैं कर सकते हैं जब मापा जाता है, और सेल आक्रमण की कई बारीकियों इस तरह आसानी से नमूदार नहीं कर रहे हैं। इन तकनीकों, कैंसर सेल अंडाकार आकृति आक्रमण परख (चित्रा 1 <के विपरीत/ Strong>) केवल physiologically प्रासंगिक नहीं है कि एक सेटिंग में सेल आक्रमण की वास्तविक समय की निगरानी के लिए अनुमति देता है, लेकिन यह भी इस तरह के सामूहिक बनाम व्यक्तिगत सेल प्रवास 8 रूप में देखे जा करने के लिए महत्वपूर्ण सेल लाइन विशेष सुविधाओं, परमिट। इस विधि को भी मानक 3 डी संस्कृति के विकास assays से अधिक लाभ देता है। कोशिकाओं इस बाधा को उठा लिया है के बाद आक्रमण करने के लिए प्रोत्साहित किया जाएगा ताकि फांसी ड्रॉप विधि के माध्यम से सेलुलर समुच्चय की पीढ़ी के शुरू में, सेल आंदोलन constrains। कि बाधा उठाया है एक बार इसके अलावा, सेल निकास फिर आसानी से quantitated जा सकता है कि एक समान दिशा में आगे बढ़ना होगा।
कैंसर कोशिका spheroids assays के लिए इस्तेमाल सबसे लोकप्रिय ईसीएम सामग्री Matrigel कर रहे हैं और इनमें से प्रत्येक घटक मेटास्टेटिक व्यवहार को प्रभावित करने में महत्वपूर्ण और विशिष्ट भूमिका है जहां प्रकार मैं, कोलेजन। Matrigel Engelbreth-होल्म झुंड माउस सार्कोमा कोशिकाओं द्वारा उत्पादित प्रोटीन की एक स्रावित मिश्रण है, और baseme में समृद्ध हैऐसे laminin, entactin, और प्रकार चतुर्थ कोलेजन के रूप में 9 NT झिल्ली प्रोटीन। इस कारण से Matrigel आगे के रूप में जाना जाता है "तहखाने झिल्ली सामग्री है।" ये तहखाने झिल्ली सामग्री सेल व्यवहार 11 पर प्रभाव की एक सीमा डालती है कि कई अन्य प्रोटीन के अलावा कैंसर सेल आक्रमण 10 के दौरान आसंजन integrin के लिए आवश्यक आवश्यक ligands प्रदान करते हैं। इसकी तुलना में, आमतौर पर tendons और अन्य घने श्लेषजनउत्पादी संरचनाओं 12 की एसिड हज़म से तैयार I कोलेजन प्रकार, शरीर के संयोजी ऊतक और स्ट्रोमा समर्थन ऊतकों और अंगों का एक प्रमुख संरचनात्मक तत्व के रूप में कार्य करता है कि एक बहुत सरल मैट्रिक्स सामग्री है। यह कोलेजन की शारीरिक विशेषताओं सेल गतिशीलता की सुविधाओं की एक संख्या को नियंत्रित कर सकते हैं कि प्रदर्शन किया गया है; उदाहरण के लिए, ट्यूमर स्ट्रोमल इंटरफेस में कोलेजन तंतुओं के संरेखण स्ट्रोमा 13 में हमलावर जब बाद में उन तंतुओं के साथ विस्थापित करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं को परमिट। यहाँ प्रस्तुत परख में, दोनों प्रकार I कोलेजन और तहखाने झिल्ली सामग्री 3 डी कैंसर सेल स्ट्रोमा बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है।
कोशिकाओं 3 डी मैट्रिक्स में एम्बेडेड गया है के बाद आक्रमण नजर रखी जा सकती है कि नियंत्रण रास्ते के अवरोध या उत्तेजना का प्रभाव। प्रकोष्ठों फांसी बूंदों में या एक लंबा उपचार आक्रमण व्यवस्थित करना आवश्यक हो जाएगा, इस पर निर्भर 3D संस्कृति, करने के लिए स्थानांतरण पर विकास के दौरान pretreated जा सकता है। छोटे कद के उपचार के लिए, यह दवा संग्रह के बाद अंडाकार आकृति निलंबन, साथ ही कोशिकाओं के लिए पर्याप्त दवा जोखिम की सुविधा के लिए, 3 डी संस्कृतियों चारों ओर जाएगा कि मीडिया के साथ मिलाया जा सिफारिश की है। इसके बाद, सामान्य या ट्यूमर जुड़े stromal कोशिकाओं ट्यूमर सेल आक्रमण नियमन करने में उनकी भूमिका का मूल्यांकन करने के लिए, या कैसे पैराक्राइन और ऑटोक्राइन संकेतन प्रभावों सेल व्यवहार का निर्धारण करने के लिए मैट्रिक्स सामग्री के साथ admixed जा सकता है। यह विचार एक अध्ययन में दिखाया गया था, जहां कर्नल के cocultureकैंसर और फांसी बूंदों में endothelial कोशिकाओं पर spheroids 14 के भीतर एक संवहनी नेटवर्क का नेतृत्व किया। कैंसर सेल आक्रमण विभिन्न substrates 15 पर असर पड़ा है के रूप में अंत में, ईसीएम घटक भी, बदला जा सकता है। नीचे प्रस्तुत विधि इस प्रकार की स्थिति की एक किस्म के तहत कैंसर सेल आक्रमण का आकलन करने के लिए एक रूपरेखा प्रदान करेगा। सामान्य तौर पर यह सब सेल लाइनों फांसी बूंदों में spheroids पैदा करेगा और उपकला दिखने सेल लाइनों आम तौर पर नियमित क्षेत्रों फार्म नहीं कि पाया गया था।
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Protocol
Spheroids के 1. पीढ़ी
- एक पीबीएस का उपयोग 70% संगम ~ का पक्षपाती कैंसर सेल संस्कृतियों को हटाए द्वारा ड्रॉप संस्कृतियों फांसी के लिए एकल कोशिका निलंबन की तैयारी 0.05% trypsin EDTA के समाधान के लिए जोखिम के द्वारा पीछा धो लें।
- सेल संस्कृति मीडिया के साथ trypsin समाधान बेअसर और सेल निलंबन के एक विभाज्य का उपयोग कोशिकाओं की गिनती। नोट: सेल लाइन पर निर्भर करेगा विशेष सेल संस्कृति मीडिया का परीक्षण किया जा रहा है। सेल संस्कृति मीडिया आम तौर पर DMEM + 10% FBS है, जहां ATCC मीडिया की सिफारिशों का पालन करें। अधिक जानकारी सामग्री तालिका में पाया जा सकता है।
- सेल संस्कृति मीडिया के 20 μl ड्रॉप प्रति 500-1,000 कोशिकाओं के बोने के लिए अनुमति देने के लिए एक कमजोर पड़ने प्रदर्शन करते हैं।
- 10 सेमी पकवान मोल और नीचे करने के लिए बाँझ पीबीएस के 5 मिलीलीटर जोड़ें। नोट: यह कदम फांसी वाष्पीकरण से बूँदें सुरक्षा करता है। कम लागत वाली "bacteriological ग्रेड" व्यंजन, सेल संस्कृति ग्रेड व्यंजन के स्थान पर प्रयोग किया जा सकता है के रूप में कोशिकाओं शेष भाग नहीं होगासंस्कृति सतह काम करते हैं।
- ढक्कन के भीतरी सतह को पतला सेल निलंबन के 20 μl बूंदों के हस्तांतरण के लिए एक मल्टी चैनल pipet का प्रयोग करें।
- Pipet 40 10 सेमी डिश के ढक्कन पर (8 बूंदों की 5 पंक्तियों) चला जाता है।
- संस्कृति पकवान पर ढक्कन और जगह उलटें। Spheroids उत्पन्न करने के लिए 72 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर फांसी ड्रॉप संस्कृतियों सेते हैं।
- एक विश्वास है, अभी तक नियंत्रित तरीके से ढक्कन पलटें। नोट: बहुत तेज या बहुत धीमी गति से ढक्कन Inverting बूंदों शिफ्ट करने के कारण हो सकता है। दूसरों कॉम्पैक्ट समुच्चय का उत्पादन करने के लिए 72 से अधिक घंटे की आवश्यकता हो सकती है, जबकि कुछ सेल लाइनों, 48 घंटा या उससे कम में spheroids फार्म सकता है।
3 डी मैट्रिक्स में spheroids के 2. एम्बेडिंग
- रात भर spheroids embedding से पहले 4 डिग्री सेल्सियस पर वृद्धि कारक कम तहखाने झिल्ली सामग्री की एक विभाज्य पिघलना।
- वैकल्पिक: अग्रिम में ईसीएम साथ लेयर कुओं ऊतक cultu के साथ संभावित अंडाकार आकृति बातचीत को रोकने के लिएसतह रहे हैं।
- 24 अच्छी तरह से थाली पर अच्छी तरह से प्रति ईसीएम की pipet 200 μl।
- ईसीएम पूरे अच्छी तरह से सतह को शामिल किया गया है कि यह सुनिश्चित करने के लिए थाली झुकाएँ।
- ध्यान से एक pipet के साथ अतिरिक्त ईसीएम को हटा दें।
- 3 घंटा कमरे के तापमान पर या रात 4 डिग्री सेल्सियस पर: कुओं सूख रहे हैं जब तक थाली सेते हैं।
- वैकल्पिक: अग्रिम में ईसीएम साथ लेयर कुओं ऊतक cultu के साथ संभावित अंडाकार आकृति बातचीत को रोकने के लिएसतह रहे हैं।
- टिशू कल्चर डिश के ढक्कन झुकने और मीडिया पूलिंग से spheroids लीजिए। एक 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में spheroids के साथ मीडिया स्थानांतरण।
- Spheroids microcentrifuge ट्यूब के तल पर व्यवस्थित करने के लिए 10 मिनट की अनुमति दें। Spheroids आंखों से दिखाई जानी चाहिए।
- । ठंड (4 डिग्री सेल्सियस) के 100 μl मैं एक अलग पूर्व ठंडा ट्यूब में कोलेजन प्रकार के साथ तहखाने झिल्ली सामग्री के 100 μl मिक्स समय से पहले ही solidifying से या तो जेल को रोकने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण रखें।
- छोटी मात्रा में स्थानांतरित यदि पूर्व ठंडा pipet सुझावों का प्रयोग करें।
- जब ध्यान देमैं हवा बुलबुला गठन को रोकने के लिए तहखाने झिल्ली सामग्री और कोलेजन प्रकार मिश्रण। नोट: वे जेल में एम्बेडेड हो तो हवा के बुलबुले प्रोटोकॉल में बाद में इमेजिंग बाधा हो सकती है।
- Microcentrifuge ट्यूब के 40 μl नीचे के हिस्से से spheroids aspirate, और मैं मिश्रण कोलेजन तहखाने झिल्ली सामग्री / प्रकार के साथ गठबंधन। जब मिश्रण हवा बुलबुला बनने से रोकने के लिए सावधान रहें। नोट: समाधान 100 μl कोलेजन प्रकार मैं और spheroids के 40 μl 4 स्वतंत्र 3 डी संस्कृतियों के लिए पर्याप्त सामग्री बनाने के लिए, 100 μl तहखाने झिल्ली सामग्री युक्त। यह ऊपर पहुंचा है या नीचे जा सकता है।
- Pipet 24 अच्छी तरह से थाली पर कुओं के केन्द्रों में चिपचिपा मिश्रण के 40 μl बूँदें। अच्छी तरह के साइड में चलने से मिश्रण को रोकने के लिए प्लेट स्तर रखें। नोट: 24 अच्छी तरह से थाली पर एक एकल स्तंभ - 4 कुओं - हर हालत का परीक्षण किया जा करने के लिए सिफारिश की है।
- प्लेट पूर्णांक रखेंOA 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर और 30 मिनट तक अछूता छोड़ दें। 3 डी संस्कृति इस अवधि के दौरान भाजन जाएगा।
- धीरे धीरे सेल संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में 3 डी संस्कृतियों डूब।
- आगे जेल polymerization के बढ़ावा देने के लिए कुओं में इसे जोड़ने जब मीडिया गर्म है कि सुनिश्चित करें।
- महत्वपूर्ण कदम: धीरे 3 डी संस्कृतियों के लिए मीडिया को जोड़ने। कुओं में भी जल्दी मीडिया pipetting टिशू कल्चर सतह से 3 डी संस्कृतियों की टुकड़ी का नेतृत्व कर सकते।
3. निगरानी और उपगोल आक्रमण का विश्लेषण
- अन्वेषक द्वारा निर्णय लिया समय अंक पर आसपास के 3 डी मैट्रिक्स में spheroids से छवि आक्रमण। 20x उद्देश्य लेंस के साथ एक औंधा माइक्रोस्कोप का उपयोग तस्वीरों मोल। नोट: आदर्श समय अंक परीक्षण किया जा रहा सेल लाइन के आधार पर अलग होगा। अधिक आक्रामक सेल लाइनों शीघ्र ही चढ़ाना के बाद spheroids से उनके बाहर निकलना शुरू हो और इसलिए, प्रारंभिक फोटोग्राफ ले जाएगाचढ़ाना के बाद कुछ घंटों के भीतर है। आम तौर पर, फोटोग्राफ (चढ़ाना के बाद) 0 घंटा, 24 घंटा, 48 घंटा में लिया जाता है। आक्रमण आम तौर पर चढ़ाना के बाद 24 घंटा 48 को समाप्त।
- छवि जे तरह छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग आक्रामक क्षमता quantitate
- अंडाकार आकृति के किनारे से सेल दूरी के रूप में आक्रमण का विश्लेषण करें।
- त्रिज्या और / या अधिक से अधिक आक्रामक दूरी चिह्नित करने के लिए सीधे आकर्षित उपकरण का उपयोग करें।
- लंबाई माप प्रदर्शित करने के लिए "उपाय" शीर्ष मेनू में "विश्लेषण", और उसके बाद क्लिक करें।
- अंडाकार आकृति के बाहर कुल आक्रामक क्षेत्र के रूप में आक्रमण का विश्लेषण करें।
- अंडाकार आकृति और / या कुल आक्रामक क्षेत्र की सीमा का पता लगाने के लिए मुक्तहस्त आकर्षित उपकरण का प्रयोग करें।
- क्षेत्र माप प्रदर्शित करने के लिए "उपाय" शीर्ष मेनू में "विश्लेषण", और उसके बाद क्लिक करें।
- छवियों का एक ढेर के लिए माप बनाने के लिए आरओआई प्रबंधक उपकरण की तरह एक प्लगइन का उपयोग करें।
- अंडाकार आकृति के किनारे से सेल दूरी के रूप में आक्रमण का विश्लेषण करें।
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Representative Results
अंडाकार आकृति आक्रमण परख का प्रयोग (चित्रा 1), कैंसर कोशिका लाइनों के एक पैनल, साथ ही तहखाने झिल्ली सामग्री और टाइप I कोलेजन से मिलकर एक 3 डी मैट्रिक्स में आरोपण के बाद प्रदर्शित सेल निकास की राशि के लिए spheroids फार्म के लिए उनकी क्षमता के लिए परीक्षण किया गया था (1 टेबल)। इन परिणामों के हर कैंसर कोशिका लाइन इन विट्रो में एक उपकला आकृति विज्ञान रखने सेल लाइनों नियमित रूप से और चिकनी समुच्चय उत्पन्न हो जाया जहां अच्छी तरह से बनाई spheroids, पैदा करेगा न कि प्रदर्शित करता है। परख में आक्रमण करने के लिए अलग सेल लाइनों की क्षमता भी चर रहा था। 4T1, E0771, और यू-87 एमजी की तरह आक्रामक होने के रूप में स्थापित कर रहे हैं कि सेल लाइनों परख में अंडाकार आकृति निकास के एक उच्च डिग्री का प्रदर्शन किया। प्रत्याशित था के रूप में कम आक्रामक सेल लाइनों, एमसीएफ-7 की तरह, BT474, और MCF10DICS.com, पर आक्रमण नहीं किया। अप्रत्याशित है, तथापि, ए 431 और Colo 357 पीएल कोशिकाओं द्वारा प्रदर्शित आक्रमण की कमी थी। इनमें से कुछ के लिए डेटा का एक उदाहरणलाइनों (चित्रा 2) दिखाया गया है। 4T1 और E0771 कोशिकाओं के लिए, आक्रमण के पहले से ही आक्रमण मैट्रिक्स में आरोपण के बाद सीधे शुरू किया, यू-87 एमजी के लिए, 3 डी मैट्रिक्स में spheroids एम्बेड करने के बाद 24 घंटे में घोषित किया गया था।
सेलुलर आक्रमण के गुणात्मक मूल्यांकन आगे छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर में quantitation के द्वारा समर्थित किया जा सकता है। आक्रमण की हद quantitating के लिए दो अलग अलग रणनीतियों (चित्रा 3) शामिल किए गए हैं, और चयनित रणनीति आक्रमण के प्रकार के गवाह पर निर्भर करता है। ImageJ में, आक्रामक दूरी या आक्रामक क्षेत्र पहले तुलनात्मक मूल्यों पिक्सेल माप के रूप में उत्पन्न कर रहे हैं, जिसके बाद सॉफ्टवेयर के ड्रॉ के उपकरण का उपयोग कर सीमांकन है। माइक्रोस्कोपी छवियों ऐसा करने हैं, तो आरओआई प्रबंधक उपकरण की तरह एक प्लगइन कुशल मापने की सुविधा के लिए सिफारिश की है, और अधिक कुशल डाटा अधिग्रहण सक्षम करने के लिए एक ढेर के रूप में आयात किया लेकिन जा सकता है।
| कोशिका की परत | कैंसर के प्रकार | स्फीयर बनाने की क्षमता | परख आक्रमण | |
| 4T1 | स्तन | माउस | +++ | ++ |
| एक-431 | बाह्यत्वचाभ | मानव | +++ | - |
| बीटी-474 | स्तन | मानव | ++ | - |
| COLO 357 पीएल | अग्न्याशय | मानव | ++ | - |
| E0771 | स्तन | माउस | +++ | +++ |
| LNCaP | प्रोस्टेट | मानव | + | - |
| MCF 7 | स्तन | मानव | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | स्तन | मानव | ++ | - |
| एमडीए MB-231 | स्तन | मानव | - | ? |
| Panc-1 | अग्न्याशय | मानव | + | ++ |
| पीसी -3 | प्रोस्टेट | मानव | - | ? |
| एसके-बीआर -3 | स्तन | मानव | - | ? |
| अंडर 87 एमजी | ग्लयोब्लास्टोमा | मानव | +++ | +++ |
तालिका 1:। परीक्षण किया अलग सेल लाइनों से क्षेत्रः-गठन और आक्रमण सेल लाइनों अपने क्षेत्र के गठन की क्षमता और आक्रमण के अनुसार रन बनाए हैं।
चित्रा 1:। अंडाकार आकृति आक्रमण परख के दृश्य कार्यप्रवाह Spheroids 72 घंटे के लिए एक टिशू कल्चर डिश के ढक्कन से लटका है कि मीडिया की बूंदों में उत्पन्न कर रहे हैं। इसके बाद, बूंदों जमा कर रहे हैं, और spheroids स्ि्न्ंतरर हैं तहखाने झिल्ली सामग्री और मैं कोलेजन प्रकार की एक 4 डिग्री सेल्सियस मिश्रण करने के लिए गलती की। अंडाकार आकृति मेजबान के बाद, चिपचिपा मिश्रण यह एक 3 डी संस्कृति में जमना करने के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए दिया जाता है, जिसके बाद एक 24 अच्छी तरह से थाली, के कुओं में pipetted है। गर्म मीडिया तो कुओं में जोड़ा जाता है। Spheroids से सेल से बाहर निकलें तो समय के साथ नजर रखी है।
चित्रा 2:। ए -431 और MCF 7 कोशिकाओं नहीं करते जबकि परख डेटा का उदाहरण 4T1, E0771, और यू-87 एमजी कोशिकाओं spheroids से आक्रमण दिखा। 4T1 और E0771 कोशिकाओं द्वारा अधिक से अधिक आक्रमण बाद में होता है, जबकि अंडर 87 कोशिकाओं के आक्रमण सबसे अधिक है, 24 घंटे के बाद घोषणा की है। सबसे आक्रामक E0771 और यू-87 एमजी सेल लाइनों के लिए, सेल निकास अन्यथा कम आक्रामक लाइनों के साथ मनाया अंडाकार आकृति आकार में वृद्धि की भरपाई के लिए प्रकट होता है। स्केल बार, 200 माइक्रोन।ओम / फ़ाइलें / ftp_upload / 53,409 / 53409fig2large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3:। आक्रमण के quantitation आक्रमण जैसे छवि जम्मू सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, छवि विश्लेषण द्वारा quantitated जा सकता है। अंडाकार आकृति से चलाई सबसे लंबे समय तक आक्रामक दूरी के एक समारोह के रूप में आक्रमण (क) गणना। (ख) अंडाकार आकृति छोड़ने कोशिकाओं द्वारा हमला कुल क्षेत्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
इस अध्ययन में एक अंडाकार आकृति आक्रमण परख (तालिका 1) में कैंसर कोशिका लाइनों के एक पैनल के प्रदर्शन का मूल्यांकन किया। आम तौर पर, हम अंडाकार आकृति गठन सेल सेल जंक्शनों की उपस्थिति एक अंडाकार आकृति की तरह वास्तुकला के गठन को बढ़ावा जहां अधिक उपकला दिखने सेल लाइनों में बढ़ाया है कि लगता है। एमडीए MB-231 कोशिकाओं की तरह एक उपकला-mesenchymal संक्रमण आया है कि ज्ञात सेल लाइनों की वजह से उनके कम ई, एन, और पी-cadherin अभिव्यक्ति 16 की संभावना सबसे ज्यादा फांसी ड्रॉप संस्कृति में spheroids फार्म नहीं है।
अंडाकार आकृति आक्रमण परख में कदम से कुछ प्रोटोकॉल के करीब पालन की आवश्यकता होती है। यह तहखाने झिल्ली और कोलेजन मिश्रण pipetting जब तेजी से काम करने के लिए पूरी तरह से गंभीर है, और यह एक यह कमरे के तापमान पर जमना शुरू हो जाएगा के रूप में काम कर रहा है, जबकि 4 डिग्री सेल्सियस के पास मिश्रण रहता है कि महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, घुलनशील कोलेजन की तैयारी अम्लीय रहे हैं, और addit द्वारा जेल करने के लिए प्रेरित कर रहे हैंसोडियम हाइड्रोक्साइड और नमक की एक छोटी राशि के आयन, 37 डिग्री सेल्सियस तक वार्मिंग द्वारा पीछा किया। हमारे हाथ में, बस तहखाने झिल्ली सामग्री के साथ कोलेजन की बराबर मात्रा मिश्रण तहखाने झिल्ली घटक कोलेजन को बेअसर करने में सक्षम है क्योंकि वार्मिंग पर यह जेल सक्षम बना देता है। छोटे तहखाने झिल्ली का अनुपात है: कोलेजन की योजना बनाई है, कोलेजन polymerization की सुविधा के लिए तहखाने झिल्ली मिश्रण को जोड़ने के लिए पहले निष्प्रभावी किया जाना चाहिए। एक बार का गठन, सबसे spheroids हदबंदी के लिए प्रतिरोधी रहे हैं और 3 डी संस्कृति समावेश होगा कि यह चिपचिपा मिश्रण में मेजबान बच जाएगा। इन इमेजिंग में बाधा के रूप में मेजबान चरणों के दौरान, एक भी, हवा के बुलबुले के गठन को प्रतिबंधित करने के लिए देखभाल खींचना चाहिए। जेल जम गया है के बाद कुओं के लिए संस्कृति मीडिया जोड़ने, यह धीरे धीरे एक pipets पकवान से अलग करने से 3 डी संस्कृतियों को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है।
आसपास के 3 डी मैट्रिक्स में कैंसर कोशिकाओं के निकास generall हैY E0771 और यू-87 एमजी कोशिकाओं यहाँ की जांच सेल लाइनों (चित्रा 2) के पैनल में सबसे आक्रमण का प्रदर्शन किया, जहां लाइनों की आक्रामक क्षमता के साथ सहसंबद्ध। दिलचस्प बात यह है कि इन दो लाइनों को भी आक्रमण के विभिन्न साधनों दिखा रहे हैं। E0771 कोशिकाओं को एक क्रमिक और सामूहिक तरीके से आक्रमण जबकि, अंडर 87 एमजी कोशिकाओं spheroids से अलग-अलग और तेजी से बाहर निकलने के प्रदर्शित करते हैं। अंडाकार आकृति आक्रमण परख इस प्रकार एक सब्सट्रेट पर आक्रमण करने के लिए लाइनों द्वारा इस्तेमाल के लिए अलग प्रकार की तुलना करने की अनुमति देता है।
आक्रमण का विश्लेषण करने के विभिन्न तरीकों चित्रा 3 में प्रस्तुत कर रहे हैं और विश्लेषण के पसंदीदा तरीके से आक्रमण के मोड पर निर्भर हो सकता है। भले ही विश्लेषण कार्यरत हैं के प्रकार, इस परख spheroids की एक बड़ी संख्या के बाहर आक्रमण का तेजी से quantitation के लिए अनुमति देने के लिए डिजाइन किया गया था। और फिर, 4 स्वतंत्र दोहराने संस्कृतियों बनाने के लिए इस मिश्रण aliquoting एक 3 डी संस्कृति मिश्रण में spheroids के पूलिंग establi करने के लिए सुरागएक दिया प्रयोगात्मक हालत (चित्रा 1) के लिए नजर रखी जा सकता है कि कई spheroids के shment। परख ", एन" की वजह से बड़ी क्षमता के लिए इसलिए सांख्यिकीय तुलना करने के लिए आसानी सुधारने योग्य है और एक ही प्रकार की spheroids द्वारा साझा फेनोटाइप न्यूनतम परिवर्तनशीलता प्रदर्शन करने के लिए लगता है। बीटी 474 और MCFDCIS कोशिकाओं की तरह कम आक्रामक सेल लाइनों और अधिक आक्रामक लाइनों की तुलना में एक बहुत छोटे आकार है कि चिकनी, कॉम्पैक्ट क्षेत्रों है कि फार्म पर ध्यान दें। एक परिणाम के रूप में, फांसी बूंदों में प्रारंभिक सेल बोने के दौरान शुरू सेल नंबर के हिसाब से समायोजित करने की जरूरत है।
कुछ मेटास्टेटिक सेल लाइनों हमारी उम्मीदों के खिलाफ प्रदर्शन किया और इस परख में आक्रामक व्यवहार का प्रदर्शन नहीं किया था। उल्लेखनीय उदाहरण एक-431 और Colo 357 पीएल कोशिकाओं में शामिल हैं। यह कारण spheroids में एम्बेडेड थे कि ईसीएम सब्सट्रेट के प्रकार से इन पंक्तियों के द्वारा प्रदर्शित आक्रमण की कमी है कि संभव है। दरअसल, दूसरों कि तहखाने झिल्ली दोस्त से पता चला हैरियाल (जैसे Matrigel) और कोलेजन पलायन 18 के लिए अलग मैट्रिक्स Metalloprotease आवश्यकताओं के लिए शायद वजह से कोशिकाओं 17 के आक्रमण पर असमान प्रभाव हो सकता है। इस प्रकार, कोलेजन के अनुपात tweaking: तहखाने झिल्ली सामग्री परख परिणामों को संशोधित करने के लिए एक और रास्ता है, जहां आगे से आक्रमण में वृद्धि कर सकता है, जिससे, कुल मिश्रण का एक तिहाई तक तहखाने झिल्ली सामग्री घटक को कम करने कोलेजन की राशि में वृद्धि के लिए अनुमति देता है कुछ प्रकार की कोशिकाओं। यह विचार कोलेजन तंतु गठन कोलेजन 19 निष्प्रभावी पीएच के 4 डिग्री सेल्सियस preincubation अवधि का विस्तार से पदोन्नत किया गया था, जहां मैं उपस्थित कोलेजन तंतुओं स्तन organoids की आक्रामक क्षमता और प्रकार की संख्या के बीच एक सकारात्मक संबंध पाया गया है कि हाल ही में एक अध्ययन में उदाहरण है।
कुछ सेल लाइनों उम्मीद के विपरीत काम किया है कि खोज इस परख की सीमाओं से कुछ पता चलता है। ओ बाहर निगरानी कैंसर सेल आक्रमण यद्यपिएफए अधिक physiologically प्रासंगिक एक 2 डी गतिशीलता परख की तुलना में है, इसे अन्यथा विवो में पाया कुछ जैविक जटिलताओं को छोड़ देता है कि एक मॉडल प्रणाली अभी भी है कोलेजन और तहखाने झिल्ली सामग्री से मिलकर एक 3 डी मिश्रण में अंडाकार आकृति। उदाहरण के लिए, मेटास्टेटिक क्षमता जैसे, यह स्ट्रोमल कारकों की एक किस्म गहराई से मेटास्टेटिक प्रक्रिया को प्रभावित कर सकते हैं स्वीकार करने के लिए महत्वपूर्ण है, ओर्थोटोपिक बनाम अस्थानिक ट्यूमर के विकास को 20 का समर्थन करने वाले अलग microenvironments द्वारा संग्राहक किया जा सकता है। इन कारकों में से एक नंबर यहाँ प्रस्तुत आक्रमण परख में अनुपस्थित रहे हैं और मनाया विसंगतियों के कुछ समझा सकता है।
सारांश में, यहाँ प्रस्तुत कैंसर सेल अंडाकार आकृति आक्रमण परख एक जैविक रूप से प्रासंगिक सेटिंग में आक्रमण की निगरानी के लिए एक लचीला ढांचा, सेल आक्रमण के तंत्र की खोज का समर्थन करता है प्रदान करता है, और संभावित उपन्यास विरोधी मेटास्टेटिक उपचारों के विकास में सहायता कर सकते हैं।
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Acknowledgments
एनआईएच अनुदान P30 CA051008 और T32 CA009686 (एटीआर) द्वारा समर्थित है।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
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