Introduction
Det er fastslått at kreftcelle motilitet er prediktiv for metastatisk potensial, gitt at en slik oppførsel muliggjør invasjon gjennom basalmembranen, og komme inn i sirkulasjonssystemet 1. Mesteparten av forskningen på motiliteten har fokusert på hvordan cellene oppfører seg på en to-dimensjonal (2D) innstilling, selv om det er å bli anerkjent at bevegelsen av celler i en tre-dimensjonal (3D) matrise er mer representativt for hvordan de samme cellene faktisk vil oppføre in vivo to. 3D-kultur-systemer blir stadig mer brukt til å studere cellulære atferd som spenner fra cellemorfologi, til vekstkinetikk og narkotika følsomhet tre. Ønsket om å overvåke cancercelle invasjon innenfor rammen av en 3D-miljø har ført til syntese av tidligere etablerte teknikker som involverer dannelsen av 3D-celleaggregater (sfæroider) via den hengende dråpe dyrkningsmetode 4, etterfulgt av nedgraving av disse kuler inn i et 3D-ekstracellulære matrise (ECM) består av kollagen og kjeller membranmaterialer 5. Denne metoden søker å bedre på disse tidligere etablerte teknikker ved å tilveiebringe en strømlinjeformet måte som enkelt kan benyttes til å sammenligne invasjon under forskjellige eksperimentelle betingelser.
Mer tradisjonelle måter å vurdere cellemotilitet in vitro er ripe sår analyse og transwell analysen 6. Den tidligere analysen viser celle motilitet i et 2D-innstilling, og er derfor uavhengig av en rekke funksjoner kritiske for in vivo invasjon, f.eks proteaseaktivitet 7. Transwell Analysen kan bedre modell celle invasjon når brønn innsatsene er belagt med ECM-substrater, men, bare en enkelt parameter, dvs. opptreden av celler på den motsatte membranoverflaten blir målt, og mange nyanser av celle invasjon er således ikke lett observerbar. I motsetning til disse teknikker, kreftcellen sfæroide invasjon analysen (figur 1 </ strong>) åpner for sanntids overvåking av celle invasjon i en setting som ikke bare er fysiologisk relevant, men også tillater viktige cellelinje-spesifikke funksjoner som skal visualiseres, for eksempel individuell vs kollektiv celle migrasjon 8. Denne metoden gir også fordeler i forhold til vanlige 3D-kultur vekst analyser. Generering av cellulære aggregater via hengende slipp-metoden i utgangspunktet begrenser celle bevegelse, slik at cellene vil bli incentivised å invadere etter denne begrensningen er opphevet. Videre, når denne begrensningen er løftet, vil celle utgang gå frem på en uniform retning som deretter kan hensiktsmessig kvantifiseres.
De mest populære ECM materialer som brukes for kreftcelle sfæroider analyser er Matrigel og type I kollagen, hvor hver av disse komponentene har viktige og distinkte roller i å påvirke metastatiske adferd. Matrigel er et utskilt blanding av proteiner som produseres av Engelbreth-Holm sverm mus sarkomceller, og er anriket på basement membranproteiner slik som laminin, entactin, og type IV kollagen 9. Av denne grunn Matrigel blir heretter referert til som "basalmembranmaterialer." Disse basalmembranmaterialer gi viktige ligandene som trengs for integrin adhesjon i løpet av kreftcelle invasjon 10 i tillegg til mange andre proteiner som utøver en rekke effekter på celle-adferd 11. Til sammenligning, type I kollagen, som vanligvis fremstilles fra syre oppsummeringer av sener og andre tette kollagenstrukturer 12, er en mye enklere matrisemateriale som fungerer som en viktig strukturelement av bindevev og stromaceller støtte vev og organer i kroppen. Det har vist seg at de fysikalske egenskapene til kollagen kan regulere en rekke funksjoner i celle motilitet; for eksempel justering av kollagen fibriller ved tumor-stromal grensesnitt tillater kreftceller til senere å migrere langs disse fibriller når invadere inn i stroma 13. I analysen som presenteres her, både type I kollagen og basalmembran materialer er brukt som verktøy for å studere 3D kreftcelle-stroma interaksjoner.
Virkningen av inhibering eller stimulering av baner som kontrollerer invasjon kan overvåkes etter at cellene er blitt innleiret i 3D-matrisen. Celler kan være forbehandlet under vekst i de hengende dråper eller ved overføring til 3D-kultur, avhengig av om en langvarig behandling vil være nødvendig for å modulere invasjon. For kortere behandlinger, er det anbefalt at medikamentet blandes med den sfæroide suspensjonen etter innsamling, samt medier som vil omgi 3D-kulturer, for å legge til rette for tilstrekkelig eksponering for legemidlet til cellene. Deretter kan normal eller tumorassosierte stromale celler blandes med grunnmassematerialet for å evaluere deres rolle ved modulering av tumorcelle invasjon, eller for å avgjøre hvordan parakrine og autokrine signale påvirker celleadferd. Denne ideen ble vist i en studie hvor coculture av colpå kreft og endotelceller i hengende dråper førte til en vaskulær nettverk innen sfæroidene 14. Endelig kan ECM bestanddeler også bli endret, som kreftcelle-invasjon påvirket av forskjellige underlag 15. Fremgangsmåten som presenteres nedenfor vil således gi en ramme for vurdering av kreftcelle invasjon under en rekke forskjellige forhold. Generelt ble det funnet at ikke alle cellelinjer vil skape kuler i de hengende dråper og epiteliale utseende cellelinjer vanligvis danne vanlige kuler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. generasjon Spheroids
- Forbered enkeltcellesuspensjon for hengende dråpe kulturer ved å koble kreft adherente cellekulturer fra ~ 70% konfluens ved hjelp av en PBS-vask, etterfulgt av eksponering til 0,05% trypsin-EDTA-oppløsning.
- Nøytralisere trypsin-løsning med cellekulturmedium og tell cellene ved hjelp av en alikvot av cellesuspensjonen. Merk: Den spesifikke cellekulturmedier vil være avhengig av cellelinjen som skal testes. Følg ATCC anbefalinger medier, der cellekulturmedium er typisk DMEM + 10% FBS. Mer informasjon finner du i Materials tabell.
- Foreta en fortynning for å tillate for såing av 500-1000 celler per 20 mikroliter dråpe av cellekulturmedier.
- Erverve 10 cm tallerken og tilsett 5 ml steril PBS til bunnen. Merk: Dette trinnet beskytter hengende dråper fra fordampning. Lavere kostnad "bakteriologiske grade" retter kan brukes i stedet for cellekulturkvalitet retter, som celler vil ikke fortsopptre kulturoverflaten.
- Bruke en flerkanals pipette for å overføre 20 ul dråper av den fortynnede cellesuspensjon til den indre overflate av lokket.
- Pipet 40 dråper (5 rader med 8 dråper) på lokket på 10 cm parabolen.
- Snu lokket og legg over dyrkningsskålen. Inkuber hengende dråpe kulturene ved 37 ° C i 72 timer for å generere kuler.
- Flip lokket i en trygg, men likevel kontrollert måte. Merk: Invertere lokket for fort eller for sakte kan føre dråpene å skifte. Noen cellelinjer kan danne kuler i 48 timer eller mindre, mens andre kan kreve mer enn 72 timer for å fremstille kompakte aggregater.
2. Inkludering av Spheroids til 3D Matrix
- Tine en delmengde av vekstfaktor-reduserte basalmembranmaterialer ved 4 ° C over natten før innstøping sfæroidene.
- Valgfritt: Layer brønner med ECM på forhånd for å unngå potensielle spheroid interaksjon med vevet Culture overflaten.
- Pipettér 200 ul ECM per brønn på en 24-brønns plate.
- Vippe platen for å sikre at ECM dekker hele brønnoverflaten.
- Fjern forsiktig overflødig ECM med en pipette.
- Inkuber platen til brønnene er tørre: 3 timer ved romtemperatur eller over natten ved 4 ° C.
- Valgfritt: Layer brønner med ECM på forhånd for å unngå potensielle spheroid interaksjon med vevet Culture overflaten.
- Samle kuler ved å vippe lokket på vevskulturskål og pooling media. Overfør media med kulene inn i en 1,5 ml mikro tube.
- Tillat 10 min for kulene synke til bunnen av mikrosentrifugerør. Spheroids skal være synlig ved øyet.
- Bland 100 ul kjellermembranmaterialer med 100 ul kald (4 ° C) type I kollagen i et separat på forhånd avkjølt rør. Hold blandingen ved 4 ° C for å forhindre enten gel fra størkner for tidlig.
- Bruk pre-avkjølte pipette tips om overføring av små volumer.
- Gi omsorg nårblande kjelleren membranmaterialer og kollagen type I for å hindre luftbobledannelse. Merk: Luftbobler kan hindre bildebehandling senere i protokollen hvis de blir innebygd i gel.
- Aspireres sfæroidene fra 40 ul bunndelen av mikrosentrifugerør, og kombinere med basalmembranmaterialer / type I kollagen blanding. Vær forsiktig for å hindre luftbobledannelse ved blanding. Merk: oppløsning inneholdende 100 pl basalmembranmaterialer, 100 pl kollagen type I, og 40 ul av kulene vil skape nok materiale til 4 uavhengige 3D-kulturer. Dette kan skaleres opp eller ned.
- Pipetter 40 pl dråper av den viskøse blandingen i sentrene av brønnene på en 24-brønns plate. Hold plate nivå for å hindre blandingen fra å gå inn i siden av brønnen. Merk: En enkelt kolonne på 24-brønns plate - 4 brønner - anbefales for hver tilstand som skal testes.
- Sett platen into en 37 ° C inkubator og la i ro i 30 min. 3D-kultur vil polymerisere i løpet av denne perioden.
- Sakte senk 3D-kulturene i 1 ml av cellekulturmedier.
- Sørg for at media er varm når du legger det inn i brønnene for å fremme gel polymerisasjon.
- KRITISK STEP: legge til medie forsiktig til 3D kulturer. Pipettering av mediet for fort inn i brønnene kan føre til løsgjøring av 3D kulturer fra vevskultur overflaten.
3. Overvåkning og analysere spheroid Invasion
- Bilde invasjon fra kulene i det omkringliggende 3D matrix på tidspunkter besluttet av utprøver. Erverve fotografier ved hjelp av en invertert mikroskop med 20x objektiv. Merk: Ideal tidspunkter vil variere avhengig av cellelinjen blir testet. Mer invasive cellelinjer vil begynne sin utgang fra kulene kort tid etter plating, og derfor ta første bildes innen et par timer etter plating. Vanligvis er fotografier tatt ved 0 timer (etter plating), 24 timer og 48 timer. Invasion konkluderer vanligvis 24-48 timer etter plating.
- Kvantifisere invasiv evne å bruke bildeanalyse programvare som bilde J.
- Analyser invasjon som cellen avstanden fra kanten av spheroid.
- Bruk Straight Draw Tool for å markere radius og / eller maksimal invasiv avstand.
- Klikk på "Analyze" i toppmenyen, og klikk deretter på "tiltak" for å vise lengdemåling.
- Analyser invasjon som det totale invasiv området utenfor den sfæroide.
- Bruk frihåndstegneverktøyet til å spore grensen av spheroid og / eller total invasiv området.
- Klikk på "Analyze" i toppmenyen, og klikk deretter på "Mål" for å vise arealmåling.
- Bruk en plugin som ROI manager Verktøy for å lage målinger for en bunke bilder.
- Analyser invasjon som cellen avstanden fra kanten av spheroid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjelp av den sfæroide invasjon analysen (figur 1), et panel av kreftcellelinjer ble testet for deres evne til å danne kulene, så vel som for mengden av cellen utgå oppviste etter implantering i en 3D-matrise bestående av basalmembranmaterialer og type I-kollagen (tabell 1). Disse resultatene viser at ikke alle cancercellelinje vil skape velformede kuler, hvor cellelinjer som innehar en epitelial morfologi in vitro hadde tendens til å produsere jevne og glatte aggregater. Evnen til forskjellige cellelinjer for å invadere i analysen var også variabel. Cellelinjer som er etablert som invaderende som 4T1, E0771, og U-87 MG viste en høy grad av spheroid egress i analysen. Mindre aggressive cellelinjer, som MCF-7, BT474, og MCF10DICS.com ikke invadere, som var forventet. Uventet, var imidlertid mangelen på invasjonen vises av A-431 og COLO 357 PL celler. Et eksempel på data for noen av disselinjer er vist (figur 2). For 4T1 celler og E0771, ble invasjon allerede uttalt 24 timer etter innstøping sfæroidene på 3D-matrisen, og for U-87 MG, invasjon påbegynt rett etter implantasjon i matrisen.
Den kvalitativ vurdering av cellulær invasjon kan bli ytterligere støttet av kvantifisering i bildeanalyse programvare. To forskjellige strategier for å kvantifisere graden av invasjonen er inkludert (figur 3), og strategien er valgt avhengig av hvilken type av invasjonen sett. I ImageJ er invasiv avstand eller invasiv område først avgrenset ved hjelp av programvaren uavgjort verktøy, etter som komparative verdier blir generert som pixel målinger. Mikroskopi bilder kan importeres som en stabel for å muliggjøre en mer effektiv datainnsamling, men hvis du gjør det, er en plugin som ROI manager Tools anbefales å legge til rette for effektiv måling.
| Cellelinje | Kreft Type | Sphere-Forming Ability | Analysen Invasion | |
| 4T1 | Melke | Mus | +++ | ++ |
| A-431 | Epidermoid | Menneskelig | +++ | - |
| BT-474 | Bryst | Menneskelig | ++ | - |
| COLO 357 PL | Pancreas | Menneskelig | ++ | - |
| E0771 | Melke | Mus | +++ | +++ |
| LNCaP | Prostata | Menneskelig | + | - |
| MCF-7 | Bryst | Menneskelig | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | Bryst | Menneskelig | ++ | - |
| MDA-MB-231 | Bryst | Menneskelig | - | ? |
| PANC-en | Pancreas | Menneskelig | + | ++ |
| PC-3 | Prostata | Menneskelig | - | ? |
| SK-BR-3 | Bryst | Menneskelig | - | ? |
| U-87 MG | Glioblastom | Menneskelig | +++ | +++ |
Tabell 1:. Sphere-dannelse og invasjon av forskjellige cellelinjer Cellelinjer som ble testet er avsluttet i henhold til deres sfære-dannende evne og invasjon.
Figur 1: Visuell arbeidsflyt av den sfæroide invasjon analysen Spheroids genereres i dråper av media som henger fra lokket til en vevskulturskål i 72 timer.. Deretter blir de dråper samles, og sfæroidene er Overf feilet til et 4 ° C blanding av basalmembranmaterialer og type I kollagen. Etter resuspensjon sfæroid, blir den viskøse blandingen pipettert inn i brønnene til en 24-brønns plate, hvoretter det er gitt 30 minutter ved 37 ° C for å størkne til en 3D-kultur. Varme media blir deretter tilsatt til brønnene. Celle utgang fra kulene blir deretter overvåket over tid.
Fig. 2: Eksempel på analysedata 4T1, E0771, og U-87 MG-celler viser invasjon fra kulene mens A-431 og MCF-7 celler gjør det ikke. Invasjon av U-87-celler er mest uttalt etter 24 timer, mens maksimal invasjon av 4T1 celler og E0771 oppstår senere. For den mest invasive E0771 og U-87 MG-cellelinjer, synes celle utgang for å kompensere for økningen i sfæroide størrelse ellers observert med mindre invasive linjer. Scale bar, 200 mikrometer.om / filer / ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3:. Kvantifisering av invasjon invasjon kan kvantifiseres ved bildeanalyse, for eksempel ved hjelp av Image J programvare. (a) Beregning av invasjon som en funksjon av den lengste avstanden invasive som kommer fra den sfæroide. (b) Totalt areal invadert av celler forlater spheroid. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne studien evaluerte ytelsen til et panel av kreftcellelinjer i en sfæroide invasjon analysen (tabell 1). Generelt finner vi at sfæroid dannelsen forsterkes i de mer epiteliale utseende cellelinjer, hvor tilstedeværelsen av celle-celle kryss fremmer dannelsen av en sfæroide-lignende arkitektur. Kjente cellelinjer som har gjennomgått en epitelial-mesenchymale overgang, som MDA-MB-231-celler danner ikke sfæroidene i hengende dråpe kulturen mest sannsynlig på grunn av deres reduserte E-, N- og P-cadherin ekspresjon 16.
Noen av trinnene i spheroid invasjonen analysen krever tett tilslutning til protokollen. Det er helt avgjørende for å arbeide raskt når pipettering av basalmembran og kollagen-blanding, og det er viktig at man holder blandingen i nærheten av 4 ° C, mens fungerer som det vil begynne å stivne ved romtemperatur. Også, løselig kollagen forberedelser er sure, og blir overtalt til gel ved addition av en liten mengde natrium-hydroksyd og salt, etterfulgt av oppvarming til 37 ° C. I våre hender ganske enkelt å blande like volumer av kollagen med basalmembranmaterialer gjør det gel-kompetente ved oppvarming på grunn av basalmembran-komponent er i stand til å nøytralisere kollagen. Dersom mindre forhold av basalmembran: kollagen er planlagt, bør kollagen nøytraliseres før tilsetning av basalmembranen blandingen for å lette polymeriseringen. Straks de var dannet, de fleste sfæroider er motstandsdyktig mot dissosiasjon og vil overleve resuspensjon i denne viskøs blanding som omfatter 3D-kulturen. Under resuspensjon skritt, må man også øve seg til å begrense dannelsen av luftbobler, da disse kan hindre bildebehandling. Ved tilsetting kulturmedier til brønnene etter at gelen har stivnet, er det viktig at man pipetter langsomt for å hindre at 3D-kulturene løsner fra fatet.
Den utslipp av kreftceller i den omgivende 3D-matrisen er generally korrelert med invasiv evnen av linjene, hvor E0771 og U-87 MG-celler demonstrerte det mest invasjon i panelet av cellelinjene som ble undersøkt her (Figur 2). Interessant nok har disse to linjene også oppvise forskjellige moduser av invasjon. Mens E0771 celler invadere i en gradvis og kollektiv måte, U-87 MG celler vise individuelle og rask exit fra kulene. Den sfæroide invasjonen analysen tillater således en å sammenligne de forskjellige modi brukes av linjer for å invadere substratet.
Ulike metoder for å analysere invasjon er presentert i figur 3, og den foretrukne måte for analyse kan avhenge av fremgangsmåten for invasjonen. Uavhengig av den type analyse som anvendes, er denne analysen er utformet for å muliggjøre hurtig kvantifisering av invasjon av et stort antall sfæroider. Kontinuitets sfæroider i en 3D-kulturblandingen, og deretter alikvoteringsprosessen denne blandingen for å lage 4 uavhengige replikate kulturer, fører til det industshment av flere kuler som kan overvåkes for en gitt eksperimentell tilstand (figur 1). Analysen er dermed lett foranderlig til statistisk sammenligning på grunn av den store potensielle "n", og fenotypen deles av kuler av samme type ser ut til å oppvise minimal variasjon. Legg merke til at mindre aggressive cellelinjer som BT-474 og MCFDCIS cellene danner glatte, kompakte kuler som har en mye mindre størrelse enn mer aggressive linjer. Som en konsekvens av dette, i løpet av den initielle celle seeding inn de hengende dråper, må startcellenummer for å bli justert tilsvarende.
Noen metastatisk cellelinjer utført mot våre forventninger, og viste ikke invasiv oppførsel i denne analysen. Kjente eksempler er A-431 og Colo 357 PL celler. Det er mulig at den manglende invasjon vises av disse linjene er på grunn av typen av ECM substrat som kulene ble integrert inn. Faktisk har andre vist at basalmembran kompisrial (f.eks matrigel) og kollagen kan ha ulike effekter på invasjonen av celler 17 kanskje på grunn av ulike matriksmetalloprotease krav til migrasjon 18. Således tilpasse forholdet av kollagen: kjellermembranmaterialer er en annen måte å endre analyseresultater, hvor reduksjon av basalmembranmaterialet komponent til en tredjedel av den totale blandingen, for derved å tillate en økning i mengden av kollagen, ytterligere kan forbedre invasjon av noen celletyper. Denne ideen er eksemplifisert i en fersk studie som fant en positiv korrelasjon mellom invasiv evne melke organoids og antall type I kollagen fibriller til stede, hvor kollagen fibrildannelse ble forfremmet ved å forlenge 4 ° C preinkuberingsperiode av pH nøytralisert kollagen 19.
Oppdagelsen av at noen cellelinjer handlet mot formodning viser noen av begrensningene i denne analysen. Selv om overvåking kreftcelle invasjon ut ofa sfæroid til en 3D-blanding bestående av kollagen og basalmembranmaterialer er mer fysiologisk relevant enn en 2D-motilitet analysen, er det fortsatt et modellsystem som utelater noen biologiske kompleksiteten på annen måte som finnes in vivo. For eksempel kan metastatisk evne bli modulert av de forskjellige mikromiljøer som støtter ortotopisk vs. ektopisk tumorvekst 20 og, som sådan, er det viktig å erkjenne at en rekke faktorer kan stromale dypt påvirker metastatiske prosess. En rekke av disse faktorene er fraværende i invasjonen analysen som presenteres her, og kan forklare noen av de observerte uoverensstemmelser.
I sammendraget, kreftcellen spheroid invasjon analysen som presenteres her gir et fleksibelt rammeverk for overvåking invasjon i en biologisk relevant setting, støtter oppdagelsen av mekanismer for celle invasjon, og kan potensielt hjelpe i utviklingen av nye anti-metastatiske terapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Støttet av NIH tilskudd P30 CA051008 og T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Metastasis: Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev. Cancer. 2 (8), (2002).
- Schmeichel, K. L., Bissell, M. J. Modeling tissue-specific signaling and organ function in three dimensions. J Cell Sci. 116 (12), 2377-2388 (2003).
- Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130 (4), (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. J Vis Exp. 51, (2011).
- Del Duca,, Werbowetski, D., T,, Del Maestro,, F, R. Spheroid preparation from hanging drops: characterization of a model of brain tumor invasion. J Neuro-Oncol. 67 (3), (2004).
- Justus, C. R., Leffler, N., Ruiz-Echevarria, M., Yang, L. V. In vitro cell migration and invasion assays. J Vis Exp. 88, (2014).
- Ramos-DeSimone, N., Hahn-Dantona, E., Sipley, J., Nagase, H., French, D. L., Quigley, J. P. Activation of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) via a converging plasmin/stromelysin-1 cascade enhances tumor cell invasion. J Bio Chem. 274 (19), Forthcoming.
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nature Rev. Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Semin Cancer Biol. 15 (5), 378-386 (2005).
- Shaw, L. M., Chao, C., Wewer, U. M., Mercurio, A. M. Function of the integrin α6β1 in metastatic breast carcinoma cells assessed by expression of a dominant-negative receptor. Cancer Res. 56 (5), 959-963 (1996).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), (2010).
- Rajan, N., Habermehl, J., Coté, M. -F., Doillon, C. J., Mantovani, D. Preparation of ready-to-use, storable and reconstituted type I collagen from rat tail tendon for tissue engineering applications. Nat Protoc. 1 (6), (2006).
- Provenzano, P. P., Eliceiri, K. W., Campbell, J. M. Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion. BMC Med. 4 (1), (2006).
- Timmins, N. E., Nielsen, L. K. Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method. Methods Mol Med. 140, 141-151 (2007).
- Brenner, W., Groß, S., Steinbach, F., Horn, S., Hohenfellner, R., Thüroff, J. W. Differential inhibition of renal cancer cell invasion mediated by fibronectin, collagen IV and laminin. Cancer Lett. 155, 199-205 (2000).
- Nieman, M. T., Prudoff, R. S., Johnson, K. R., Wheelock, M. J. N-cadherin promotes motility in human breast cancer cells regardless of their E-cadherin expression. J Cell Biol. 147 (3), Forthcoming.
- Cheung, K. J., Gabrielson, E., Werb, Z., Ewald, A. J. Collective invasion in breast cancer requires a conserved basal epithelial program. Cell. 155 (7), (2013).
- Sodek, K. L., Brown, T. J., Ringuette, M. J. Collagen I but not Matrigel matrices provide an MMP-dependent barrier to ovarian cancer cell penetration. BMC Cancer. 8 (1), 223-2210 (2008).
- Nguyen-Ngoc, K. V., Ewald, A. J. Mammary ductal elongation and myoepithelial migration are regulated by the composition of the extracellular matrix. J Microsc. 251 (3), 212-223 (2013).
- Glinskii, A. B., Smith, B. A., Jiang, P., Li, X., Yang, M., Hoffman, R. M., Glinsky, G. V. Viable circulating metastatic cells produced in orthotopic but not ectopic prostate cancer models. Cancer Res. 63 (14), 4239-4243 (2003).
