Introduction
È accertato che la motilità delle cellule tumorali è predittiva di potenziale metastatico, dato che tale comportamento facilita l'invasione attraverso la membrana basale e l'ingresso nel sistema circolatorio 1. Maggior parte delle ricerche sulla motilità si è concentrata su come le cellule si comportano in un ambiente bidimensionale (2D), anche se sta diventando ampiamente riconosciuto che il movimento delle cellule in una tridimensionale (3D) matrice è più rappresentativo di come queste stesse cellule saranno effettivamente comportarsi in vivo 2. Sistemi di coltura 3D sono sempre più utilizzati per studiare i comportamenti cellulari che vanno dalla morfologia delle cellule, di cinetica di crescita e sensibilità ai farmaci 3. Il desiderio di controllare l'invasione delle cellule del cancro nel contesto di un ambiente 3D ha portato alla sintesi di tecniche precedentemente stabilito che comportano la generazione di aggregati di cellule 3D (sferoidi) tramite il metodo di coltura goccia pendente 4, seguita da incorporare questi sferoidi in un extracellulare 3D matrice (ECM), composto di collagene e membrana basale materiali 5. Questo metodo cerca di migliorare queste tecniche precedentemente stabiliti fornendo un approccio semplificato che può essere facilmente utilizzato per confrontare invasione sotto una varietà di condizioni sperimentali.
Altri modi tradizionali per valutare la motilità cellulare in vitro sono il saggio di graffi ferita e il dosaggio transwell 6. Il primo test raffigura motilità cellulare in un ambiente 2D, ed è quindi indipendente di una varietà di caratteristiche critiche per l'invasione in vivo, ad esempio attività della proteasi 7. Il test può transwell invasione delle cellule modello migliore quando gli inserti e sono rivestiti con i substrati ECM, ma solo un unico parametro, cioè la comparsa di cellule sulla superficie della membrana opposta è misurata, e molte sfumature di invasione delle cellule non sono così facilmente osservabile. In contrasto con queste tecniche, il saggio delle cellule del cancro invasione sferoide (Figura 1 </ strong>) permette per il monitoraggio in tempo reale di invasione delle cellule in un ambiente che non è solo fisiologicamente rilevanti, ma permette anche importanti caratteristiche specifiche della linea di cellule per essere visualizzati, come la migrazione delle cellule individuale contro collettiva 8. Questo metodo permette anche vantaggi rispetto ai saggi di crescita della cultura 3D standard. La generazione di aggregati cellulari tramite il metodo goccia appeso limita inizialmente il movimento delle cellule, in modo che le cellule saranno incentivati ad invadere dopo questo vincolo viene sollevato. Inoltre, una volta che vincolo viene sollevato, l'uscita cella procederà in una direzione uniforme, che può quindi essere quantificata convenientemente.
I materiali ECM più popolari utilizzati per cellulari tumorali sferoidi test sono Matrigel e collagene di tipo I, dove ognuna di queste componenti ha ruoli importanti e distinti a influenzare il comportamento metastatico. Matrigel è una miscela di secreto proteine prodotte da cellule di sarcoma Engelbreth-Holm Sciame di topo, e si arricchisce in basemeproteine di membrana nt quali laminina, entactina, e collagene di tipo IV 9. Per questo motivo Matrigel è seguito definita come "materiali della membrana basale." Questi materiali forniscono membrana basale ligandi essenziali necessari per integrina adesione durante l'invasione delle cellule del cancro 10 oltre a molte altre proteine che esercitano una gamma di effetti sul comportamento cellulare 11. In confronto, collagene di tipo I, comunemente preparato da acido digest di tendini e altre strutture collagene dense 12, è un materiale di matrice molto più semplice che serve come un importante elemento strutturale dei tessuti e stroma sostegno tessuti connettivi ed organi del corpo. È stato dimostrato che le caratteristiche fisiche di collagene possono regolare un numero di caratteristiche di motilità cellulare; per esempio, l'allineamento delle fibrille di collagene all'interfaccia tumore stromale permette alle cellule tumorali di migrare successivamente lungo queste fibrille quando invadere nel stroma 13. Nel saggio qui presentato, sia di tipo I collagene e di materie membrana basale sono utilizzate come strumenti per studiare le interazioni cellula-stroma cancro 3D.
L'effetto di inibizione o stimolazione di vie che controllano invasione può essere monitorato dopo le cellule sono stati incorporati nella matrice 3D. Le celle possono essere pretrattati durante la crescita in gocce sospese o al momento del trasferimento alla cultura 3D, a seconda che un trattamento prolungato sarà richiesto per modulare invasione. Per i trattamenti brevi, si raccomanda che il farmaco essere miscelato con la sospensione sferoide dopo la raccolta, così come i mezzi che circonderà le culture 3D, per facilitare un'adeguata esposizione al farmaco alle cellule. Successivamente, le cellule stromali normali o tumore-associati possono essere mescolati con il materiale di matrice per valutare il loro ruolo nel modulare l'invasione delle cellule tumorali, o per determinare come il comportamento paracrino e autocrino cellule influenze segnalazione. Questa idea è stata mostrata in uno studio in cui la coculture di colsul cancro e le cellule endoteliali in appesi gocce portato ad una rete vascolare all'interno sferoidi 14. Infine, i costituenti ECM possono anche essere modificati, come l'invasione delle cellule tumorali è influenzata da diversi substrati 15. Il metodo presentato qui di seguito vi offre pertanto un quadro per la valutazione invasione delle cellule di cancro in una varietà di condizioni. In generale, si è riscontrato che non tutte le linee cellulari creeranno sferoidi nelle gocce appesi e linee cellulari epiteliali cercando tipicamente formare sfere regolare.
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Protocol
1. Generazione di Spheroids
- Preparare cella singola sospensione per appendere le culture goccia staccando colture di cellule di cancro aderenti del ~ 70% di confluenza con un PBS lavaggio seguito da esposizione a 0,05% soluzione di tripsina-EDTA.
- Neutralizzare la soluzione di tripsina con colture cellulari e contare le cellule utilizzando una aliquota della sospensione cellulare. Nota: I mezzi di coltura cellulare specifico dipenderà dalla linea cellulare in fase di test. Seguire ATCC raccomandazioni dei media, dove i media di coltura cellulare è tipicamente DMEM + 10% FBS. Ulteriori informazioni si possono trovare nella tabella dei materiali.
- Eseguire una diluizione per consentire la semina di 500-1.000 cellule per 20 microlitri goccia di colture cellulari.
- Acquisire 10 centimetri piatto e aggiungere 5 ml di PBS sterile fino in fondo. Nota: Questo passaggio protegge l'impiccagione scende da evaporazione. A costi inferiori "batteriologiche grade" piatti può essere utilizzato al posto di piatti di coltura cellulare di grado, come le cellule non sarà contagire sulla superficie cultura.
- Utilizzare una pipetta multicanale per trasferire 20 gocce microlitri della sospensione cellulare diluita alla superficie interna del coperchio.
- Pipettare 40 gocce (5 righe di 8 gocce) sul coperchio del piatto 10 cm.
- Capovolgere il coperchio e posizionare sopra la capsula di Petri. Incubare le culture goccia che pendono a 37 ° C per 72 ore per generare sferoidi.
- Capovolgere il coperchio in un fiducioso, ancora modo controllato. Nota: Inversione il coperchio troppo veloce o troppo lento può causare le goccioline a spostare. Alcune linee cellulari possono formare sferoidi in 48 ore o meno, mentre altri possono richiedere più di 72 ore per la produzione di aggregati compatti.
2. Integrazione di Spheroids in 3D Matrix
- Scongelare una aliquota di crescita seminterrato materiali per membrane fattore ridotto a 4 ° C per una notte prima di incorporare sferoidi.
- Opzionale: pozzi di livello con ECM in anticipo per evitare una possibile interazione con il sferoide cultu tessutire di superficie.
- Pipettare 200 ml di ECM per pozzetto su una piastra da 24 pozzetti.
- La piastra di assicurare che l'ECM copre l'intera superficie ben.
- Rimuovere con cura l'eccesso ECM con una pipetta.
- Incubare la piastra fino a pozzi sono asciutti: 3 ore a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
- Opzionale: pozzi di livello con ECM in anticipo per evitare una possibile interazione con il sferoide cultu tessutire di superficie.
- Raccogliere sferoidi inclinando il coperchio del piatto di coltura tissutale e condivisione del media. Trasferire i media con sferoidi in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga.
- Lasciare 10 min per sferoidi di depositarsi sul fondo della provetta. Spheroids dovrebbero essere visibili ad occhio.
- Mescolare 100 ml di materiali membrana basale con 100 ml di freddo (4 ° C), collagene di tipo I in un tubo di pre-raffreddata separata. Tenere la miscela a 4 ° C per prevenire o gel dalla solidificazione prematuramente.
- Utilizzare puntali pre-refrigerati se il trasferimento di piccoli volumi.
- Dare attenzione quandomescolando il tipo di materiali membrana basale e collagene che per evitare la formazione di bolle d'aria. Nota: Le bolle d'aria possono ostacolare l'imaging più tardi nel protocollo, se esse sono incorporati nel gel.
- Aspirare sferoidi dal 40 microlitri porzione di fondo della provetta, e si combinano con il materiale della membrana basale / collagene di tipo I miscela. Fare attenzione per evitare la formazione di bolle d'aria in fase di missaggio. Nota: La soluzione contenente 100 microlitri materiali membrana basale, 100 ml di tipo collagene I, e 40 ml di sferoidi creerò materiale sufficiente per 4 culture 3D indipendenti. Questo può essere scalata su o giù.
- Pipettare 40 gocce microlitri della miscela viscosa in centri di pozzetti in una piastra da 24 pozzetti. Mantenere il livello piastra per evitare che il composto scorre verso il lato del pozzo. Nota: Una singola colonna a 24 pozzetti - 4 pozzi - è consigliato per ogni condizione da testare.
- Posizionare la piastra di intoa 37 ° C incubatore e lasciare riposare per 30 minuti. La cultura 3D dovrà polimerizzare durante questo periodo.
- Lentamente immergere le culture 3D in 1 ml di coltura cellulare multimediale.
- Assicurarsi che il supporto è caldo quando aggiungerlo nei pozzetti per promuovere ulteriormente il gel di polimerizzazione.
- PUNTO CRITICO: aggiungere delicatamente il supporto alle culture 3D. Pipettaggio i media troppo in fretta nei pozzetti può portare al distacco delle culture 3D dalla superficie coltura di tessuti.
3. Monitoraggio e analisi Spheroid Invasion
- Invasione Immagine da sferoidi nella matrice 3D circostante a punti temporali decisi dallo sperimentatore. Acquisire fotografie utilizzando un microscopio invertito con la lente dell'obiettivo 20x. Nota: ideali punti temporali variano a seconda della linea cellulare in fase di test. Linee cellulari più invasive inizieranno la loro uscita dagli sferoidi poco dopo la placcatura e, di conseguenza, prendere fotografia iniziales entro un paio d'ore dopo la placcatura. In generale, le fotografie sono prese a 0 ore (dopo la placcatura), 24 ore e 48 ore. Invasione conclude tipicamente 24-48 ore dopo la placcatura.
- Quantificare la capacità invasiva utilizzando il software di analisi di immagine come immagine J.
- Analizzare invasione come la distanza cella dal bordo dello sferoide.
- Utilizzare lo strumento Disegna Dritto per segnare il raggio e / o massima distanza invasivo.
- Fai clic su "Analizza" nel menu in alto, e quindi fare clic su "Misura" per visualizzare la misura della lunghezza.
- Analizzare invasione come l'area totale invasivo al di fuori della sferoide.
- Utilizzare lo strumento Disegno a mano libera per tracciare il confine dello sferoide e / o area totale invasivo.
- Fai clic su "Analizza" nel menu in alto, e quindi fare clic su "Misura" per visualizzare la misura dell'area.
- Utilizzare un plugin come ROI Manager Tools per creare misure per una pila di immagini.
- Analizzare invasione come la distanza cella dal bordo dello sferoide.
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Representative Results
Usando il saggio di invasione sferoide (figura 1), un pannello di linee cellulari di tumore è stato testato per la loro capacità di formare sferoidi, così come per la quantità di fuoriuscita di cellule esposte dopo l'impianto in una matrice 3D costituiti da materie membrana basale e collagene di tipo I (Tabella 1). Questi risultati dimostrano che non ogni linea cellulare di tumore creerà sferoidi ben formate, dove le linee cellulari che possiedono una morfologia epiteliale in vitro tendevano a produrre aggregati regolari e lisce. La capacità di diverse linee cellulari di invadere nel test era anche variabile. Le linee cellulari che sono stabiliti come essere invasivo come 4T1, E0771, e U-87 mg ha evidenziato un elevato grado di uscita sferoide nel saggio. Linee di cellule meno aggressive, come il MCF-7, BT474, e MCF10DICS.com non hanno invadono, come è stato anticipato. Inaspettato, però, era la mancanza di dell'invasione visualizzato da 431-A e 357 cellule COLO PL. Un esempio di dati per alcuni di questilinee è mostrato (Figura 2). Per 4T1 e E0771 cellule, l'invasione era già pronunciato 24 ore dopo l'incorporazione sferoidi nella matrice 3D e, per U-87 MG, l'invasione è iniziata immediatamente dopo l'impianto nella matrice.
La valutazione qualitativa di invasione cellulare può essere ulteriormente sostenuto da quantificazione in software di analisi dell'immagine. Due strategie diverse per la quantificazione estensione dell'invasione incluse (figura 3), e la strategia scelta dipende dal tipo di invasione assistito. In ImageJ, distanza invasivo o zona invasivo viene prima delimitate utilizzando lo strumento sorteggio del software, dopo di che i valori comparativi sono generati come misurazioni in pixel. Immagini di microscopia possono essere importati come una pila per consentire l'acquisizione dei dati più efficiente ma, se così facendo, un plugin come ROI Manager Tools è consigliato per facilitare la misurazione efficiente.
| Linea cellulare | Tipo cancro | -Sphere capacità di formazione | Assay Invasion | |
| 4T1 | Mammario | Topo | +++ | ++ |
| A-431 | Epidermoid | Umano | +++ | - |
| BT-474 | Seno | Umano | ++ | - |
| COLO 357 PL | Pancreas | Umano | ++ | - |
| E0771 | Mammario | Topo | +++ | +++ |
| LNCaP | Prostata | Umano | + | - |
| MCF-7 | Seno | Umano | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | Seno | Umano | ++ | - |
| MDA-MB-231 | Seno | Umano | - | ? |
| PANC-1 | Pancreas | Umano | + | ++ |
| PC-3 | Prostata | Umano | - | ? |
| SK-BR-3 | Seno | Umano | - | ? |
| U-87 MG | Glioblastoma | Umano | +++ | +++ |
Tabella 1: linee. Sphere-formazione e l'invasione da parte di diverse linee cellulari cellulari testate sono segnati secondo le proprie capacità e l'invasione sfera formando.
Figura 1:. Workflow visivo del saggio di invasione sferoide Spheroids sono generati in gocce di media che pendono dal coperchio di un piatto di coltura di tessuto per 72 hr. Successivamente, le gocce vengono riunite, e sferoidi sono trasf sbagliato per una miscela di 4 ° C di materiali membrana basale e collagene di tipo I. Dopo risospensione sferoide, la miscela viscosa è pipettati nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti, dopo di che viene somministrato 30 minuti a 37 ° C a solidificare in una cultura 3D. Supporto caldo è poi aggiunto ai pozzetti. Uscita Cellulare da sferoidi viene quindi monitorata nel tempo.
Figura 2:. Esempio di dati di analisi Il 4T1, E0771, e U-87 cellule MG mostrano invasione sferoidi mentre l'A-431 e cellule MCF-7 non lo fanno. Invasione di U-87 cellule è più pronunciata dopo 24 ore, mentre l'invasione massima da parte delle cellule 4T1 e E0771 avviene più tardi. Per la E0771 più invasive e U-87 linee cellulari MG, uscita cella appare per compensare l'aumento di dimensione sferoide altrimenti osservata con le linee meno invasivi. Barra della scala, 200 micron.om / files / ftp_upload / 53.409 / 53409fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. Quantificazione di invasione Invasion può essere quantificata mediante analisi di immagine, ad esempio utilizzando il software Image J. (a) calcolo di invasione in funzione della distanza più lunga invasiva emana dal sferoide. (b) L'area totale invasa dalle cellule che lasciano il sferoide. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Questo studio ha valutato le prestazioni di un pannello di linee cellulari di cancro in un saggio di invasione sferoide (Tabella 1). Generalmente, troviamo che la formazione sferoide è migliorata in più linee cellulari epiteliali cercando, dove la presenza di giunzioni cellula-cellula promuove la formazione di un'architettura sferoide-like. Linee cellulari noti che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale, come MDA-MB-231 cellule non formano sferoidi nella cultura goccia appeso molto probabilmente a causa della loro ridotta E-, N, P e-caderina espressione 16.
Alcuni dei passaggi del saggio di invasione sferoide richiedono una stretta aderenza al protocollo. E 'assolutamente fondamentale lavorare velocemente durante la dispensazione della miscela membrana basale e collagene, ed è fondamentale che si tiene la miscela quasi 4 ° C, mentre lavorava come inizierà a solidificare a temperatura ambiente. Inoltre, preparazioni collagene solubile sono acide, e sono indotti a gel dal additione di una piccola quantità di idrossido di sodio e sale, seguita da riscaldamento a 37 ° C. Nelle nostre mani, semplicemente mescolando volumi uguali di collagene con materiali membrana basale rende gel-competente su riscaldando perché il componente membrana basale è in grado di neutralizzare il collagene. Se più piccoli rapporti di membrana basale: sono previsti il collagene, il collagene vanno neutralizzati prima di aggiungere alla miscela membrana basale per facilitare la polimerizzazione. Una volta formata, la maggior parte sferoidi sono resistenti alla dissociazione e sopravvivranno risospensione in questa miscela viscosa che comprenderà la cultura 3D. Durante le fasi di risospensione, si deve anche esercitare cura di limitare la formazione di bolle d'aria, in quanto questi possono ostacolare imaging. Quando si aggiungono coltura ai pozzetti dopo il gel si è solidificato, è importante che una pipette lentamente per evitare culture 3D si stacchi dal piatto.
L'uscita delle cellule tumorali nella matrice 3D circostante è generally correlata con la capacità invasiva delle linee, dove il E0771 e U-87 cellule MG dimostrato più invasione nel pannello di linee cellulari esaminati qui (Figura 2). È interessante notare che queste due linee mostrano anche diverse modalità di invasione. Considerando che le cellule E0771 invadono in modo graduale e collettiva, le cellule MG U-87 mostrano uscita individuale e rapido da sferoidi. Il test di invasione sferoide consente quindi uno per confrontare le diverse modalità utilizzate da linee di invadere il substrato.
Diversi metodi di analisi invasione sono presentati nella Figura 3 e il modo preferito di analisi possono dipendere dalla modalità di invasione. Indipendentemente dal tipo di analisi impiegato, questo test è stato progettato per consentire la rapida quantificazione di invasione su un gran numero di sferoidi. La messa in comune di sferoidi in una miscela culturale in 3D, e quindi aliquotando questa miscela per creare 4 culture replicate indipendenti, porta alla istishment di sferoidi multiple che possono essere monitorati per una data condizione sperimentale (Figura 1). Il test è quindi facilmente modificabile per confronto statistico dovuto alla grande potenziale "n" e il fenotipo condivisa da sferoidi dello stesso tipo sembra mostrino una variabilità minima. Si noti che le linee cellulari meno aggressivi come cellule BT-474 e MCFDCIS formano lisce, sfere compatte che hanno una dimensione molto più piccola di linee più aggressive. Di conseguenza, durante la semina cellula iniziale nelle gocce sospese, il numero di cellulare di partenza deve essere regolata di conseguenza.
Alcune linee di cellule metastatiche eseguite contro le nostre aspettative e non mostrano un comportamento invasivo in questo saggio. Tipici esempi sono l'A-431 e le cellule COLO 357 PL. È possibile che la mancanza dell'invasione visualizzata da queste linee è dovuto al tipo di substrato ECM che gli sferoidi sono stati incorporati in. Infatti, altri hanno dimostrato che membrana basale compagnorial (ad es Matrigel) e collagene possono avere effetti diversi sulla invasione delle cellule 17 forse a causa delle diverse esigenze delle metalloproteasi di matrice per la migrazione 18. Così, modificando il rapporto di collagene: materiali membrana basale è un altro modo per modificare i risultati del test, quando la riduzione della componente materia membrana basale a un terzo della miscela totale, in tal modo consentendo un aumento della quantità di collagene, potrebbe migliorare ulteriormente invasione da alcuni tipi di cellule. Questa idea è esemplificato in un recente studio che ha trovato una correlazione positiva tra la capacità invasiva di organoidi mammarie e il numero di collagene di tipo I fibrille presente, dove la formazione di fibrille di collagene è stato promosso estendendo il 4 ° periodo C pre-incubazione di pH neutralizzato collagene 19.
La scoperta che alcune linee cellulari agito contrariamente alle aspettative mostra alcune delle limitazioni di questo test. Nonostante l'invasione delle cellule tumorali di monitoraggio o fuorifa sferoide in una miscela costituita da materiali 3D collagene e membrana basale è fisiologicamente più rilevante di un saggio motilità 2D, è ancora un sistema modello che omette alcune complessità biologiche altrimenti presenti in vivo. Ad esempio, la capacità metastatica può essere modulata dalle microambienti distinte che supportano vs. ortotopico crescita tumorale ectopica 20 e, come tale, è importante riconoscere che una varietà di fattori stromali può influenzare profondamente il processo metastatico. Un certo numero di questi fattori sono assenti nel test di invasione presentato qui e potrebbe spiegare alcune delle incongruenze rilevate.
In sintesi, la cellula tumorale invasione sferoide saggio qui presentato fornisce un quadro flessibile per controllare l'invasione in un ambiente biologicamente rilevante, supporta la scoperta di meccanismi di invasione cellulare, e può potenzialmente aiutare nello sviluppo di nuove terapie anti-metastatici.
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Acknowledgments
Supportato dal NIH sovvenzioni P30 CA051008 e T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
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