Introduction
Wird festgestellt, dass Krebszellbeweglichkeit prädiktiv ist metastatischen Potential, da ein solches Verhalten erleichtert Invasion durch die Basalmembran und den Eintritt in das Kreislaufsystem 1. Die meiste Forschung auf Motilität hat, wie sich Zellen in einem zweidimensionalen (2D) Einstellung, obwohl es immer weitgehend anerkannt, dass die Bewegung von Zellen in einer dreidimensionalen (3D) Matrix ist repräsentativ dafür, wie diese selben Zellen tatsächlich fokussiert verhalten in vivo 2. 3D-Kultursysteme werden zunehmend eingesetzt, um zelluläre Verhaltensweisen, die von Zellmorphologie reichen, um das Wachstum Kinetik und Arzneimittelempfindlichkeit 3 studieren. Der Wunsch, die Invasion von Krebszellen im Rahmen einer 3D Milieu überwacht wurde zur Synthese der zuvor festgelegten Verfahren, bei denen die Erzeugung von 3D-Zellaggregate (Sphäroide) über den hängenden Tropfen Kulturverfahren 4, gefolgt von Einbettung dieser Sphäroide in ein 3D extrazellulärem führten Matrix (ECM) von Kollagen und Basalmembran Materialien 5 zusammengesetzt. Diese Methode dient, auf diese vorher festgelegten Techniken durch Bereitstellung eines optimierten Ansatz, die leicht verwendet werden kann, um das Eindringen unter einer Vielzahl von experimentellen Bedingungen zu vergleichen verbessern.
Weitere traditionelle Wege, um Zellbeweglichkeit in vitro zu beurteilen sind die kratz gewickelt Assay und die Transwell Assay 6. Erstere Assay zeigt Zellmotilität in einem 2D-Einstellung und ist daher unabhängig von einer Vielzahl von Funktionen kritisch für die in vivo-Invasion, zum Beispiel Proteaseaktivität 7. Die Transwell-Assay kann besseres Modell Zellinvasion, wenn die auch Einsätze mit ECM Substrate jedoch nur einen einzelnen Parameter beschichtet, dh das Auftreten von Zellen, die auf der gegenüberliegenden Membranoberfläche gemessen wird, und viele Nuancen der Zellinvasion sind daher nicht leicht beobachtbar. Im Gegensatz zu diesen Techniken ist die Krebszelle Sphäroid Invasionsassay (Abbildung 1 </ strong>) ermöglicht die Echtzeit-Überwachung der Zellinvasion in einer Umgebung, die nicht nur physiologisch relevant, sondern erlaubt auch die wichtigen Zelllinie spezifische Merkmale sichtbar zu machen, wie einzelne vs. kollektiven Zellmigration 8. Dieses Verfahren bietet auch Vorteile gegenüber Standard-3D-Kulturwachstums-Assays. Die Erzeugung von Zellaggregaten über die Hängetropfenmethode zunächst schränkt Zellbewegung, so dass Zellen Anreize zu erobern, nachdem diese Einschränkung aufgehoben werden. Darüber hinaus einmal, dass Zwang angehoben wird, wird Zell Egress gehen in eine einheitliche Richtung, die dann bequem quantitativ bestimmt werden kann.
Die für die Krebszelle Sphäroiden Assays verwendet beliebtesten ECM Materialien sind Matrigel und Kollagen Typ I, wobei jede dieser Komponenten hat wichtige und unterschiedliche Rollen bei der Beeinflussung metastatischen Verhalten. Matrigel ist eine sekretierte Proteingemisch von Engelbreth-Holm-Swarm-Maus Sarcomazellen erzeugt und in baseme angereichertnt Membranproteine wie Laminin, Entactin und Kollagen Typ IV 9. Aus diesem Grund Matrigel wird fortan als "Basalmembran Materialien." Diese Basalmembran Materialien liefern wichtige Liganden für Integrin Haftung während Invasion von Krebszellen 10 zusätzlich zu vielen anderen Proteinen, die eine Reihe von Auswirkungen auf das Verhalten der Zelle 11 auszuüben brauchte. Im Vergleich Kollagen Typ I, die gemeinhin aus sauren Aufschlüssen von Sehnen und anderen dichten Kollagenstrukturen 12 hergestellt wird, ist eine viel einfachere Matrixmaterial, das als Hauptstrukturelement des Bindegewebes und Stroma Stützgewebe und Organen des Körpers dient. Es hat sich gezeigt, dass die physikalischen Eigenschaften von Kollagen können eine Reihe von Merkmalen der Zellmotilität regeln; zum Beispiel die Ausrichtung der Kollagenfasern in den Tumor-Stroma-Schnittstelle ermöglicht die Krebszellen zu migrieren anschließend entlang dieser Fibrillen, wenn eindringende in das Stroma 13. In dem Assay hier präsentierten sowohl Typ I-Kollagen und Basalmembran-Materialien werden als Werkzeuge, um 3D-Zell-Stroma-Interaktionen zu untersuchen nutzt.
Die Wirkung der Inhibierung oder Stimulierung von Bahnen, die Invasion überwacht, nachdem die Zellen in die 3D-Matrix eingebettet werden, zu steuern. Zellen können während des Wachstums in den hängenden Tropfen oder bei Übertragung der 3D-Kultur, abhängig davon, ob eine längere Behandlung erforderlich, um Invasion modulieren vorbehandelt werden. Für kürzere Behandlungs, ist es empfehlenswert, dass das Medikament mit dem Sphäroid Suspension nach der Erfassung, sowie die Medien, die den 3D-Kulturen umgeben wird, um eine angemessene Arzneimittelexposition zu den Zellen erleichtern gemischt werden. Als nächstes kann normal oder Tumor-assoziierten Stromazellen mit dem Matrixmaterial vermischt werden, um ihre Rolle bei der Modulation der Tumorzellinvasion zu bewerten, oder um festzustellen, wie parakrine und autokrine Signalisierung Einflüsse Zellverhalten. Diese Idee wurde in einer Studie gezeigt, wo die Co-Kultur von colüber Krebs und Endothelzellen in hängenden Tropfen zu einer Gefäßnetz innerhalb der Sphäroide 14. Schließlich kann das ECM Komponenten auch verändert werden, da Invasion von Krebszellen wird durch verschiedene Substrate 15 belastet. Die unten dargestellten Verfahren wird somit ein Rahmen für die Beurteilung Invasion von Krebszellen unter einer Vielzahl von Bedingungen. Allgemein wurde festgestellt, dass nicht alle Zelllinien Sphäroide in den hängenden Tropfen zu erstellen und epithelialen gerichteten Zelllinien bilden in der Regel regelmäßige Sphären.
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Protocol
1. Erzeugung von Spheroids
- Vorbereitung Einzelzellsuspension für hängende Tropfen Kulturen durch Ablösen haftKrebsZellKulturen von ~ 70% Konfluenz unter Verwendung eines PBS-Wasch durch Belichtung mit 0,05% Trypsin-EDTA-Lösung.
- Neutralisieren die Trypsin-Lösung mit Zellkulturmedien und zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Aliquots der Zellsuspension. Anmerkung: Die spezifische Zellkulturmedien werden auf der Zelllinie abhängig getestet. Folgen ATCC Medienempfehlungen, wobei die Zellkulturmedien typischerweise DMEM + 10% FBS. Weitere Informationen finden Sie in der Werkstoff-Tabelle gefunden werden.
- Führen eine Verdünnung für die Aussaat von 500-1000 Zellen pro 20 ul Tropfen der Zellkulturmedien ermöglichen.
- Erwerben Sie 10 cm Schüssel und 5 ml sterilem PBS auf den Grund. Hinweis: Dieser Schritt schützt den hängenden Tropfen aus der Verdampfung. Kostengünstigere "bakteriologischen grade" Gerichte können an Stelle der Zellkultur Geschirr verwendet werden, wie Zellen nicht conthandeln die Kulturfläche.
- Verwenden einer Mehrkanal-Pipette 20 ul Tropfen der verdünnten Zellsuspension auf die innere Oberfläche des Deckels übertragen.
- Pipette 40 Tropfen (5 Reihen von 8 Tropfen) auf dem Deckel des 10 cm-Schale.
- Kehren Sie die Deckel und Platz über der Kulturschale. Der hängende Tropfen Kulturen bei 37 ° C inkubieren 72 h bis Sphäroide zu erzeugen.
- Klappen Sie den Deckel in eine selbstbewusste, dennoch kontrolliert. Hinweis: Invertierung des Deckels zu schnell oder zu langsam, kann dazu führen, die Tröpfchen zu verschieben. Einige Zelllinien können Sphäroiden in 48 Stunden oder weniger zu bilden, während andere erfordern mehr als 72 Stunden, um kompakte Aggregate zu erzeugen.
2. Einbetten von Sphäroiden in 3D-Matrix
- Auftauen eines Aliquots Wachstumsfaktor reduziert Basalmembran Stoffe bei 4 ° C über Nacht vor dem Einbetten der Sphäroide.
- Optional: Layer Vertiefungen mit ECM im voraus, um mögliche Sphäroid Wechselwirkung mit dem Gewebe zu verhindern cultuwieder auftauchen.
- Jeweils 200 ul ECM pro Well auf einer 24-Well-Platte.
- Kippen Sie die Platte, um sicherzustellen, dass das ECM umfasst die gesamte Erdoberfläche.
- Überschüssige ECM Entfernen Sie vorsichtig mit einer Pipette.
- Die Platte, bis die Brunnen sind trocken: 3 Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C.
- Optional: Layer Vertiefungen mit ECM im voraus, um mögliche Sphäroid Wechselwirkung mit dem Gewebe zu verhindern cultuwieder auftauchen.
- Sammeln der Sphäroide durch Kippen des Deckels der Gewebekulturschale und das Poolen der Medien. Übertragen Sie die Medien mit den Sphäroiden in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Gestatten 10 min für die Sphäroide, sich am Boden des Mikrozentrifugenröhrchens zu regeln. Sphäroiden sollte mit dem Auge sichtbar sein.
- Mischungs 100 ul der Basalmembran Materialien mit 100 ul kaltem (4 ° C) Kollagen vom Typ I in einem separaten vorgekühlte Röhrchen. Halten der Mischung bei 4 ° C entweder Gel verfestigt vorzeitig zu verhindern.
- Verwenden Sie vorgekühlte Pipettenspitzen, wenn die Übertragung kleiner Volumina.
- Geben Sie vorsichtig, wenn SieMischen der Basalmembran Materialien und Kollagen Typ I, um Luftblasenbildung zu verhindern. Anmerkung: Luftblasen können Abbildungs später in dem Protokoll zu behindern, wenn sie in dem Gel eingebettet werden.
- Absaugen Sphäroide aus der 40 ul Bodenabschnitt des Mikrozentrifugenröhrchens, und verbinden sich mit der Basalmembran Stoffe / Kollagen Typ I-Gemisch. Seien Sie vorsichtig, um Luftblasenbildung beim Mischen zu verhindern. Anmerkung: Die Lösung, die von 100 ul Basalmembran Materialien 100 ul Kollagen Typ I, und 40 ul der Sphäroide genügend Material für 4 unabhängige 3D Kulturen zu schaffen. Dies kann nach oben oder unten skaliert werden.
- Pipette 40 ul Tropfen der viskosen Mischung in die Zentren der Vertiefungen auf einer Platte mit 24 Vertiefungen. Halten Sie die Platte Ebene, um die Mischung aus Laufen in die Seite des Bohrlochs zu verhindern. Hinweis: Eine einzelne Spalte auf der 24-Well-Platte - 4 Brunnen - wird empfohlen, für jede Bedingung getestet werden.
- Legen Sie die Platte intoa 37 ° C-Inkubator und lassen Sie ungestört für 30 Minuten. Die 3D-Kultur wird in diesem Zeitraum zu polymerisieren.
- Langsam tauchen die 3D-Kulturen in 1 ml Zellkulturmedien.
- Stellen Sie sicher, dass die Medien ist warm, wenn Sie die Ware in die Vertiefungen zur weiteren Förderung Gelpolymerisation.
- Wichtiger Schritt: die Medien, um die 3D-Kulturen hinzuzufügen vorsichtig. Pipettieren der Medien zu schnell in die Vertiefungen können zur Ablösung der 3D-Kulturen aus dem Gewebekulturoberfläche führen.
3. Überwachung und Analyse der Spheroid Invasion
- Bild Invasion aus der Sphäroide in das umgebende 3D-Matrix bei vom Forscher beschlossen Zeitpunkten. Erwerben Fotografien mit einem inversen Mikroskop mit 20-facher Objektivlinse. Anmerkung: Ideal Zeitpunkten in Abhängigkeit von der Zelllinie getestet abweichen. Invasiveren Zellinien ihre Austritt aus den Sphäroiden kurz nach der Plattierung zu beginnen, und daher nehmen anfängliche Fotografies innerhalb von ein paar Stunden nach der Plattierung. Im Allgemeinen werden Fotografien bei 0 h (nach der Beschichtung), 24 h und 48 h entnommen. Invasion, schließt in der Regel 24 bis 48 Stunden nach der Plattierung.
- Quantifizieren invasive Möglichkeit, anhand der Bildanalyse-Software wie Bild J.
- Analyse Invasion als der Zellenabstand von der Kante des Sphäroids.
- Verwenden Sie den Straight Draw-Tool, um den Radius und / oder maximale invasive Entfernung zu markieren.
- Klicken Sie auf "Analysieren" in der oberen Menüleiste und klicken Sie auf "Messen", um die Längenmessung anzuzeigen.
- Analysieren Invasion als der Gesamt invasive Bereich außerhalb der Sphäroid.
- Verwenden Sie die Freihand-Zeichenwerkzeug, um die Grenze des Sphäroids und / oder Gesamt invasive Bereich zu verfolgen.
- Klicken Sie auf "Analysieren" in der oberen Menüleiste und klicken Sie auf "Messen", um die Flächenmessung anzuzeigen.
- Verwenden Sie ein Plugin wie ROI Manager Tools, um Messungen für einen Stapel von Bildern erstellen.
- Analyse Invasion als der Zellenabstand von der Kante des Sphäroids.
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Representative Results
Verwendung des Sphäroids Invasionsassay (Abbildung 1), eine Reihe von Krebszelllinien wurden auf ihre Fähigkeit zur Sphäroide als auch für die Höhe der Zelle Austritt nach der Implantation in einer 3D-Matrix gezeigt, die aus Basalmembran Materialien und Typ I-Kollagen zu bilden getestet (Tabelle 1). Diese Ergebnisse zeigen, dass nicht jeder Krebszelllinie wird wohlgeformt Sphäroiden, wo Zelllinien besitzen eine epitheliale Morphologie in vitro neigten dazu, regelmäßige und glatte Aggregate erzeugen erstellen. Die Fähigkeit der verschiedenen Zelllinien in dem Assay einzudringen war variabel. Zelllinien, die als invasive wie 4T1, E0771 und U-87 MG etabliert sind zeigte einen hohen Grad der Sphäroid Egress im Assay. Weniger aggressive Zelllinien, wie die MCF-7, BT474 und MCF10DICS.com nicht einzufallen, wie erwartet wurde. Unerwartet war jedoch die mangelnde Invasion durch A-431 und COLO 357 PL-Zellen dargestellt. Ein Beispiel der Daten für einige dieserLinien dargestellt (Abbildung 2). Für 4T1 und E0771 Zellen Invasion war bereits 24 Stunden nach der Einbettung der Sphäroide in die 3D-Matrix ausgesprochen und für U-87 MG, Invasion direkt nach der Implantation in die Matrix begonnen.
Die qualitative Beurteilung der zellulären Invasion kann durch Quantifizierung der Bildanalyse-Software unterstützt werden. Zwei verschiedene Strategien zum Quantifizieren des Ausmaßes des Eindringens enthalten sind (Figur 3), und die gewählte Strategie hängt von der Art der Invasion beobachtet. In ImageJ ist invasive Entfernung oder invasive Bereich zunächst mit der Software Zeichenwerkzeug, nach der Vergleichswerte als Pixelmessungen generiert abgegrenzt. Mikroskopie-Bilder können als Stapel importiert werden, um eine effizientere Datenerfassung zu ermöglichen, aber, wenn dies ist ein Plugin wie ROI Manager Tools empfohlen, effiziente Mess erleichtern.
| Zelllinie | Cancer Typ | Sphere Bildungsvermögen | Assay Invasion | |
| 4T1 | Brust- | Maus | +++ | ++ |
| A-431 | Epidermoid | Menschliche | +++ | - |
| BT-474 | Brust | Menschliche | ++ | - |
| COLO 357 PL | Pankreas | Menschliche | ++ | - |
| E0771 | Brust- | Maus | +++ | +++ |
| LNCaP | Prostata | Menschliche | + | - |
| MCF-7 | Brust | Menschliche | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | Brust | Menschliche | ++ | - |
| MDA-MB-231 | Brust | Menschliche | - | ? |
| PANC-1 | Pankreas | Menschliche | + | ++ |
| PC-3 | Prostata | Menschliche | - | ? |
| SK-BR-3 | Brust | Menschliche | - | ? |
| U-87 MG | Glioblastoma | Menschliche | +++ | +++ |
Tabelle 1:. Sphärenbildung und das Eindringen von verschiedenen getesteten Zelllinien Zelllinien werden nach ihrer Kügelchenbildungsfähigkeit und Invasion erzielt.
Abb. 1: Visuelle Ablauf des Sphäroids Invasionsassay Sphäroide werden in Tropfen von Medien, die von dem Deckel aus einer Gewebekulturschale 72 h hängen generiert. Anschließend werden die Tropfen vereinigt und die Sphäroide transf geirrt zu einem 4 ° C Mischung aus Basalmembran Materialien und Typ I-Kollagen. Folgende Sphäroid Resuspension wird das viskose Gemisch in die Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen, wonach es 30 min bei 37 ° C gegeben, um in ein 3D-Kultur verfestigen pipettiert. Warme Medium wird dann in die Vertiefungen gegeben. Zelle Austritt aus den Sphäroiden wird dann im Laufe der Zeit überwacht.
Abb. 2: Beispiel der Untersuchungsdaten Die 4T1, E0771 und U-87-MG-Zellen zeigen Invasion aus den Sphäroiden, während die A-431 und MCF-7 Zellen nicht. Invasion der U-87-Zellen nach 24 Stunden die meisten ausgeprägt, während die maximale Invasion der 4T1 und E0771 Zellen erfolgt später. Größten invasive E0771 und U-87 MG-Zellinien, wird Zell Egress, die Zunahme der Sphäroid Größe im übrigen nicht mit den weniger invasiven Linien beobachtet ausgeglichen. Maßstabsbalken, 200 um.om / files / ftp_upload / 53409 / 53409fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abb. 3: Die Quantifizierung der Invasion Invasion kann durch Bildanalyse quantifiziert werden, beispielsweise mit Hilfe von Image J Software. (a) Berechnung der Invasion in Abhängigkeit von der längsten invasive Abstand von der Sphäroid ausgehen. (b) Gesamtfläche von Zellen Verlassen der Sphäroid überfallen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In dieser Studie wurde die Leistung einer Reihe von Krebszelllinien in einem Sphäroid Invasionstest (Tabelle 1). Im Allgemeinen finden wir, dass Sphäroidbildung ist in den mehr epitheliale gerichteten Zelllinien, bei denen die Anwesenheit von Zell-Zell-Verbindungen fördert die Bildung von einem Sphäroid-like-Architektur verbessert. Bekannten Zelllinien, welche eine epitheliale-mesenchymale Transition erfahren haben, wie MDA-MB-231-Zellen nicht Sphäroide im Drop Kultur wahrscheinlichste hängenden bilden aufgrund ihrer kürzeren E-, N- und P-Cadherin-Expression 16.
Einige der Schritte in dem Sphäroid Invasionsassay eine enge Einhaltung des Protokolls. Es ist absolut entscheidend, schnell zu arbeiten beim Pipettieren die Basalmembran und Kollagen-Gemisch, und es ist entscheidend, dass man die Mischung in der Nähe von 4 ° C, während der Arbeit, wie sie beginnen, bei Raumtemperatur zu verfestigen hält. Ferner sind lösliche Kollagenzubereitungen sauren und werden zu einem Gel durch das addit induzierteIonen von einer kleinen Menge von Natriumhydroxid und Salz, durch Erwärmen auf 37 ° C an. In unseren Händen, einfaches Mischen gleicher Volumina von Kollagen mit der Basalmembran Materialien macht sie gel-kompetenten beim Erwärmen, weil die Basalmembran-Komponente ist in der Lage, um das Kollagen zu neutralisieren. Wenn kleinere Verhältnisse der Basalmembran: Kollagen werden, so muß das Kollagen vor Zugabe des Basalmembran Gemisch, um die Polymerisation zu erleichtern, neutralisiert werden. Einmal gebildet, sind die meisten Sphäroide resistent gegen Dissoziation und Resuspension in diesem viskosen Mischung, die das 3D-Kultur umfassen werden überleben. Während der Aufwirbelung Schritte muss man auch Vorsicht walten, um die Bildung von Luftblasen zu begrenzen, da diese Bildgebung erschweren. Beim Hinzufügen von Kulturmedium in die Vertiefungen nachdem das Gel erstarrt ist, ist es wichtig, dass man Pipetten langsam um die 3D-Kulturen ein Ablösen von der Schale zu verhindern.
Der Austritt von Krebszellen in das umgebende 3D-Matrix ist generally mit der invasiven Fähigkeit der Linien, wobei die E0771 und U-87 MG-Zellen gezeigt, die am Eindringen in das Paneel des hier untersuchten Zelllinien (2) korreliert. Interessanterweise sind diese beiden Linien zeigen auch verschiedene Modi der Invasion. Während die E0771 Zellen eindringen in einer allmählichen und kollektive Weise werden die U-87-MG-Zellen zeigen individuellen und raschen Ausstieg aus den Sphäroiden. Das Sphäroid Invasionstest ermöglicht somit ein, um die verschiedenen Modi von Leitungen verwendet, um das Substrat eindringen zu vergleichen.
Verschiedene Verfahren zur Analyse von Invasion, sind in 3 dargestellt und die bevorzugte Art der Analyse kann von der Art der Invasion abhängen. Unabhängig von der Art der Analyse verwendet wird, wurde dieser Test entwickelt, um für die schnelle Quantifizierung des Eindringens von einer großen Anzahl von Sphäroiden erlauben. Die Bündelung der Sphäroide in ein 3D-Kulturgemisch und dann Aliquotieren Sie diese Mischung zu 4 unabhängige Replika-Kulturen zu erstellen, führt zu der establishment mehrerer Sphäroide, die für einen gegebenen experimentellen Bedingungen (Figur 1) überwacht werden kann. Der Test ist somit leicht abänderbar, um den statistischen Vergleich aufgrund des großen Potentials "n", und der Phänotyp von Sphäroiden des gleichen Typs gemeinsam genutzt scheint minimal Variabilität aufweisen. Beachten Sie, dass weniger aggressive Zelllinien wie BT-474 und MCFDCIS Zellen bilden glatte, kompakte Kugeln, die eine viel kleinere Größe als aggressiver Leitungen verfügen. Als Folge davon während der anfänglichen Zellaussaat in den hängenden Tropfen, muss die Ausgangszellzahl entsprechend angepasst werden.
Einige metastatischen Zelllinien gegen unsere Erwartungen durchgeführt und nicht invasives Verhalten in diesem Test aufweisen. Bemerkenswerte Beispiele sind die A-431 und die COLO 357 PL-Zellen. Es ist aufgrund der Art des Substrats, das ECM die Sphäroide wurden in eingebettet sein, dass das Fehlen der Invasion durch diese Linien dargestellt ist. In der Tat haben andere, die Basalmembran Kollegen gezeigtRial (zB Matrigel) und Kollagen kann unterschiedliche Auswirkungen auf die Invasion von Zellen 17 möglicherweise aufgrund unterschiedlicher Matrixmetalloprotease Anforderungen für die Migration 18 haben. Somit Regulieren des Verhältnisses von Kollagen: Basalmembran Materialien ist eine weitere Möglichkeit, die Untersuchungsergebnisse zu modifizieren, wobei die Verringerung der Basalmembran Materialkomponente zu einem Drittel der Gesamtmischung, wodurch eine Erhöhung der Menge von Kollagen, könnte weiter verbessern Invasion Einige Zelltypen. Dieser Gedanke wird in einer Studie, die eine positive Korrelation zwischen der invasiven Fähigkeit von Brust Organoide und die Anzahl der Typ-I-Kollagen-Fibrillen vorliegen, wobei Kollagenfibrille Bildung wurde durch Verlängerung des 4ºC Präinkubationszeit von pH gefördert neutralisierte Kollagen 19 gefunden exemplifiziert.
Die Entdeckung, dass einige Zelllinien handelte wider Erwarten zeigt einige der Beschränkungen dieses Assays. Obwohl die Überwachung Invasion von Krebszellen aus ofa spheroid in ein 3D-Gemisch, das aus Kollagen und Basalmembran Materialien mehrere physiologisch relevanter als ein 2D-Motilität Assay, ist es noch ein Modellsystem, das einige biologische Komplexität ansonsten in vivo gefunden auslässt. Beispielsweise kann Metastasierungsfähigkeit von den unterschiedlichen Mikroumgebungen, die orthotope vs. Eileitertumorwachstum zu unterstützen 20 moduliert werden, und als solche, ist es wichtig zu erkennen, dass eine Vielzahl von Stroma-Faktoren können tiefgreifend beeinflussen die metastatischen Prozesses. Eine Anzahl dieser Faktoren sind in der Invasionsassay hier präsentierten fehlt und könnte einige der beobachteten Inkonsistenzen erklären.
Zusammenfassend ist der Krebs-Zell-Sphäroiden Invasionsassay hier präsentierten ein flexibler Rahmen für die Überwachung Invasion in einem biologisch relevanten Einstellung unterstützt die Entdeckung der Mechanismen der Zellinvasion und möglicherweise in der Entwicklung von neuen anti-metastatische Therapie unterstützen.
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Acknowledgments
Unterstützt von NIH Zuschüsse P30 CA051008 und T32 CA009686 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
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