Introduction
Está provado que a motilidade célula cancerosa é preditiva do potencial metastático, uma vez que tal comportamento facilita a invasão através da membrana basal e da entrada no sistema circulatório 1. Mais investigação sobre a motilidade tem-se centrado na forma como as células se comportam de uma configuração bidimensional (2D), embora se tornando-se amplamente reconhecido que o movimento das células em uma matriz tridimensional (3D) é mais representativo de como estas mesmas células vão realmente 2 comportar in vivo. Sistemas de cultura 3D são cada vez mais usados para estudar comportamentos celulares que vão desde a morfologia celular, a cinética de crescimento e de sensibilidade às drogas 3. O desejo de controlar a invasão de células do cancro no contexto de um meio 3D levou à síntese de técnicas anteriormente estabelecidas, envolvendo a geração de agregados de células de 3D (esferóides) através do método de cultura de gota em suspensão 4, seguido por incorporação destes esferóides numa extracelular 3D matriz (ECM) composta de colágeno e da membrana basal materiais 5. Este método visa aperfeiçoar estas técnicas anteriormente estabelecidas, fornecendo uma abordagem simplificada que pode ser facilmente utilizado para comparar invasão sob uma variedade de condições experimentais.
Mais formas tradicionais para avaliar a motilidade celular in vitro são o ensaio da ferida-zero e o ensaio transwell 6. O primeiro ensaio de motilidade celular descreve uma configuração em 2D, e é, por conseguinte, independente de uma variedade de características críticas para a invasão in vivo, por exemplo, actividade de protease de 7. O ensaio de invasão de células Transwell pode melhor modelo, quando os insertos de cavidades são revestidas com substratos ECM, mas apenas um único parâmetro, isto é, o aparecimento de células sobre a superfície oposta da membrana é medida, e muitas nuances de invasão de células não são, portanto, facilmente observáveis. Em contraste com estas técnicas, o ensaio de invasão de células de cancro esferóide (figura 1 </ forte>) permite a monitorização em tempo real da invasão celular, num ambiente que não só é fisiologicamente relevante, mas também permite características importantes específica da linha de células a serem visualizadas, tais como migração de células indivíduo vs colectiva 8. Este método também proporciona vantagens em relação aos ensaios padrão de crescimento de cultura 3D. A geração de agregados celulares através do método de gota em suspensão inicialmente restringe o movimento celular, de modo a que as células serão incentivados a invadir após esta restrição será levantada. Além disso, uma vez que a restrição é levantada, a saída de células irá prosseguir numa direcção uniforme, que pode então ser convenientemente quantificado.
Os materiais de ECM mais populares usados para esferóides ensaios de células de câncer são Matrigel e colágeno tipo I, em que cada um destes componentes tem papéis importantes e distintas em influenciar o comportamento metastático. Matrigel é uma mistura de proteínas segregadas por células de sarcoma produzidos Engelbreth Holm Swarm-rato, e é enriquecido em basemeproteínas da membrana nt, tais como laminina, entactina, e colágeno tipo IV 9. Por esta razão Matrigel é doravante referido como "materiais de membrana basal." Estes materiais de membrana basal proporcionar ligandos essenciais necessários para adesão integrina durante a invasão de células de cancro 10, além de muitas outras proteínas que exercem uma variedade de efeitos no comportamento das células 11. Em comparação, o colagénio do tipo I, geralmente preparado a partir de digestões de ácido dos tendões e outras estruturas de colagénio densas 12, é um material de matriz muito mais simples que serve como um elemento estrutural do tecido do estroma e tecidos conjuntivos de suporte e órgãos do corpo. Foi demonstrado que as características físicas do colagénio pode regular um número de características de motilidade celular; Por exemplo, o alinhamento de fibras de colagénio na interface tumor-estromal permite que as células cancerosas migram subsequentemente ao longo dessas fibrilas ao invadir o estroma 13 em. No ensaio aqui apresentado, tanto o colágeno tipo I e materiais da membrana basal são utilizados como ferramentas para estudar as interações célula de câncer 3D-estroma.
O efeito de inibição ou estimulação de caminhos que controlam invasão pode ser monitorizada após as células terem sido incorporados na matriz 3D. As células podem ser pré-tratados durante o crescimento nas gotas de suspensão ou aquando da transferência para a cultura 3D, dependendo se um tratamento prolongado será necessário para modular a invasão. Para tratamentos mais curtos, recomenda-se que a droga ser misturada com a suspensão esferóide após a recolha, assim como os meios de comunicação que vai rodear as culturas em 3D, para facilitar a exposição adequada da droga para as células. Em seguida, as células normais ou associados a tumores do estroma podem ser misturados com o material de matriz para avaliar o seu papel na modulação da invasão de células tumorais, ou para determinar o comportamento de células influências parácrino e autócrino de sinalização. Esta ideia foi demonstrado em um estudo onde a co-cultura de colsobre câncer e células endoteliais em gotas de suspensão levou a uma rede vascular dentro dos esferóides 14. Finalmente, os componentes ECM também pode ser alterado, como a invasão da célula cancerosa é afetado por diferentes substratos 15. O método apresentado abaixo, assim, fornecer um quadro para a avaliação da invasão da célula cancerosa sob uma variedade de condições. De um modo geral verificou-se que nem todas as linhas de células irá criar esferóides nas gotas de suspensão e linhas de células epiteliais de aspecto tipicamente formar esferas regulares.
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Protocol
1. Geração de esferóides
- Prepare a suspensão de células individuais para pendurar culturas gota a separar culturas aderentes de células de cancro de ~ 70% de confluência utilizando uma lavagem com PBS, seguido por exposição a uma solução tripsina-EDTA 0,05%.
- Neutraliza-se a solução de tripsina com meio de cultura de células e contagem das células, utilizando-se uma alíquota da suspensão de células. Nota: O meio de cultura de células específico dependerá da linha celular a ser testada. Seguir as recomendações da ATCC media, onde o meio de cultura celular é normalmente de DMEM + 10% de FBS. Mais informação pode ser encontrada na Tabela Materiais.
- Efectuar uma diluição para permitir a sementeira de 500-1000 células por 20 ul gota de meio de cultura celular.
- Adquirir 10 cm de placa e adicionam-se 5 ml de PBS estéril para o fundo. Nota: Esta etapa protege o enforcamento cai de evaporação. Baixo custo "bacteriológicos" pratos grau pode ser usado em lugar de pratos de grau de cultura de células, como as células não irá contactuar a superfície de cultura.
- Usar uma pipeta multi-canal para transferir gotas de 20 ul da suspensão de células diluída com a superfície interna da tampa.
- Pipetar 40 gotas (5 linhas de 8 gotas) sobre a tampa da placa de 10 cm.
- Inverter a tampa e coloque sobre o prato de cultura. Incubam-se as culturas de gota em suspensão a 37 ° C durante 72 h, para gerar esferóides.
- Vire a tampa de uma forma confiante, ainda controlada. Nota: Inverter a tampa muito rápido ou muito lento pode causar as gotículas de mudar. Algumas linhas de células podem formar esferóides em 48 horas ou menos, enquanto outros podem exigir mais do que 72 horas para produzir agregados compactos.
2. Incorporação de Spheroids em Matrix 3D
- Descongelar uma aliquota de crescimento reduzida de factor porão materiais de membrana, a 4 ° C durante a noite antes de incorporação dos esferóides.
- Opcional: poços camada com ECM de antecedência para evitar a interação potencial esferóide com o tecido culture superfície.
- Pipetar 200 l de ECM por cavidade em uma placa de 24 cavidades.
- Inclinar a placa para assegurar que a ECM cobre toda a superfície dos poços.
- Retirar cuidadosamente o excesso ECM com uma pipeta.
- Incubar a placa até que os poços estão secas: 3 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C.
- Opcional: poços camada com ECM de antecedência para evitar a interação potencial esferóide com o tecido culture superfície.
- Recolher os esferóides inclinando a tampa da placa de cultura de tecidos e de partilha dos meios de comunicação. Transferir os meios de comunicação com os esferóides em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Permitir que 10 min durante os esferóides para assentar no fundo do tubo de microcentrífuga. Esferóides deve ser visível a olho nu.
- Misturar 100 mL de materiais de membrana basal com 100 ul de frio (4 ° C) colagénio do tipo I, em um tubo pré-refrigerada separada. Manter-se a mistura a 4 ° C para evitar qualquer gel solidifique prematuramente.
- Utilize pontas de pipetas pré-refrigerados se transferir pequenos volumes.
- Dê cuidado aomisturando o material de membrana basal e colágeno tipo I para evitar a formação de bolhas de ar. Nota: As bolhas de ar podem dificultar a imagiologia mais tarde no protocolo de se tornar incorporado no gel.
- Aspirar os esferóides a partir da porção inferior 40 ul do tubo de microcentrífuga, e combinar com o material da membrana basal / mistura de colagénio do tipo I. Tenha cuidado para evitar a formação de bolhas de ar quando a mistura. Nota: A solução contendo 100 ul de materiais de membrana basal, 100 ul de colagénio do tipo I, e 40 ul de esferóides criará material suficiente para 4 3D culturas independentes. Isto pode ser escalado para cima ou para baixo.
- Pipetar 40 ul de gotas da mistura viscosa para os centros das cavidades de uma placa de 24 poços. Manter o nível de placa para evitar que a mistura de correr para o lado do poço. Nota: Uma coluna única na placa de 24 cavidades - 4 poços - é recomendado para cada condição a ser testado.
- Colocar a placa intoa 37 ° C incubadora e deixar em repouso por 30 min. A cultura 3D irá polimerizar durante este período.
- Lentamente submergir as culturas 3D em 1 mL de meios de cultura celular.
- Certifique-se de que a mídia está quente ao adicioná-lo nos poços para promover ainda mais a polimerização gel.
- Passo crítico: Delicadamente adicionar a mídia para as culturas 3D. Pipetando os meios muito rapidamente nas cavidades pode levar ao descolamento das culturas em 3D a partir da superfície da cultura de tecidos.
3. Monitoramento e Análise Spheroid Invasion
- Invasão imagem dos esferóides na matriz 3D circundante em pontos de tempo decidido pelo investigador. Adquirir fotografias usando um microscópio invertido com a lente objetiva de 20x. Nota: Ideal pontos de tempo irá variar de acordo com a linha de células que está sendo testado. Linhas de células mais invasivos começará sua saída dos esferóides logo após o plaqueamento e, portanto, levar fotografia inicials dentro de um par de horas após o plaqueamento. Geralmente, as fotografias são tiradas a 0 h (após o plaqueamento), 24 horas e 48 horas. Invasão conclui tipicamente de 24 a 48 h após o plaqueamento.
- Quantificar a capacidade invasiva utilizando software de análise de imagem como Imagem J.
- Analise invasão celular como a distância a partir da borda do esferóide.
- Use a ferramenta straight draw para marcar o raio e / ou a distância máxima invasiva.
- Clique em "Analisar" no menu superior e clique em "Measure" para exibir a medição do comprimento.
- Analisar invasão como a área total invasiva fora do esferóide.
- Use a ferramenta de desenhar à mão livre para traçar a fronteira do esferóide e / ou total área invasiva.
- Clique em "Analisar" no menu superior e clique em "Measure" para exibir a medição da área.
- Use um plugin como ROI Ferramentas do Gerenciador de criar medidas para uma pilha de imagens.
- Analise invasão celular como a distância a partir da borda do esferóide.
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Representative Results
Usando o ensaio de invasão esferóide (figura 1), um painel de linhas celulares de cancro foi testado quanto à sua capacidade para formar esferóides, bem como para a quantidade de egresso de células expostas após o implante numa matriz 3D que consiste em materiais de membrana basal e colagénio tipo I (Tabela 1). Estes resultados demonstram que nem toda linha celular de cancro criará esferóides bem formadas, onde as linhas de células que possuem uma morfologia epitelial in vitro, tenderam a produzir agregados regulares e lisas. A capacidade das diferentes linhas de células para invadir no ensaio também foi variável. As linhas de células que são estabelecidos como sendo invasivo como 4T1, E0771, e U-87 MG exibiu um elevado grau de saída esferóide no ensaio. Linhas celulares menos agressivos, como o MCF-7, BT474, e MCF10DICS.com não invadir, como era esperado. Inesperado, no entanto, foi a falta de invasão exibida pelo A-431 e 357 células COLO PL. Um exemplo dos dados para alguns deleslinhas é mostrado (Figura 2). Para células 4T1 e E0771, invasão já foi pronunciada 24 horas após a incorporação de esferóides no interior da matriz 3D e, por L-87 mg, invasão iniciado directamente após o implante no interior da matriz.
A avaliação qualitativa da invasão celular pode ser reforçada com a quantificação no software de análise de imagem. Duas estratégias diferentes para quantificar a extensão da invasão estão incluídos (Figura 3), e a estratégia escolhida depende do tipo de invasão testemunhado. Em ImageJ, distância invasivo ou invasivo área é demarcada primeiro usando ferramenta de desenho do software, após o qual os valores comparativos são gerados como medições de pixel. As imagens de microscopia pode ser importado como uma pilha para permitir a aquisição de dados mais eficientes, mas, se isso, um plugin como ROI Ferramentas do Gerenciador é recomendado para facilitar a medição eficiente.
| Linha celular | Tipo de câncer | Capacidade-Formando Sphere | Ensaio de invasão | |
| 4T1 | Mamário | Rato | +++ | ++ |
| A-431 | Epidermóide | Humano | +++ | - |
| BT-474 | Peito | Humano | ++ | - |
| COLO 357 PL | Pâncreas | Humano | ++ | - |
| E0771 | Mamário | Rato | +++ | +++ |
| LNCaP | Próstata | Humano | + | - |
| MCF-7 | Peito | Humano | +++ | - |
| MCF10DCIS.com | Peito | Humano | ++ | - |
| MDA-MB-231 | Peito | Humano | - | ? |
| PANC-1 | Pâncreas | Humano | + | ++ |
| PC-3 | Próstata | Humano | - | ? |
| SK-BR-3 | Peito | Humano | - | ? |
| U-87 MG | Glioblastoma | Humano | +++ | +++ |
Tabela 1:. Sphere-formação e invasão por diferentes linhas de células As linhas celulares testados são pontuados de acordo com a sua capacidade de formação de esfera e invasão.
Figura 1:. Fluxo de trabalho visual do ensaio de invasão esferóide esferóides são geradas em gotas de meios que pendem a partir da tampa de uma placa de cultura de tecido durante 72 horas. Em seguida, as gotas são misturadas, e os esferóides são transf errou a uma mistura de 4 ° C de materiais de membrana basal e colágeno tipo I. Após ressuspensão esferóide, a mistura viscosa é pipetada para os poços de uma placa de 24 poços, após o que é determinada 30 minutos a 37 ° C para solidificar numa cultura 3D. Meios quente é então adicionado aos poços. Saída celular a partir dos esferóides é então monitorizada ao longo do tempo.
Figura 2:. Exemplo de dados de ensaio O 4T1, E0771, e U-87 MG de células mostram a invasão a partir dos esferóides Considerando que a A-431 e células MCF-7 não. Invasão de U-87 células é mais pronunciado após 24 h, enquanto invasão máximo pelas células 4T1 e E0771 ocorrer mais tarde. Para o E0771 mais invasivas e L-87 linhas celulares mg, saída de célula aparece para compensar o aumento do tamanho do esferóide de outro modo observado com as linhas menos invasivos. Barra de escala, de 200 mm.om / files / ftp_upload / 53409 / "target =" _ blank 53409fig2large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. A quantificação da invasão da invasão pode ser quantificado por análise de imagem, por exemplo, usando o software Image J.. (a) Cálculo de invasão como uma função da distância mais longa invasivo que emana do esferóide. (b) Área total invadido por células que saem do esferóide. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este estudo foi avaliado o desempenho de um painel de linhas celulares de cancro em um ensaio de invasão esferóide (Tabela 1). De um modo geral, descobrimos que a formação do esferóide é aumentada em mais as linhas de células epiteliais de aspecto, em que a presença de junções célula-célula promove a formação de uma arquitectura do tipo esferóide. Linhas celulares conhecidas que foram submetidos a uma transição epitelial-mesenquimal, tais como MDA-MB-231 não formar esferóides na cultura de gota suspensa muito provavelmente, devido à sua reduzida E-, N- e P-caderina expressão 16.
Algumas das etapas do ensaio de invasão esferóide requerem uma estreita adesão ao protocolo. É absolutamente crítico para trabalhar rapidamente quando pipetando a mistura da membrana basal e colágeno, e é crucial que se mantém a mistura de perto de 4 ° C, enquanto trabalhava como ele vai começar a solidificar à temperatura ambiente. Além disso, as preparações de colagénio solúveis são ácidos, e são induzidas para o gel por Additde iões de uma pequena quantidade de hidróxido de sódio e sal, seguido por aquecimento a 37 ° C. Nas nossas mãos, simplesmente misturando volumes iguais de colagénio com os materiais de membrana de base torna-gel competente mediante aquecimento porque o componente da membrana basal é capaz de neutralizar o colagénio. Se proporções menores de membrana basal: colagénio são planeadas, o colagénio deve ser neutralizada antes de se adicionar a mistura da membrana basal para facilitar a polimerização. Uma vez formada, a maioria dos esferóides são resistentes a dissociação e re-suspensão em sobreviverão esta mistura viscosa que compreendem a cultura 3D. Durante os passos de ressuspens, também deve exercer um cuidado para restringir a formação de bolhas de ar, uma vez que estes podem impedir imagiologia. Quando a adição de meio de cultura aos poços após o gel solidificado, é importante que um pipetas lentamente para evitar as culturas em 3D a partir de separar a partir do prato.
A saída de células cancerosas na matriz 3D envolvente é generally correlacionada com a capacidade invasiva das linhas, em que o E0771 e U-87 MG de células demonstraram o mais invasão no painel de linhas celulares aqui examinados (Figura 2). Interessantemente, estas duas linhas também exibem diferentes modos de invasão. Considerando que as células E0771 invadir de forma gradual e coletiva, as células MG U-87 exibir saída individual e rápida dos esferóides. O ensaio de invasão de esferóides permite, assim, um para comparar os diferentes modos utilizados por linhas a invadir o substrato.
Diferentes métodos de análise de invasão são apresentados na Figura 3 e o modo preferido de análise pode depender do modo de invasão. Independentemente do tipo de análise utilizado, este ensaio foi concebido para permitir a quantificação da invasão rápida de um grande número de esferóides. O agrupamento dos esferóides em uma mistura de cultura 3D, e, em seguida, alíquotas desta mistura para criar 4 culturas replicadas independentes, leva à estabeshment de múltiplos esferóides que pode ser monitorizado para uma dada condição experimental (Figura 1). O ensaio é, portanto, facilmente alteráveis à comparação estatística devido ao grande potencial de "n", e o fenótipo compartilhado por esferóides do mesmo tipo parece exibir variação mínima. Note-se que as linhas celulares menos agressivos como células BT-474 e MCFDCIS formar esferas compactas, lisas que têm um tamanho muito menor do que as linhas mais agressivas. Como conseqüência, durante a semeadura de células inicial para as gotas de suspensão, o número de células de partida deve ser ajustado em conformidade.
Algumas linhas de células metastáticas realizada contra as expectativas e não apresentam um comportamento invasivo neste ensaio. Exemplos notáveis incluem a A-431 e as 357 células COLO PL. É possível que a falta de invasão exibida por estas linhas é devido ao tipo de substrato ECM que os esferóides foram incorporados em. De facto, outros demonstraram que o mate membrana basalriais (por exemplo Matrigel) e colágeno pode ter efeitos diferentes sobre a invasão das células 17, talvez devido às diferentes exigências de metaloproteases de matriz para a migração 18. Assim, ajustando a proporção de colagénio: os materiais de membrana basal é uma outra maneira de modificar os resultados do ensaio, onde a redução do componente de material de membrana basal a um terço do total da mistura, desse modo permitindo um aumento na quantidade de colagénio, pode aumentar ainda mais a invasão pelos alguns tipos de células. Esta ideia é exemplificada em um estudo recente que encontrou uma correlação positiva entre a capacidade invasiva de Organóides mamárias eo número de colágeno tipo I fibrilas presente, onde a formação de fibrilas de colágeno foi promovido através do alargamento do 4 ° período C pré-incubação de pH neutralizado colágeno 19.
A descoberta de que algumas linhas celulares actuado ao contrário das expectativas mostra algumas das limitações deste ensaio. Apesar de invasão de células de câncer de monitoramento para fora ofa esferóides numa mistura que consiste em 3D do colagénio e da membrana basal materiais é mais fisiologicamente relevante do que um ensaio de motilidade 2D, é ainda um sistema modelo que omite algumas complexidades biológicas de outra forma encontrados in vivo. Por exemplo, a capacidade metastática pode ser modulada pelas diferentes microambientes que suportam o crescimento do tumor vs. ortotópico ectópica 20 e, como tal, é importante reconhecer que uma variedade de factores do estroma podem influenciar profundamente o processo metastático. Um certo número destes factores estão ausentes no ensaio de invasão aqui apresentados e pode explicar alguns dos inconsistências observadas.
Em resumo, o ensaio de invasão de células de cancro esferóide aqui apresentada fornece uma estrutura flexível para monitorizar invasão em uma configuração biologicamente relevante, suporta a descoberta de mecanismos de invasão de células, e pode potencialmente auxiliar no desenvolvimento de terapias anti-metastáticos novos.
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Acknowledgments
Financiado pelo NIH CA051008 subvenções P30 CA009686 e T32 (ATR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Matrigel Growth Factor Reduced | Corning | CB-40234 | |
| Collagen Type I, Rat Tail, 100 mg | Millipore | 08-115 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| 100 mm TC-treated Dishes | Corning Incorporated | 430167 | |
| 24-well TC-treated Plates | NEST Biotechnlology | 702001 | |
| Olympus IX-71 Inverted Microscope | |||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and LNCaP cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
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