Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (α-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of α-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.
Alpha-synuclein (α-syn) protein rigeligt udtrykt primært inden for neuroner og findes i en række forskellige former – monomerer, tetramerer, oligomerer og fibriller. Under sygdom, α-syn undergår konformationelle ændringer til dannelse af oligomerer og højmolekylevægtsaggregater, der har tendens til at gøre proteinet mere uopløselige. Unormalt aggregeret α-syn er en neuropatologiske træk ved Parkinsons sygdom (PD), demens med Lewy organer (DLB) og multipel-system atrofi (MSA). Biokemisk karakterisering og analyse af uopløselige a-Syn ved hjælp buffere med stigende vaskemiddel styrke og høj hastighed ultracentrifugering giver et kraftfuldt værktøj til at bestemme udviklingen af α-syn patologi forbundet med sygdomsprogression. Denne protokol beskriver isoleringen af stadig mere uopløseligt / aggregeret α-syn fra post mortem menneskelige hjerne væv. Denne metode kan tilpasses med ændringer til studier af normal og unormal α-syn biologi i transgene dyremodeller huser forskellige a-syn mutationer såvel som i andre neurodegenerative sygdomme, der er udstyret afvigende fibrillære aflejringer af proteiner relateret til deres respektive patologier.
Et af de vigtigste patologiske træk fælles blandt flere neurodegenerative sygdomme er dannelsen af unormale proteinaggregater der forekommer i et protein / sygdom specifik måde 1. Der er således de karakteristiske extraneuronal amyloid-beta plaques og aggregerede hyperphosphoryleret Tau-indskud inden neuroner i Alzheimers sygdom (AD); de aggregerede a-syn indskud i Lewy Bodies (LBS), som er intraneuronale inklusioner, og også inden for dystrofiske neuronal processer kaldet Lewy neuritter (LNS) i PD, PD demens og demens med Lewy organer (DLBs) 2-4. Unormale a-syn aflejringer ses også i kendetegnende læsioner af gliøse cytoplasmatiske inklusioner i MSA 5. I Huntingtons sygdom, er der de karakteristiske Poly-Q indlån, og unormal Tar DNA-bindende protein-43 og sammensmeltet i sarkom proteiner (FUS) er deponeret i frontotemporal demens. Vigtigere for PD, har α-SYN genmutationer vist sig at cauSE autosomal dominant PD 6-11. Derudover α-SYN gen triplication 12 og dobbeltarbejde 13 forårsager også familiær PD dermed forbinder øget α-syn udtryk for de patomekanismer af PD. Især både sporadiske og familiær PD sager harbor unormale aflejringer af α-syn patologi 14. Nuværende tilgængelige behandlinger for PD kun er palliativ og har ingen effekt på at standse eller forsinke den ubønhørlige sygdomsprogression.
α-syn er rigeligt udtrykt i den menneskelige hjerne og udgør omkring 1% af den totale hjerne protein. Det er til stede mere specifikt inden for neuronerne, men kan eksistere end i lavere mængder inden gliaceller. Et omstridt punkt er den native struktur α-syn, som kan eksistere som en tilfældig monomer 15 eller som et foldet tetramer 16. Under sygdom, α-syn ændrer sin konformation, der gør det muligt at få misfoldet og denne proces menes at være årsag til sygdommen pathogeNesis. Trods flere års undersøgelser af patofysiologiske aspekter af α-syn og sygdom, har de nøjagtige årsager til sygdomsmekanismer forblevet undvigende 14.
Undersøgelser med post-mortem analyse af Parkinson hjerner har hidtil forudsat vigtige spor om normal og unormal biologi α-syn i både sporadisk PD og også PD i forbindelse med mutationer i LRRK2 genet 17-22. Her er en biokemisk ekstraktion protokol (se skema vist i figur 1) for stadig uopløselige a-syn indskud fra human post mortem PD hjernevæv, som skjuler α-syn aggregater i varierende grad blevet beskrevet. Denne teknik kan også tilpasses med modifikationer i puffersammensætninger at studere aggregerede proteiner fra andre neurodegenerative sygdomme 23,24 og også fra transgene dyr hjernevæv 25-27. Den vigtigste overvejelse for tilpasningerne er forskellene i solubiheden og de samlede mængder af de respektive proteiner nogle af dem er primært kernekraft og kan have behov for høj-salt buffere for optimal udsugning som vist for FUS 28.
Denne artikel beskriver en biokemisk protokol for ekstraktion og undersøgelse af forskellen opløselighed egenskaber monomere, oligomere og aggregeret α-syn fra syge hjerner ved hjælp af denaturerende gel driftsforhold. Dette er en veletableret teknik til at undersøge aggregerede α-syn 17, 18, 20, 21 et protein, der normalt er opløseligt i dets native form, men få amyloidogene eller forøgede aggregationsegenskaber med sygdomsprogression eller med genetiske mutationer. Ikke desto mindre har nogle grupper anvendt små variationer i SDS-koncentrationer i deres buffere (8% eller 10% i stedet for 5%) 21,22, 30. SDS er en anionisk detergent og opløser α-syn oligomerer, der kan omfatte membranbundne former af α-syn, mens urinstof, en kaotropisk reagens denaturerer de uopløselige aggregerede og fibrillære eller amyloidogene former for α-syn 20. I denne henseende en systematisk undersøgelse af Paleologou et al 31 undersøgte stabilitetaf a-syn oligomerer og fibriller med varierende koncentrationer af urea (6,5 – 8 M) eller SDS (0,25-2%) og rapporterede, at oligomerer stabile i SDS-koncentrationer, men ikke ved høje koncentrationer af urinstof. Deres FILA-1-antistof, der er specifikt for a-syn oligomerer og fibriller påvist højere koncentrationer af fibriller på 6,5 M urinstof koncentrationer under ikke-denaturerende betingelser. De buffer anvendte koncentrationer i denne protokol nøje afspejler det, der er beskrevet i Culvenor et al. (1999) 32.
De anatomiske områder af hjernen for biokemisk udvinding af uopløseligt α-syn bør nøje udvalgt, og dette bør afspejle α-Syn LB og LN belastning afhængig af sygdomsprogression 33,34. Sagerne her anvendes, er basalganglierne prøver fra neocorticale og limbiske undertyper af PD afspejler sene og mellemliggende stadier af PD progression i henhold til McKeith ctriteria 34. På Queen Square Brain Bank, den ene halvdel af hjernen errutinemæssigt fikseret i formalin til histokemisk analyse og den anden halvdel er omhyggeligt dissekeret i forskellige anatomiske områder og lynfrosset og opbevaret ved -80 ° C frysere til yderligere biokemiske og DNA undersøgelser / RNA-analyse. Efter formalin fiksering af hjerne og dissektion ved neuropathologists er immunhistokemi udføres ved hjælp α-SYN antistof og resultater arkiveret. Også som en rutinemæssig procedure, er pH af hjernevæv målt ved ankomsten som et mål for agonal tilstand af hjernevæv. Dette danner et solidt grundlag for kvaliteten af væv bevaring for biokemisk analyse.
Vore data viser her, at der er flere SDS opløselige α-syn monomer i PD tilfælde sammenlignet med kontroller; navnlig neocortical PD tilfælde har højere α-syn belastning i forhold til det limbiske PD sort. De neocorticale tilfælde repræsenterer en større progression af PD α-syn patologi i neocorticale regioner såsom frontale og parietale corsis 33,34. Det limbiske PD sager har højere LB scores i den basale forhjerne / limbiske områder områder såsom amygdala, transentorhinal og cingulate regionerne. For meningsfyldt data og statistisk analyse, må man køre mindst 4 sager fra hver kohorte. Ligeledes har vi ikke forsøgt statistisk analyse af blottet data, der præsenteres her.
Det skal også bemærkes, at forskellige antistoffer kan genkende forskellige former / sammensætning højere ordens a-Syn oligomerer og hver kan have sin egen relative følsomhed og præferencer. Det fremgår af resultaterne af Tong et al. 29, hvor de viser, at 4 forskellige a-syn antistoffer (Syn-1, SS, Onco og LB509) giver udskiftelige resultater i det mindste for a-syn oligomerer / aggregater. De α-SYN monomerer blev anerkendt i tilsvarende grad af alle 4 antistoffer, selv om disse kan have variation alt efter om α-syn antistofepitop ligger enten i den N-terminale eller Cterminale 29. Tilsvarende specifikke antistoffer for phospho-alpha synuclein bestemme særskilte høj molekylvægt α-synuclein arter 20,21. I protokollen beskrevet her, har den meget karakteriseret antistof Syn-1 er blevet anvendt 19-21.
Det er imidlertid vigtigt at overveje validering nye antistof på western blots gennem antistof præadsorption eksperimenter og også overekspression og knockdown af proteinet i celler.
Det er vigtigt at overveje andre variationer, der er blevet anvendt af forskere til at bestemme mindre fragmenter af a-syn og eller ustabile tetramere a-syn former. Dette kunne omfatte mild fiksering af membraner med 0,4% PFA i PBS for at bevare trunkerede former af α-syn 35 eller behandling af prøven homogenater med tværbindere at stabilisere tetramerer 36.
Nøjagtig biokemisk evaluering af proteiner ved hjælp af post mortem-tissue kræver minimering af enzymatisk proteinnedbrydning og modifikation. Det er derfor tilrådeligt at bruge væv med de korteste post mortem forsinkelser og / eller vælg matchede prøver inden for de case-kohorter. Immunohistokemi ved hjælp af standard antistoffer til α-syn immunhistokemi skal udføres før start isolation protokollen. Omfanget af α-syn patologi er meget variable og kan variere alt efter regioner udvalgt. Det er tilrådeligt at vælge regioner med rigelige patologi som en positiv kontrol for optimal udbytte med hvert løb. Anvendelsen af proteasehæmmere og om nødvendigt phosphataseinhibitorer at forhindre uønsket enzymatisk nedbrydning efter frigivelsen af intracellulære proteaser eller phosphataser, der opstår under cellelysis og vedligeholdelse af prøverne ved 4 ° C er afgørende.
Det er vigtigt, at alle prøverne inden for batch af eksperimenter håndteres jævnt og konsekvent at undgå intra-user variationer; multiple frebør undgås eze-tø-cykler, da dette potentielt kan trække post-translationelle modifikationer såsom phosphorylering. En kritisk punkt at huske på, når behandlingen af en lang række prøver er, at data fra immunoblots bør være normaliseret til en prøve, der skal køre sideløbende med alle andre prøver på geler og alle data, der henvises til denne prøve. Dette gøres for at sikre normalisering af immunoblot data mellem flere blots. Det er den metode, der blev vedtaget i vores seneste undersøgelse 22.
Det skal bemærkes, at for at holde baggrunden ECL lav, blottene bør ikke have lov til at tørre ud på noget tidspunkt under western blot-protokollen. Desuden bør meget lange eksponeringer (> 10 min) på autoradiografi film undgås, da dette vil føre til mætning af ECL-signalet og vil føre til unøjagtige kvantificering.
Denne ovennævnte protokol er en forholdsvis enkel teknik ved hjælp af fælles laboratoriereagenser og iinstrumenter og kan være et værdifuldt værktøj til at undersøge patofysiologien af α-syn protein i PD forskning. Denne metode kan ikke kun forlænges med passende modifikationer til studiet af α-syn biologi i a-SYN transgene dyr, men også for andre neurodegenerative sygdomme featuring unormale aflejringer af aggregerede proteiner såsom AD, MSA, DLB, HD og frontotemporaldementias. Men Western blot data beskrevet her kunne også valideres ved hjælp enzymkoblede immunosorbentassays hjælp antistoffer til særlige former for α-syn 31.
The authors have nothing to disclose.
I thank Dr Adamantios Mamais for extracting α-synuclein from human tissue and running of blots. This work was supported in part by a MRC Grant (MR/L010933/1) and in part by the Wellcome Trust/MRC Joint Call in Neurodegeneration award (WT089698) to the UK Parkinson’s Disease Consortium (UKPDC) whose members are from the UCL Institute of Neurology, the University of Sheffield and the MRC Protein Phosphorylation Unit at the University of Dundee. RB received funding from MJFox foundation for this work and is also funded by the Reta Lila Weston Trust.
Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
SDS | Fluka | 71727 | |
Urea | Sigma | U5378 | |
Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
Tween-20 | Sigma | P9416 | |
NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
Instrument | Company | Rotor/ model no | |
Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |