Abstract
Alfa-sinucleína (α-syn) proteína é abundantemente expresso principalmente nos neurónios, e existe num número de formas diferentes - monómeros, oligómeros, tetrâmeros e fibrilas. Durante a doença, α-syn sofre alterações conf ormacionais para formar oligómeros e agregados de peso molecular elevado que tendem a tornar a proteína mais insolúvel. Anormalmente agregada α-syn é uma característica neuropatológica da doença de Parkinson (DP), demência com corpos de Lewy (DLB) e atrofia de múltiplos sistemas (MSA). Caracterização e análise de buffers usando Syn-ct insolúveis com o aumento da força do detergente e ultracentrifugação alta velocidade Biochemical proporciona uma ferramenta poderosa para determinar o desenvolvimento da patologia α-syn associada com a progressão da doença. Este protocolo descreve o isolamento de cada vez mais insolúveis / agregado α-syn partir de tecido de cérebro humano post-mortem. Esta metodologia pode ser adaptada, com modificações para estudos de α normal e anormalbiologia -syn em modelos animais transgénicos que albergam diferentes mutações Syn-ct, bem como em outras doenças neurodegenerativas que apresentam depósitos de proteínas fibrilares aberrantes relacionadas com as respectivas patologias.
Introduction
Uma das características patológicas comuns fundamentais entre várias doenças neurodegenerativas é a formação de agregados de proteínas anormais que ocorre numa proteína / doença modo específico 1. Assim, existem as características de placas de amilóide-beta e extraneuronais depósitos agregados tau hiperfosforiladas dentro de neurónios na doença de Alzheimer (AD); os depósitos syn-alfa agregados em Lewy Corpos (LBS), que são inclusões intraneuronais, e também no âmbito de processos distróficos neuronal chamado Lewy neurites (LNs) em PD, PD demência e demência com corpos de Lewy (DLBs) 2-4. Depósitos syn-alfa anormais também são vistas nas lesões da indicação de inclusões citoplasmáticas gliais em MSA 5. Na doença de Huntington, existem os depósitos de poli-Q característicos, e de ligação de ADN anormal Tar-43 e proteína fundidas em proteínas de sarcoma (FUS) são depositados na demência fronto-temporal. Importante para a DP, mutações no gene α-syn foram encontrados para cause autossômica dominante PD 11/06. Além disso, o gene triplicação α-syn 12 e 13 também causa a duplicação PD familiar ligando deste modo o aumento da expressão α-syn para os patomecanismos de PD. Notavelmente, casos de DP tanto esporádica e familiar abrigar depósitos anormais de α-syn patologia 14. Atuais tratamentos disponíveis para PD são apenas paliativos e não têm nenhum efeito sobre como travar ou atrasar a progressão da doença inexorável.
α-syn é expressa abundantemente no cérebro humano e torna-se cerca de 1% da proteína total do cérebro. Ela está presente, mais especificamente, dentro dos neurônios, mas pode existir embora em quantidades menores dentro das células gliais. Um ponto controverso é a estrutura nativa de α-syn que pode existir como um monómero ou aleatória 15 como um tetrâmero dobrado 16. Durante a doença, α-syn muda a sua conformação que lhe permite obter misfolded e este processo é pensado para ser a causa da doença pathogenesis. Apesar de vários anos de investigações sobre os aspectos fisiopatológicos da α-syn e da doença, as causas exatas da doença mecanismos permaneceram indescritíveis 14.
Estudos utilizando análise post-mortem dos cérebros de Parkinson têm até agora forneceu pistas importantes sobre a biologia normal e anormal de ambos em PD esporádica e também syn-α PD associado com mutações no gene LRRK2 17-22. Aqui, um protocolo de extracção bioquímica (ver esquema apresentado na Figura 1) para depósitos de syn-ct cada vez mais insolúveis no período de pós-mortem de tecido PD cérebro humano que abrigam agregados α-syn em diferentes graus tem sido descrita. Esta técnica também pode ser adaptada, com modificações em composições de tampão para estudar proteínas agregadas a partir de outras doenças neurodegenerativas 23,24 e também a partir de tecido cerebral animal transgénico 25-27. A principal consideração para as adaptações são as diferenças de solubilidade e os montantes totais das respectivas proteínas, algumas das quais são principalmente nuclear e pode precisar de buffers de elevado-sal para a extração ideal como mostrado para FUS 28.
Protocol
Tecido cerebral post-mortem foi doado para Queen Square Cérebro Banco para doenças neurológicas, University College London, Institute of Neurology utilizando protocolos e eticamente aprovados armazenada para a investigação sob uma licença emitida pela autoridade de tecido humano (HTA) Reino Unido (n. 12198). Veja a lista dos casos usados para este protocolo (Tabela 1).
1. Preparação de buffers
- Prepare 1X TBS (solução salina Tris) buffer:
- Prepare 10X TBS como solução de reserva com 500 mM Tris-HCl pH 7,4 e 1500 mM de NaCl.
- Pesar 60,5 g de Tris-Cl pH 7,6 e 87,6 g de NaCl em 800 ml de água de elevada pureza. Ajustar o pH com HCl 1 M e perfazer o volume final para estoque 1 L.
- Preparar a concentração final de 1X TBS, diluindo o estoque 10 vezes em água destilada.
- Adicionar inibidores de protease (PI), (1 comprimido por 50 ml de tampão) e Fos-stop comprimidos de inibidor de fosfatase (1 comprimido por 10 ml de tampão) arevogar os efeitos das ações enzimáticas não-específicas de proteases e fosfatases.
Nota: Aqui, utilizamos a enzima inibidor comprimidos de Roche, mas igualmente outros inibidores disponíveis comercialmente podem ser utilizados de acordo com as instruções do fabricante.
- Prepare 10X TBS como solução de reserva com 500 mM Tris-HCl pH 7,4 e 1500 mM de NaCl.
- Preparar tampão TBS-SDS por adição de 5% w / v de dodecilsulfato de sódio (SDS) a 1X TBS (pH 7,4) tampão. Aquece-se a solução a 60 ° C com agitação constante usando um agitador magnético para solubilizar SDS.
- Preparar tampão TBS-SDS-ureia, adicionando ureia a uma concentração final de 8 M w / v de tampão TBS 1X-SDS (pH 7,4). Aquece-se a solução a 60 ° C com agitação constante num agitador magnético para dissolver a ureia.
2. A homogeneização da amostra e Ultracentrifugação Diferencial
Nota: A parte seguinte do trabalho envolve a manipulação de tecido cerebral humano de acordo com as regras da HTA Reino Unido. Procedimentos operacionais padrão locais são seguidos em todos os times. Amostras do cérebro são dissecados a partir de blocos de cérebro congeladas e material de tecido homogeneizado num microcabinet mantido a pressão negativa. Vestidos de luvas descartáveis, máscaras, face-over-sapato protetores e óculos de segurança são usados durante todo o procedimento. Resíduos de tecidos humanos é descartado após a autoclavagem a 121 ° C durante 20 minutos para a eliminação segura. Sharps (lâminas de bisturi) estão dispostos em um recipiente apropriado apropriado para contenção e eliminação segura.
- Pegue um pedaço de tecido humano congelado (cerca de 0,5 g no peso da região gânglios basais) e mediu-se rapidamente em pequenos fragmentos (aproximadamente 1 mm 2) em gelo usando um pequeno petri-prato e uma lâmina de bisturi estéril. Use uma placa de petri separada e lâmina de bisturi para cada amostra. Recolhe-se o tecido moído num tubo de 15 ml e adicionar 10 volumes de tampão arrefecido com gelo 1XTBS ao tubo.
- Homogeneizar as amostras utilizando um homogeneizador mecânico a 20.000 rpm durante 10 segundos. Arrefecer em gelo durante 2 min. Repita este passo três vezess.
Nota: Isso é feito de modo a que as amostras não são aquecidos durante a homogeneização. - Clarificar por centrifugação a 1000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar pelete de material não homogeneizado.
- Tome sobrenadante (homogeneizado bruto), adicione a tubos de centrífuga de policarbonato (tamanho do tubo depende do tamanho do rotor) e equilibrar cuidadosamente. Centrifugar a 100.000 xg durante 1 h a 4 ° C.
- Reter sobrenadante como esta é a fracção solúvel em TBS.
- Lave o peletizado duas vezes em cinco volumes de tampão 1X TBS e centrífuga cada vez a 100.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
- Ressuspender o sedimento final a pelota por sonicação durante 10 segundos a 20 KHz em cerca de 5 volumes de TBS 1X-SDS a RT.
Nota: Antes da adição das amostras de tampão contendo SDS deve ser levado a 10 ° C para evitar a precipitação de SDS. - Ultracentrífuga a 100.000 xg durante 30 min a 25 ° C.
- Ressuspender o sedimento final a pelota por sonicação durante 10 segundos a 20 KHz em cerca de 5 volumes de TBS 1X-SDS a RT.
- Reter sobrenadante como este é the SDS fracção solúvel.
- Lave o peletizado duas vezes em 5 volumes de tampão de TBS 1X-SDS a RT. Centrifugar cada vez a 100.000 xg durante 15 min a 25 ° C.
- Solubiliza-se o sedimento final em 50 ul de tampão TBS-1X SDS-ureia usando um sonicador ajustada a 20 KHz durante 10 segundos para atingir a solubilização completa; este é denominado a fracção solúvel em ureia.
- Dosear cada fracção para teor de proteína total utilizando um kit de ensaio de proteínas comerciais de acordo com o protocolo do fabricante. Diluir as amostras de TBS-SDS-ureia 1: 1 com tampão 1X TBS para permitir a compatibilidade com os reagentes de ensaio de proteína. Congelar as amostras em pequenas alíquotas (20 ul) a -80 ° C para reduzir os ciclos de congelamento e descongelamento.
Nota: A adição de glicerol a 10% para as amostras é recomendado para o armazenamento a longo prazo a -80 ° C.
3. Immunoblotting de amostras e os resultados da análise
- Executar a partir de amostras de TBS, TBS-SDS e extratos TBS-SDS-uréia em 10 poços 4-12% de gel de poliacrilamida Tris-Biscom MOPS como tampão de corrida usando técnicas padrão. Veja Gallagher e Chakravarti (2008) 29 para um protocolo de western blot detalhado.
- Carga de 10 ug de proteína de cada amostra em cada pista, juntamente com um marcador de peso molecular para TBS e SDS e as fracções de ureia.
- Executar gel a 200 V durante 1 h ou até que o corante azul de tampão de carregamento atingiu o fundo do gel.
- Proteínas a partir de geles de transferir electroforeticamente para membranas de nylon 28, pré-humedecido pela primeira vez em 100% de metanol e em seguida em tampão de transferência contendo 20% de metanol. Proporcionar uma marca de identificação no lado blot para determinar a proteína e a orientação dos marcadores de tamanho de peso molecular.
- Sandwich o gel com a membrana ao lado de papel de filtro húmido. A colocação correcta da membrana é crucial com a membrana entre o gel e o ânodo. Realize a transferência durante 2 horas a 40 V.
- Make up 1X PBS-tween (1X PBS-T) tampão: dissolver 1 comprimido de PBS em 200 mlágua, para se obter 0,01 M tampão fosfato, 0,0027 M de cloreto de potássio e cloreto de sódio 0,137 M, pH 7,4.
- Bloquear a membrana em solução de BSA a 5% em 1X PBS-T, durante 30 min com agitação a 70 rpm. Isto evita a ligação não específica do anticorpo primário para a membrana.
- Sondar a mancha de proteína com 6 ml de-α syn anticorpo primário SIN-1 (BD Biosciences; anticorpo monoclonal de ratinho) a 1: 750 de diluição (O / N a 4 ° C), seguido por uma série de lavagens com 1x PBS-T ( 3 x 5 min de cada vez) 28.
- Incubar a mancha com o conjugado de HRP apropriado anticorpo secundário de 1: 2000 de diluição durante 30 min. Executar uma série de lavagens (3 x 5 min de cada vez) com 1X PBS-T.
- Imergir blots em solução melhorada quimioluminescência durante 15 segundos num quarto escuro. Borrões Cubra com um filme plástico e coloque filmes autoradiografia contra a mancha com o lado proteína-se em uma fita à prova de luz para capturar os sinais apropriados (bandas de tamanho adequado).
- Desenvolver filmes auto-radiografia em um desenvolvedor automatizado.
Nota: As manchas também pode ser desenvolvido manualmente utilizando revelador e do fixador de uma fonte comercial no caso de uma máquina automatizada programador não está disponível.
- Incubar a Western blot com 6 ml de tampão de extracção de western blot, durante 10 min com agitação constante para remover a mancha de sinal do anticorpo syn-α. Siga as etapas de 3,43 até 3.6.2 usando beta-actina anticorpo primário (mouse monoclonal) a 1: 8000 diluição.
- Digitalizar e converter a imagem final em uma imagem TIFF e medir as densidades usando NIH ImageJ para fins de quantificação (um software de download gratuito).
Nota: O software permite a leitura das densidades de área relativa de interesse (as bandas de tamanho adequado) e os dados podem ser expressos como uma razão de α-syn densidade / β-actina (um gene de manutenção da casa) como unidades arbitrárias ou sobre quando a sua própria casa mantendo um gene não é válido (como no caso de amostras solúveis em ureia).
Representative Results
TBS, SDS e as proteínas extraídas a partir de ureia solúvel em gânglios da base, seguindo o protocolo mostrado na Figura 1 foram corridas em géis e imunotransferidas com o SIN-1 monoclonal de murganho α-syn anticorpo primário. As fracções solúveis em TBS apresentada a presença de monomérico α-SYN (~ 14 espécies kDa) nos casos de DP e de controlo examinados (Figura 2A). As fracções solúveis em SDS mostrou também abundante monomérica α-syn em todos os três subtipos de casos estudados como exibido na baixa exposição blot (Figura 2C). Os casos de PD também apresentaram maiores espécies de peso molecular (MW) SYN-alfa como pode ser visto no alto blot exposição, que são susceptíveis de ser oligômeros (Figura 2C). As frações solúveis de uréia a partir de casos PD mostraram valores elevados de monómeros syn-a, oligômeros e espécies agregadas comparadas para controlar casos. Os casos DP idiopática neocortical demonstrar maior quantidade de AGGREG espécies ated α-syn, enquanto os casos límbicas mostrar níveis intermediários de insolúvel α-syn. Ambos os SDS e uréia frações de casos DP idiopática demonstram níveis variáveis de produtos syn-alfa truncadas em 12 kDa e 6 kDa, conforme descrito 20. Em contraste, os casos de controlo não mostraram qualquer α-syn insolúvel ou agregados (Figura 2E). Medidas semiquantitativos densidade de reflectir a quantidade de carga de LB como categoriesd usando α-syn imunohistoquímica demonstra a natureza do agregado insolúvel α-SYN (Figura 2B, 2D, 2F), em casos de DP neocorticais e límbicas.
Figura 1. Diagrama esquemático do α insolúvel procedimento de extração -syn.rPegue = "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. immunoblots representativos de níveis -syn alfa de PD e controlar o tecido humano. TBS, SDS e as fracções solúveis de uréia a partir de gânglios basais (uma região que abriga α-syn patologia em casos PD) dos casos DP idiopática e neurologicamente normal (controle) cérebros foram analisados para a presença de α-syn utilizando imunotransferência de Western. 10 ug de proteína foi carregada sobre cada pista. Em TBS fracções (A), monómeros principalmente α-syn estão presentes em todos os casos. Em SDS fracções (C), alguns oligómeros de α-syn são vistos juntamente com monómeros principalmente no tecido PD. Em frações de ureia (C), monômeros, oligômeros e agregados α-syn são variavelmente expressas no casos de DP reflecting respectiva carga LB. As amostras de controlo neurologicamente normais mostram a presença de apenas pequenas quantidades de monomérico α-syn. Por favor note possíveis produtos de degradação de α-syn são vistas em alguns dos casos, com elevada carga de LB. A ponta de seta sólida representa a forma monomérica da α-syn. O *, possivelmente, representa uma forma truncada no terminal C de α-syn como previamente descrito 20,26. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Caso | Sexo | idade em anos de morte | atraso post-mortem (hrs) | pH de tecido |
| Neocortical 1 | M | 82 | 40 | 6.3 |
| Neocortical 2 | F | 75 | 35,3 | 6.4 |
| Límbico 1 | M | 81 | 28,5 | 6.2 |
| Límbico 2 | F | 79 | 36,5 | 6.2 |
| Controlo 1 | M | 80 | 38 | 6.1 |
| Control 2 | F | 83 | 32,5 | 6.3 |
Tabela 1. demografia limitada dos casos usados
Discussion
Este artigo descreve um protocolo de bioquímica para extração e análise das propriedades de solubilidade diferencial de monoméricos, oligoméricos e agregados α-syn de cérebros doentes usando desnaturação condições gel de funcionamento. Esta é uma técnica bem estabelecida para estudar agregada α syn-17, 18, 20, 21, uma proteína que é normalmente solúvel na sua forma nativa, mas obter propriedades de agregação amiloidogénicos ou aumentou com a progressão da doença ou com mutações genéticas. No entanto, alguns grupos usaram pequenas variações nas concentrações de SDS em respectivas memórias intermédias (8% ou 10%, em vez de 5%) 21,22, 30. O SDS é um detergente aniónico e solubiliza α-syn oligómeros que podem incluir formas de membrana ligada α-syn, enquanto a ureia, um reagente caotrópico desnatura as formas agregadas e fibrilares insolúveis ou amiloidogénicos de α-syn 20. A este respeito um estudo sistemático por Paleologou et al 31 examinaram a estabilidadee oligómeros de fibrilas com diferentes concentrações de ureia Syn-a- (6,5 - 8 M) ou SDS (0,25-2%) e relataram que concentrações de oligómeros estáveis em SDS mas não com concentrações elevadas de ureia. A sua Fila-1 anticorpo, específico para oligómeros e fibrilas de Syn-ct detectadas concentrações mais elevadas de fibrilas em 6.5 M concentrações de ureia em condições não desnaturantes. As concentrações de tampão utilizado no presente protocolo espelha o que tem sido descrito em Culvenor et ai. (1999) 32.
As regiões cerebrais anatômicas para a extração de bioquímica da insolúvel α-syn deve ser cuidadosamente selecionado e isso deve refletir carga LB e LN syn-α dependendo a progressão da doença 33,34. Os casos usados aqui são amostras dos gânglios da base dos subtipos neocortical e límbicas do PD refletem estágios finais e intermediários de progressão PD de acordo com McKeith ctriteria 34. No cérebro Banco Queen Square, uma metade do cérebro érotineiramente fixados em formol para análise histoquímica e a outra metade é cuidadosamente dissecado em diferentes regiões anatômicas e flash congelados e armazenados em freezers -80 ° C durante mais bioquímica e estudos de análise de DNA / RNA. Após a fixação de formalina dos cérebros e dissecção por neuropathologists, imuno-histoquímica é realizada utilizando anticorpo α-syn e resultados arquivados. Além disso, como um procedimento de rotina, o pH do tecido do cérebro é medida na chegada como uma medida do estado agonal do tecido cerebral. Esta constitui uma base sólida para a qualidade da preservação de tecido para análise bioquímica.
Os nossos dados apresentados mostram que há mais de SDS monómero solúvel α-syn em casos de DP comparação com os controlos; em particular os casos de PD neocortical tem maior carga α-syn comparados com a variedade PD límbico. Os casos neocorticais representar uma maior progressão da DP α-syn patologia nas regiões neocorticais tais como frontal e parietal CRcas 33,34. Os casos de DP límbicas têm maiores escores LB nas áreas frontais do cérebro basal / regiões límbicas tais como a amígdala, transentorrinal e as regiões do cíngulo. Para dados e análise estatística significativa, deve-se executar, pelo menos, 4 casos de cada coorte. Da mesma forma que não se tentou a análise estatística dos dados aqui apresentados blot.
Deve também notar-se que os anticorpos podem reconhecer diferentes formas diferentes / composição de ordem superior ct-syn oligómeros e cada um pode ter a sua própria sensibilidade relativa e preferências. Isto é evidente a partir dos resultados de Tong et al. 29, onde eles mostram que 4 anticorpos syn-alfa diferentes (SIN-1, SS, Onco e LB509) dão resultados mutáveis, pelo menos, para sin-alfa oligômeros / agregados. Os monómeros α-SYN foram reconhecidos em graus semelhantes por todos os 4 anticorpos embora estes podem ter variações dependendo de se o epitopo do anticorpo syn-α está localizado quer na extremidade N-terminal ou C-terminal 29. Do mesmo modo, anticorpos específicos para fosfo-alfa sinucleína determinar o peso molecular elevado distinta α-sinucleína espécies 20,21. No protocolo aqui descrito, o anticorpo altamente caracterizado SIN-1 tem sido usada 19-21.
No entanto, é importante considerar a validar qualquer novo anticorpo em transferências de Western com as experiências pré-absorção de anticorpos e também sobre-expressão e knockdown da proteína nas células.
É importante considerar outras variações que foram aplicados pelos pesquisadores para determinar fragmentos menores de formas alfa-syn e instáveis ou tetraméricas alfa-syn. Isto pode incluir fixação leve de membranas com 0,4% de PFA em PBS para manter as formas truncadas de α-syn 35 ou tratamento de homogenatos de exemplo com agentes de reticulação para estabilizar tetrâmeros 36.
Avaliação bioquímica de proteínas precisas usando post-mortem tissue requer a minimização da degradação enzimática e modificação de proteínas. Por isso, é aconselhável a utilização de tecido com os menores atrasos post mortem e / ou selecionar amostras pareadas dentro das coortes de casos. A imuno-histoquímica utilizando anticorpos para o padrão α-syn imunohistoquímica deve ser realizado antes de se iniciar o protocolo de isolamento. A extensão da patologia α-syn é altamente variável e pode variar de acordo com regiões seleccionadas. É aconselhável para selecionar regiões com patologia abundante como um controlo positivo para o rendimento ideal com cada corrida. O uso de inibidores de protease e inibidores de fosfatase, se necessário para prevenir a degradação enzimática indesejada após a libertação de proteases intracelulares ou fosfatases que ocorrem durante a lise celular e mantendo as amostras a 4 ° C é crucial.
É importante que todas as amostras dentro do lote de experiências são tratadas de maneira uniforme e consistente para evitar as variações intra-utilizador; fre múltiplaciclos eze-descongelação deve ser evitada, pois esta pode retrair potencialmente modificações pós-translacionais, tais como a fosforilação. Um ponto crítico para ter em conta quando se analisa um grande número de amostras é que os dados de imunomanchas deve ser normalizada para uma amostra, o qual deve ser executado em paralelo com todas as outras amostras sobre os géis, e todos os dados de referência para aquela amostra. Isto é feito para assegurar a normalização dos dados entre várias manchas de imunotransferência. Este é o método adotado em nosso estudo recente 22.
Deve notar-se que, a fim de manter o ECL de fundo baixo, as manchas não devem ser deixadas a secar fora em qualquer momento durante o protocolo de transferência de Western. Além disso, a exposição muito longas (> 10 min) em filmes auto-radiografia deve ser evitado pois isso irá conduzir à saturação do sinal de ECL e conduzirá a quantificação imprecisa.
Este protocolo acima é uma técnica relativamente simples, utilizando reagentes de laboratório comuns e emtrumentos e pode ser uma ferramenta valiosa para estudar a patofisiologia da proteína α-syn em investigação PD. Esta metodologia não só pode ser prorrogado com as modificações apropriadas para o estudo da biologia α-syn em animais transgênicos syn-alfa, mas também para outras doenças neurodegenerativas que caracterizam depósitos anormais de proteínas agregadas, como AD, MSA, DLB, HD e frontotemporaldementias. No entanto, os dados de transferência de Western aqui descrita poderia também ser validada utilizando ensaios de imunoabsorção enzimática, utilizando anticorpos específicos para as formas de α-syn 31.
Disclosures
O autor não tem nada a divulgar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris-HCL | Sigma | T5912 | |
| sodium chloride | VWR | 27800.291 | |
| SDS | Fluka | 71727 | |
| Urea | Sigma | U5378 | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 04 693 116001 | |
| Phosphatase inhibitor tablets | Roche | 04 906 837001 | |
| Phosphate buffered saline tablets | Sigma | P4417 | |
| Tween-20 | Sigma | P9416 | |
| NuPAGE MOPS SDS running buffer | Invitrogen | NP0001 | |
| NuPAGE transfer buffer | Invitrogen | NP0006-1 | |
| Hybond-P membrane | GE Healthcare | RPN303F | |
| Whatman 3MM filter paper | Sigma | WHA30306185 | |
| Bis-tris gels 4-12% | Invitrogen | NP0322BOX | |
| Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate | Pierce | 34080 | |
| Bio-RAD DC protein assay kit | Bio-Rad | 500-0112 | |
| Thickwall Beckman Polycarbonate tubes | Beckman | 355630 | |
| Western blot stripping buffer | Thermo scientific | 46430 | |
| Syn-1 primary antibody (mouse monoclonal) | BD Biosciences | 610786 | |
| beta-actin primary antibody (mouse monoclonal | Sigma | A5441 | |
| HRP cojugated goat anti-mouse secondary antibody | Santa Cruz | sc-2031 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | A7030 | |
| Instrument | Company | Rotor/ model no | |
| Benchtop Ultracentrifuge Optima Max | Beckman | MLA-80 | |
| Sonicator | Heat Systems | XL20-20 | |
| Homogeniser | Jenke and Kunkel | TP18/10 |
References
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