संस्कृति में कोशिकाओं के कार्य व्यवहार 3 आयामी संस्कृति वातावरण 16-21 की तरह विवो में और अधिक में संवर्धन द्वारा सुधार किया जा सकता है। इस पांडुलिपि में विवो तरह स्तनधारी टिशू कल्चर के लिए सेट अप और एक खोखला फाइबर बायोरिएक्टर प्रणाली के संचालन का वर्णन है।
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
टिशू कल्चर के विकास और / या कोशिकाओं है कि 100 से अधिक वर्षों 1,2 के लिए उपयोग किया गया है के रखरखाव के लिए एक स्थापित तकनीक है। का अध्ययन कोशिकाओं और प्रतिक्रियाओं पूर्व vivo की सुविधा तक, प्रयोगों कि अन्यथा यदि बेहद चुनौतीपूर्ण असंभव नहीं होगा की अनुमति के फायदों तक पहुंच गया है, उदाहरण के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर सेल लाइनों की पीढ़ी और उच्च throughput स्क्रीनिंग assays 3 में रिपोर्टर कोशिकाओं का उपयोग करें। अभी हाल ही में टिशू कल्चर में इन विट्रो मॉडल की पीढ़ी के लिए और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र को जन्म दिया है। इन आवेदनों के साथ, गतिशील 3-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों में रुचि काफी वृद्धि हुई है।
3 डी संस्कृति तरीकों (एक 3 डी संस्कृति सब्सट्रेट और / या दिशात्मक गतिशील प्रवाह की शुरूआत के रूप में यहाँ परिभाषित) बेहतर विवो सेलुलर पर्यावरण की वास्तुकला, एक को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण पुनरावृत्तिअधिक शारीरिक-तरह कार्य करते हैं। रोगग्रस्त और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत करने के उद्देश्य से निकालने, बड़े होते हैं, अंतर और प्रत्यारोपण की कोशिकाओं की क्षमता के अध्ययन के एक क्षेत्र रोगी लाभ और व्यावसायिक अवसर के लिए एक विशाल क्षमता है। उदाहरण के लिए जलता इलाज के लिए ऑटोलॉगस keratinocytes (देखें 4) और स्ट्रोक के उपचार के लिए सेल आधारित चिकित्सा के उपयोग के उपयोग (देखें 5)। इसी तरह, इन विट्रो मॉडल के लिए बाजार स्तरीकृत दवा आवेदन करने के लिए दवाओं की खोज तक फैला है। टिशू कल्चर में सम्मेलन एक टिशू कल्चर कुप्पी की 2-आयामी (2 डी) सतह पर पक्षपाती या लंगर निर्भर प्रकार की कोशिकाओं की वृद्धि है। नदीम वर्तमान में एक अनुसंधान की स्थापना में सोने के मानक के रूप में स्वीकार कर लिया है, ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में हाल ही में ब्याज तथ्य यह है कि वर्तमान 2D टिशू कल्चर पर्यावरण सेल उत्पादन 6 में आवश्यक पैमाने अप के लिए अपर्याप्त है पर प्रकाश डाला गया है।
पक्षपाती सेल प्रकार एक scaffol के लिएडी की आवश्यकता है, अंत का उपयोग करने के आधार पर अलग अलग होंगे, जो दोनों रासायनिक संरचना और यांत्रिक गुणों के संदर्भ में। कुछ सिस्टम मचानों को रोजगार के रूप में अच्छी तरह से प्लेट अत्यधिक झरझरा मैट्रिक्स उच्च आंतरिक चरण पायस templating से गठन से मिलकर सम्मिलित करता है (7 देखें) या Electrospun फाइबर (8 देखें) पारंपरिक 2D संस्कृति तकनीक से न्यूनतम अनुकूलन की जरूरत पड़ेगी। प्रकोष्ठों बदलती रचनाओं के microcarriers पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और हड़कंप मच टैंक है कि पोषक तत्वों और संकेतन अणुओं देने में हो, और एक गतिशील अच्छी तरह से मिश्रित वातावरण के माध्यम से 9 अपशिष्ट उत्पादों (जन परिवहन) दूर ले। हालांकि, इन प्रणालियों उनके vivo तरह के माहौल में सीमित कर रहे हैं और आगे सुधार पैमाने अप करने के लिए लागत संबंध के साथ बनाया जा सकता है। खोखले फाइबर बायोरिएक्टर (HFBs) एक 3 डी संस्कृति प्रणाली है कि आम तौर पर झरझरा फाइबर और मीडिया फाइबर लुमेन के माध्यम से दिया के बाहर पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के साथ एक मॉड्यूल में तय तंतुओं से मिलकर कर रहे हैं (1 में समीक्षा की0) (चित्रा 1)। HFBs फाइबर रक्त केशिकाओं नकल उतार और गतिशील मीडिया वितरण के साथ जुड़े कतरनी तनाव से कोशिकाओं परिरक्षण, जबकि इजाजत दी परिभाषित कतरनी अगर वांछित पक्ष बंदरगाहों के माध्यम से द्रव का प्रवाह के माध्यम से कोशिकाओं को लागू किया जा करने के लिए एक साथ इन विवो तरह के माहौल प्रदान करते हैं। यह बेहतर जन परिवहन, जिसमें उच्च सेल घनत्व 11 पहुँचा जा सकता है के साथ एक बहुमुखी संस्कृति प्रणाली बनाता है। HFB प्रणाली अच्छी तरह से लंगर निर्भर प्रकार की कोशिकाओं के रखरखाव के लिए अनुकूल है और संस्कृति के लिए आइलेट्स 12, माउस β-टीसी -3 insulinoma सेल लाइन 12, प्राथमिक मानव hepatocytes 13, मानव हड्डी के चूहे अग्नाशय टापू सहित कोशिकाओं की एक किस्म का इस्तेमाल किया गया है मज्जा कोशिकाओं mononuclear 14, Madin डार्बी कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं (MDCK) 15 और Caco-2 कोशिकाओं 16 एक ही नाम है।
बड़े पैमाने पर स्थानांतरण और बड़े पैमाने अप करने की प्रणाली के फायदे के अलावा, कोशिकाओं 3 डी आज़ादी में उगाईमुकदमा संस्कृति प्रणालियों और अधिक विवो की तरह आकृति विज्ञान में और अधिक प्रयोगात्मक संकेतों के लिए उत्तरदायी होते हैं। उदाहरण के लिए चूहे प्राथमिक hepatocytes एक अधिक cuboidal आकृति विज्ञान, वृद्धि की व्यवहार्यता, साइटोक्रोम-P450 एंजाइम गतिविधि का अधिक से अधिक प्रेरण और वृद्धि की संवेदनशीलता पेरासिटामोल की विषाक्तता को दिखाने के लिए जब 2 डी संस्कृति 17 में विकसित कोशिकाओं की तुलना में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polystyrene पाड़ में हो। एक ही पाड़ हिपेटोकार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 भी एल्बुमिन उत्पादन 18 बढ़ाने के लिए और 2 डी संवर्धित कोशिकाओं की तुलना में 19 methotrexate के जवाब की तरह विवो में एक और अधिक दिखाने के लिए दिखाया गया है का उपयोग करना। प्राथमिक मानव hepatocytes देरी dedifferentiation, उच्च साइटोक्रोम-P450 गतिविधि का प्रदर्शन किया और 4/5 यौगिकों एक छिड़काव संस्कृति प्रणाली 20 में परीक्षण के लिए मंजूरी की वृद्धि हुई। मानव तंत्रिका स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और glia एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polystyrene पाड़ में संवर्धित दोनों उच्च (संभावित कार्रवाई) और कम freque का प्रदर्शनncy (स्थानीय क्षेत्र की क्षमता) कोई neuronal गतिविधि जबकि सहज गतिविधि 2 डी संवर्धित कोशिकाओं 21 में पाया गया था। Caco-2 कोशिकाओं 2 डी संस्कृति में वृद्धि हुई alkaline फॉस्फेट, γ-glutamyltransferase और पी ग्लाइकोप्रोटीन गतिविधि और एफ actin और Zona occludens -1 प्रोटीन 16 की उच्च अभिव्यक्ति द्वारा मापा की तुलना में एक HFB में बढ़ाया भेदभाव का प्रदर्शन किया। फायदे के बावजूद, एक 2 डी टिशू कल्चर कुप्पी सतह की तुलना में अन्य प्रणालियों में कोशिकाओं की दिनचर्या संवर्धन फिर भी, कई प्रयोगशालाओं में अभ्यास नहीं है, हालांकि 3 डी सेल संस्कृति का हवाला देते हुए प्रकाशनों की संख्या (पिछले 10 साल में 8 गुना वृद्धि बढ़ रही है। स्रोत : '3 डी संस्कृति') के साथ जांच उपकरण PubMed 'वर्ष से परिणाम के लिए'।
यह पांडुलिपि स्तनधारी सेल संस्कृति के लिए सेट अप और एक HFB प्रणाली के परिचालन की स्थिति का वर्णन करता है और हिपेटोकार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 / C3A संवर्धन में इसकी उपयोगिता को दर्शाता है। इस विधि का उद्देश्य संस्कृति में कोशिकाओं हैएक अधिक विवो तरह संस्कृति प्रणाली है कि काफी सादगी बरकरार रखती है यह जो 3 डी संस्कृति प्रणालियों के लिए नए हैं के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए। आवेदन में HFBs का उपयोग कर पीछे तर्क यहाँ का वर्णन है, जो सुधार करने के लिए जिगर मॉडल के predictability कि यह HFB पर्यावरण के भीतर एक 22 यकृत sinusoid नकल करने के लिए सैद्धांतिक रूप से संभव है है। यह वर्तमान में अन्य संस्कृति सिस्टम के साथ संभव नहीं है।
यह पांडुलिपि स्तनधारी सेल संस्कृति के लिए सेट अप और एक खोखला फाइबर बायोरिएक्टर (HFB) प्रणाली के संचालन का वर्णन है और इसकी उपयोगिता hepatocyte सेल लाइन HepG2 / C3A proliferating में प्रदर्शन किया है। प्रणाली एक मानक इनक्यूबेटर और इसके सेट-अप की शेल्फ पर फिट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है पर्याप्त किसी भी सक्षम सेल जीवविज्ञानी सड़न रोकनेवाला तकनीक से परिचित द्वारा किया जा करने के लिए सरल है।
यहाँ वर्णित अनुसंधान प्रणाली में इस्तेमाल किया फाइबर कास्टिंग (कताई) एक गैर biodegradable मालिकाना बहुलक का उपयोग कर चरण उलटा स्पिन द्वारा घर में निर्मित कर रहे हैं। यह सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त है, दोनों biodegradable और गैर biodegradable, उदाहरण के लिए सामग्री की एक किस्म से कताई द्वारा फाइबर बनाने के लिए संभव है; पॉलिकैप्रोलैक्टोन (पीसीएल) 27, पाली एल lactide एसिड (PLLA) 28, पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) (पीएलजीए) 29, polysulfone (पीएसयू) 12 और polyetheretherketone (तिरछी) 13। प्रत्येक अलग गुण एक हैएन डी प्रणाली की जरूरतों के आधार पर चुना जाना चाहिए। नसबंदी चरण में इस्तेमाल इथेनॉल के साथ कार्यरत फाइबर की अनुकूलता की जांच। पीएलजीए इथेनॉल ऐसे एंटीबायोटिक / कवकनाशी समाधान 25 के रूप में एक वैकल्पिक उपचार की जरूरत के साथ Plasticize करने के लिए जाना जाता है।
कांच यहां इस्तेमाल किया मॉड्यूल के आयामों वर्तमान अनुसंधान की जरूरतों के आधार पर चुने गए हैं। विभिन्न आकारों किसी भी सम्मानित कांच उड़ाने कंपनी द्वारा बनाया जा सकता है। मॉड्यूल आकार में एक विचार कोशिकाओं की संख्या है, जो मॉड्यूल में फाइबर और संभावना प्रवाह दरों की संख्या से जुड़ा हुआ है। अधिक कोशिकाओं वहाँ मॉड्यूल उच्च प्रवाह दरों के आदेश बायोरिएक्टर का बहिर्वाह अंत में अनुकूल संस्कृति की स्थिति बनाए रखने के लिए की आवश्यकता होगी रहे हैं। यह एक सीमा के कुछ बिंदु और कुछ परीक्षण और त्रुटि के रूप में मॉड्यूल चूना में मीडिया की स्थिति की निगरानी के साथ आवश्यक हो सकता तक पहुंच जाएगा। गणितीय मॉडलिंग आवश्यक मॉड्यूल Dimen में कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता हैवजहें और प्रवाह की दर 22।
यहां इस्तेमाल तंत्र के आयाम एक मशीन शेल्फ पर फिट करने के लिए बनाया गया है। टयूबिंग की लंबाई लंबाई whilst भी घटकों के लिए पर्याप्त आंदोलन की अनुमति सेट-अप और ऑपरेशन के लिए अनुमति देने के लिए कनेक्टर्स के बीच तक पहुँचने की जरूरत से निर्धारित होता है। समय के पाठ्यक्रम के नमूने की आवश्यकता है, मॉड्यूल में मीडिया की स्थिति की निगरानी में उदाहरण के लिए तो इंजेक्शन बंदरगाहों retentate करने के लिए जोड़ा जा सकता है चूना और लाइनों चूना इस सुविधा के लिए।
किसी भी सेल संस्कृति प्रणाली के लिए एक शर्त कोशिकाओं को जीवित और सबसे बढ़ रहा मामलों में रखने के लिए है। 3 डी संस्कृति प्रणालियों में विकसित कोशिकाओं में phenotype तरह विवो में एक और अधिक का प्रदर्शन अध्ययन के प्रकाश में यह भी एक वातावरण है कि निकट vivo वातावरण में कोशिकाओं द्वारा सामना करना पड़ा mimics प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण लगता है। यह आखिरी बिंदु अक्सर सुविधा इस संस्कृति प्रणाली प्रदान करता है के पक्ष में 2 डी सेल संस्कृति में उपेक्षित है। टीवह फाइबर के लुमेन के माध्यम से कोशिकाओं को पोषक तत्वों देने से विवो केशिका नेटवर्क में mimics HFB। अपशिष्ट उत्पादों को भी गतिशील प्रवाह से प्रणाली से हटा रहे हैं। यह सेल संस्कृति और एक है कि निकट vivo वातावरण hepatocytes द्वारा देखा mimics के लिए एक विवो तरह सिस्टम बनाता है, इस प्रणाली के लिए एक बेहतर विकल्प बनाने के लिए इन कोशिकाओं संवर्धन के लिए 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक की तुलना में। यह इस तथ्य से मंडित है कोशिकाओं छिपाना 15 गुना 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक पर हो उन लोगों की तुलना एल्बुमिन की राशि, एक महत्वपूर्ण यकृत समारोह, HFB संस्कृति प्रणाली में।
नदीम HFB प्रणाली सबसे नहीं तो सब लंगर निर्भर प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूल है, उदाहरण के लिए यहाँ hepatocytes है क्योंकि दवा उद्योग द्वारा कार्यात्मक संस्कृति, अधिक विवो तरह दवा के विकास में उपयोग के लिए hepatocytes करने में सक्षम होना करने के लिए एक असली जरूरत है वहाँ और बाह्य-समर्थन के लिए bioartificial जिगर उपकरणों मेंजिगर की विफलता रोगियों की। अधिक कार्यात्मक कोशिकाओं के लिए की जरूरत है इन उदाहरणों से परे फैली हुई है, खासकर के रूप में पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र translational काम का एक चरण में प्रवेश करती है। एक अधिक विवो तरह संस्कृति पर्यावरण के फायदे अनदेखी नहीं की जानी चाहिए।
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |