Summary
El comportamiento funcional de las células en cultivo puede ser mejorado por cultivo en más in vivo -como ambientes de cultivo 3-dimensionales 16-21. Este manuscrito describe la puesta en marcha y operación de un sistema de fibra hueca para el biorreactor -como el cultivo de tejidos en mamíferos in vivo.
Introduction
El cultivo de tejidos es una técnica establecida para el crecimiento y / o mantenimiento de las células que se ha utilizado durante más de 100 años 1,2. La conveniencia de las células que estudian y respuestas ex vivo tiene profundas ventajas que permiten experimentos que de otro modo sería extremadamente difícil, si no imposible, por ejemplo la generación de líneas de células de ingeniería genética y el uso de células indicadoras en ensayos de cribado de alto rendimiento 3. Más recientemente cultivo de tejidos ha dado lugar al campo de la ingeniería de tejidos, para la generación de modelos in vitro y para la medicina regenerativa. Con estas aplicaciones, el interés en los sistemas de cultivo dinámicas de 3 dimensiones (3D) ha crecido de manera significativa.
Métodos de cultivo 3D (definidos aquí como un sustrato de cultivo 3D y / o la introducción de flujo dinámico direccional) recapitular mejor la arquitectura del entorno celular in vivo, importante para lograr unamás función fisiológica similar. La capacidad de extraer, crecer, diferenciarse y células de trasplante con el objetivo de reparar el tejido dañado y enfermo es un campo de estudio que tiene un enorme potencial para el beneficio del paciente y la oportunidad comercial. Por ejemplo el uso de queratinocitos autólogos para el tratamiento de quemaduras (véase 4) y el uso de terapias basadas en células para el tratamiento del accidente cerebrovascular (ver 5). Asimismo, el mercado de los modelos in vitro se extiende por el descubrimiento de fármacos para aplicaciones de medicina estratificados. La convención en cultivo de tejidos es el crecimiento de tipos de células dependientes de anclaje o adherentes en la superficie de 2 dimensiones (2D) de un matraz de cultivo de tejidos. Mientras que actualmente aceptado como el estándar de oro en un contexto de investigación, el reciente interés en aplicaciones de ingeniería de tejidos ha puesto de relieve el hecho de que el medio ambiente actual de cultivo de tejidos 2D es inadecuada para la ampliación requerida en la producción de 6 celdas.
Para los tipos de células adherentes un scaffold se requiere, que variará dependiendo del uso final, tanto en términos de la composición química y propiedades mecánicas. Algunos sistemas emplean como andamios insertos de placa de pocillos que consisten en la matriz altamente porosa formada a partir de plantillas de alta emulsión de fase interna (ver 7) o fibras electrospun (véase 8) que requieren la adaptación de las técnicas de cultivo mínimo 2D convencionales. Las células pueden ser sembradas en microvehículos de diferentes composiciones y se cultivaron en tanques agitados que proporcionan nutrientes y moléculas de señalización, y llevar los productos de desecho (transporte de masas) a través de un entorno bien mezclado dinámico 9. Sin embargo, estos sistemas están limitados en su vivo -como medio ambiente y mejoras adicionales se pueden hacer con respecto a aumentar la escala de costes. Biorreactores de fibra hueca (HFBs) son un sistema de cultivo 3D que constan de fibras fijas en un módulo con las células sembradas típicamente en el exterior de las fibras porosas y medios entregados a través del lumen de fibra (revisado en 10) (Figura 1). HFBs ofrecen un entorno in vivo -como con las fibras imitan los capilares sanguíneos y los blindajes de las células a partir de los esfuerzos de corte asociados con la entrega de medios dinámica, al tiempo que permite al cizallamiento se define para ser aplicado a las células a través de los flujo de fluido a través de los puertos secundarios si se desea. Esto crea un sistema de cultivo versátil con el transporte de masa superior en la que la alta densidad de células se puede llegar a 11. El sistema de HFB es muy adecuado para el mantenimiento de tipos de células dependientes de anclaje y se ha usado para cultivar una variedad de células incluyendo rata islotes pancreáticos de Langerhans 12, línea celular de insulinoma 12, los hepatocitos humanos primarios 13 de ratón-TC-3 β, hueso humano células mononucleares de médula ósea 14, las células Madin Darby de riñón canino (MDCK) 15 y Caco-2 células 16 para nombrar unos pocos.
Además de las ventajas del sistema de transferencia de masa y de ampliación, las células cultivadas en 3D tisLos sistemas de cultivo sue tienden a ser más in vivo -como en la morfología y más sensible a las señales experimentales. Por ejemplo hepatocitos de rata primarios muestran una morfología más cúbico, el aumento de la viabilidad, la mayor inducción de la actividad de la enzima citocromo P450 y el aumento de la sensibilidad a la toxicidad del paracetamol cuando se cultiva en un andamio de poliestireno disponible en el mercado en comparación con las células que crecen en cultivo 2D 17. Usando el mismo andamio la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 también se ha demostrado que aumenta la producción de albúmina 18 y muestran una más in vivo -como respuesta al metotrexato en comparación con las células cultivadas 2D 19. Hepatocitos humanos primarios demostraron desdiferenciación retardada, una mayor actividad del citocromo P450 y un mayor espacio libre para 4/5 compuestos ensayados en un sistema de cultivo de perfusión 20. de células madre neurales humanas neuronas derivadas y células gliales cultivadas en un andamio de poliestireno disponibles comercialmente exhibidos tanto alta (potencial de acción) y de bajo frequeNCY (potencial de campo local) la actividad espontánea mientras que ninguna actividad neuronal se detectó en las células cultivadas 2D 21. Las células Caco-2 demostraron una mayor diferenciación en un HFB comparación con el cultivo 2D medido por el aumento de la fosfatasa alcalina, γ-glutamil transferasa y la actividad de P-glicoproteína y una mayor expresión de F-actina y Zona occludens-1 de proteína 16. A pesar de las ventajas, el cultivo de rutina de las células en sistemas distintos de una superficie del matraz de cultivo de tejido 2D todavía no se practica en muchos laboratorios, aunque el número de publicaciones que citan el cultivo de células 3D está creciendo (aumento de 8 veces en los últimos 10 años. Fuente : PubMed 'resultados por Año' herramienta se sondeó con la "cultura 3D ').
Este manuscrito describe la configuración y las condiciones de funcionamiento de un sistema de HFB para el cultivo de células de mamíferos y demuestra su utilidad en el cultivo de la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 / C3A. El objetivo de este método es para cultivar las células enun sistema más in vivo -como cultura que retiene suficiente sencillez para que sea susceptible de aquellos que son nuevos en los sistemas de cultivo en 3D. La razón detrás de la utilización HFBs en la aplicación describir aquí, que es mejorar la previsibilidad de los modelos del hígado es que es teóricamente posible para imitar una sinusoide hepático dentro del entorno HFB 22. Esto no es factible en la actualidad con otros sistemas de cultivo.
Protocol
1. Fibras
- La fabricación de las fibras de giro de fundición de inversión de fases (spinning). Los detalles de este método se pueden encontrar en 23,24.
NOTA: Para este trabajo, las fibras se fabrican internamente usando un polímero patentado no biodegradables, NMP como disolvente y H 2 O como el no disolvente. Los detalles de otros polímeros adecuados se pueden encontrar en la discusión. Las fibras utilizadas en el sistema descrito aquí son 1,05 mm de diámetro exterior con un diámetro de la luz 600 a 700 micras. Las fibras son porosas con diámetros de poro de medición de 2,28 micras ± 1,5 m (media ± desviación estándar). Esto está diseñado para separar las células de la alimentación de los medios de comunicación en el lumen de la fibra, la replicación de la sinusoide hepático o vasculatura de otros tejidos. Las fibras también se pueden comprar de proveedores de membranas tales como Pall.
2. Fabricación del módulo
NOTA: Los módulos utilizados en este estudio están hechos de vidrio de borosilicato de 1 mm de espesor con 2 puertos secundarios(Figura 2A). Las fibras en el módulo descrito aquí tienen un área de superficie exterior de 4,95 cm 2 que es el equivalente de aproximadamente la mitad de un pocillo de una placa de 6 pocillos.
- Módulos Siliconize antes del primer uso por el recubrimiento de la superficie interior con Sigmacote (Tabla 1) y permitir que se seque en una campana de humos. Autoclave (121 ° C, 1 atm, 20 min) para aumentar la vida del tratamiento.
- El uso de un bisturí fibras cortadas de 75 mm de largo y insertar tres fibras en cada módulo dejando ~ 7 mm exceso de longitud en cada extremo (Figura 3A).
- Place ~ 0,5 ml de pegamento de silicona (Tabla 1) en un recipiente de pesar. Utilice una punta de pipeta P200 para recoger una pequeña cantidad de silicona y trabajar el pegamento en los extremos del módulo alrededor de las fibras para formar un tapón de 3-5 mm (Figura 3B). Deje secar durante> 3 horas.
- Con un bisturí corta el rubor de silicona con los extremos del módulo de vidrio (Figura 3C).
- envolver unapequeña cantidad (~ 4 capas) de politetrafluoroetileno (PTFE) de cinta alrededor de un puerto lateral.
3. Configuración del sistema y Esterilización
NOTA: Tubo de bomba y módulos con fibras no se esterilizan en autoclave y se esterilizan utilizando etanol al 70%. Los autores recomiendan la calibración de la tubería de la bomba con la bomba para ser usado. El siguiente procedimiento se lleva a cabo en una campana de flujo laminar.
- Autoclave (como la sección 2.1) todos los componentes en autoclave antes de su puesta a punto.
- Preparar
- Colocar 10 ml 70% de etanol en la botella de depósito y de establecimiento de la botella de depósito, la tapa Q-series, tubo de alimentación, bomba y tubería de la bomba (Tabla 1) como en la figura 4.
- Sin apretar colocar una tapa final sobre el puerto lateral de PTFE-grabada. Deslice los extremos de los conectores del módulo L / S16 sobre los extremos del módulo y el puerto lateral libre. Conectar una sección 40 mm de L / S13 tubería al conector del módulo más cercano al puerto del lado de tope (Tabla 1) como en la figura 2B
- Conectar el módulo a la tubería de la bomba, asegurando de orientar el módulo de modo que el puerto del lado de tope es más cercano a la bomba.
- Conecte la línea de filtrado y la línea de producto retenido a los conectores del módulo y la L / S14 de la Y-conector de la botella de reserva (Tabla 1). Asegúrese de que la configuración se asemeja a los esquemas de la figura 4.
- Esterilización
- Bombear el etanol a través del módulo a 800 l / hr (267 l / hr por fibra) durante un tiempo suficiente para tratar componentes no tratados en autoclave para> 30 min (tiempo de ajuste si se utilizan otros métodos de esterilización, véase 25).
- lavar
- Para lavar el etanol fuera del sistema, primero apague la bomba y drene la tubería. En primer lugar, separar el tubo de la bomba de la tubería módulo adaptador. Mantenga el módulo alto para drenar el etanol a partir de la línea de fibras y material retenido, de nuevo en el frasco de almacenamiento. Retirar la caja de conexión lateral del módulo para drenar THe etanol a partir del propio módulo, y la línea de permeado. Vuelva a colocar la tapa del extremo puerto lateral. Invertir el flujo de los medios de comunicación en la bomba para drenar el tubo de la bomba y la tubería de alimentación de etanol. Apagar la bomba y vuelva a conectar el tubo de la bomba al adaptador de módulo.
- Desenroscar la botella de etanol a partir de la tapa y reemplazar con una botella que contiene 10 ml de medio de cultivo celular (como EMEM, GMEM, DMEM o RPMI) sin suero. Bombear el medio a través del sistema en 800 l / h hasta que la línea de producto retenido está lleno de medios de comunicación. Sujetar la línea de producto retenido a la fuerza de penetración de los medios de comunicación a través de las fibras para lavar el módulo. Lávese durante ~ 2 h.
4. Siembra
NOTA: Los medios de comunicación y suplementos utilizados en este protocolo deben ser los que se establecen para el tipo celular deseado. Por favor refiérase a la literatura, la Colección Europea de Cultivos Celulares (ECACC) y la American Type Culture Collection (ATCC) para obtener más información. Antes de este método debe ser células maintained de acuerdo con los protocolos establecidos para el tipo celular deseado. Para este trabajo la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 / C3A subclon se mantuvieron de acuerdo con las recomendaciones distribuidores (ATCC).
NOTA: El protocolo de siembra se presenta a continuación también sirve para pre-cultivo del módulo con medio de cultivo celular antes de crecimiento celular. Si se requiere una más amplia precultivo entonces esto debe llevarse a cabo antes de sembrar el módulo mediante el drenaje del medio de lavado del sistema, reemplazando con medio de crecimiento y que impregna esta a través del módulo de pocas horas. Vea la sección 7.5.2.1 para más detalles sobre la sustitución de los medios de comunicación en el sistema.
- Preparar una suspensión de células por tripsinización de acuerdo con los protocolos establecidos para el tipo celular deseado. Un protocolo general para un cultivo T75 es la siguiente:
NOTA: El número de células para uso en la etapa de siembra debe ser determinado empíricamente para su tipo de célula deseado. Los biorreactores descritos aquí se sembraron a una cel 35 veces mayordensidad ls (células / cm 2) que utiliza en 2D plástico de cultivo de tejido para un cultivo de 7 días.- Lavar las células mediante la adición de 10 ml salina tamponada con fosfato (PBS), aspirado, a continuación, añadir 3 ml de ácido 0,05% de tripsina etilendiaminotetraacético (EDTA) (suficiente para cubrir las células) y se incuba a 37 ° C, 5% de CO2 durante 5 min.
- células de la cosecha en 7 ml de medio de crecimiento suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) para neutralizar la tripsina. Mezclar bien, añadir 10 l de la cámara de un hemocitómetro y contar las células.
- Centrifugar a 200 xg durante 5 min para sedimentar las células.
- Aspirar las células sobrenadante y resuspender en 4x10 6 / ml en medio de crecimiento suplementado como se requiere para el tipo de célula deseado.
- Apagar la bomba y drene el tubo de alimentación y el módulo como en 3.4.1.
- Separar el módulo de los conectores del módulo y adjuntar tapas de los extremos del módulo (Tabla 1) pre-esterilizados en etanol al 70%, dejando el puerto un lado libre. </ Li>
- Transferencia ~ 500 l de la suspensión de células (2x10 6 células) (4.1.4) al módulo usando una jeringa de 18 G de la aguja y 1 ml, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas y de no dañar las fibras.
- Se tapa el puerto lateral utilizando una tapa de extremo. Se incuban las células a 37 ° C, 5% de CO2 durante 2 a 4 horas con giro manual del módulo por 180 ° cada 5 min. Alternativamente, los módulos se pueden unir a un rotador de tubo con un ajuste de mezcla intermitente (Tabla 1).
- Después de la siembra, adjuntar una tapa de extremo en un puerto de inyección (Tabla 1) pre-esterilizado en 70% de etanol, y adjuntar esto al puerto del lado de PTFE-grabada. Retire la otra tapa de orificio lateral y lentamente drenar las células mediante la inyección de aire en el puerto de inyección conectado con una jeringa de 27 G de la aguja y 1 ml.
- Reemplazar el puerto de inyección con una tapa de extremo. Llenar lentamente el módulo con los medios de comunicación a través del puerto lateral libre y una aguja de 18 G con una jeringa de 1 ml. Remove las tapas de extremo del módulo y fije el módulo a la tubería usando los conectores del módulo.
- Vuelva a colocar la botella medio de lavado con una que contiene 50 ml de medio de crecimiento y suplementos siguiendo el procedimiento detallado en 7.5.2.1. Bombear el medio de crecimiento a través del sistema en 800 l / hr.
5. proliferación
NOTA: Las fibras utilizadas en el sistema de investigación que se describe aquí se ponen a permear en ~ 80 l / h, con una velocidad de alimentación de 800 l / hr.
- Utilizar las fibras de crecer las células durante períodos de hasta 7 días en un incubador humidificado a 37 ° C, 5% de CO 2.
NOTA: El seguimiento de los nutrientes y metabolitos durante la fase de crecimiento puede proporcionar información útil sobre la proliferación, la absorción metabólica y la salida de las células y los niveles de nutrientes y metabolitos en los medios de comunicación. Por ejemplo glucosa uso y la producción de lactato. Los kits están disponibles de varios proveedores que puedan cuantificar estos factores a partir de los medios de comunicación (ver
6. La escisión
Nota: Las fibras pueden ser extirpados desde el módulo al final de un experimento para el análisis.
- Desconecte y drene el HFB.
- Insertar un / cuchillo escalpelo micro (Tabla 1) la hoja entre el vidrio y silicona. Girar el módulo con el fin de cortar la silicona del vidrio. Repita este procedimiento en los dos extremos del módulo.
- El uso de la hoja de enganchar el tapón de silicona de un extremo y tire suavemente. Asegúrese de que las fibras vienen con él. Análisis 7. célula
- El número de células
NOTA: Para las células C3A utilizados en este estudio los puntos de tiempo dentro del período de crecimiento 7 días son adecuados para uso en este cálculo como las tasas de crecimiento no cambian sustancialmente en las densidades celulares obtenidos en este periodo de tiempo.- Después de la escisión (Sección 6) sumergir las fibras en PBS para lavar y cortar en un tubo de 1,5 ml que contiene 0,5 ml de Tris EDTA (TE). Someter esto a dos ciclos de congelación-descongelación en un congelador a -80ºC. Mida el contenido de ADN utilizando PicoGreen y determinar el número de células mediante la comparación de este valor con una curva estándar hecha con el tipo de célula deseado 26.
- las tasas de proliferación celular
- Usando los números de células calculados en dos puntos de tiempo diferentes calcular la tasa de crecimiento específico μ (Ecuación 1) donde Ln (X1) es el logaritmo natural del número de células en el primer punto de tiempo y Ln (X2) es el logaritmo natural de la célula número en el segundo punto del tiempo.
μ = (Ln (X2) -Ln (X1)) / hora (hr) (1)
A partir de este cálculo de los tiempos de duplicación de la población (dT) (Ecuación 2) donde μ es la tasa de crecimiento específico.
dT = Ln2 / μ (2)
- Usando los números de células calculados en dos puntos de tiempo diferentes calcular la tasa de crecimiento específico μ (Ecuación 1) donde Ln (X1) es el logaritmo natural del número de células en el primer punto de tiempo y Ln (X2) es el logaritmo natural de la célula número en el segundo punto del tiempo.
- Viabilidad celular
- Después de la escisión (Sección 6) sumergir las fibras en PBS para lavar y cortar en un tubo de 1,5 ml que contenía 500 l de ácido etilendiaminotetraacético 0,05% de tripsina (EDTA). Incubar a 37 ° C durante 10 min.
- Mezclar y añadir 10 l de suspensión celular a 10 l azul de tripano. Carga de 10 l en un hemocitómetro y contar el número de muertos (azul) y las células vivas.
- Imaging
- Después de la escisión sumergir las fibras en PBS para lavar y usar las tijeras para cortarlos en trozos pequeños en una placa de 24 pocillos. Añadir 400 l 4% de paraformaldehído (en PBS) e incubar a TA durante 20 min.
- Lavar con PBS con la pipeta 400 l encendido y apagado. Repita This paso con PBS fresco.
- Añadir 400 l 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) diluido en PBS a aprox. 100 ng / ml y se incuba a TA durante 20 min. Proteger de la luz.
- Lavar dos veces con PBS (como 7.3.2) y una vez con H2O Añadir un medio de montaje de fluorescencia para cubrir la fibra y la imagen de inmediato para recoger los datos antes de las muestras secas (DAPI ex / em; 359/461 nm).
- Tomar imágenes en diferentes planos focales y utilizar el software 'centrarse apilamiento' (por ejemplo, la pila de enfoque plug-in para ImageJ, abajo) para hacer una imagen compuesta que muestra una profundidad muy ampliada de campo. Esto es necesario ya que las fibras no son planas.
- Descargar ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij/) y el plugin 'apilar-enfocador' (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html).
- En ImageJ abren las imágenes para ser apilados. Luego, en el menú 'Imagen' ir a 'pilas' - 'Imágenes para apilar'. En el menú 'Plugins' ir a 'Pila Focuser'. Especificar un n para el núcleo de nxn. Ensayo y error con 'n' pueden ser necesarios con el fin de generar una imagen con poco "ruido". Los valores comprendidos entre 11 y 77 tienden a funcionar bien.
- la secreción de albúmina
NOTA: Esta es una prueba de la función celular de los hepatocitos y no una prueba general de la función celular.- Células de semillas (HepG2 / C3A) en 2D de plástico de cultivo tisular a 10.667 / cm 2 y cultivadas durante 6 días. HFBs de semillas como se describe en la Sección 4 y crecer durante 6 días.
- Después de este período de proliferación cambiar el medio de cultivo (EMEM + FBS al 10%, 1x glutamina y 1x penicilina / estreptomicina) para el plástico de cultivo tisular y HFB a la libre un medio de suero Williams E suplementado con glutamina 1x y 1x penicilina / estreptomicina durante 24 horas:
- Escurrir el módulo de tubo y HFB siguiendo los pasos establecidos en 3.4.1. Desenroscar el frasco de almacenamiento y reemplazar esto con una botella que contiene el medio Williams E. Bombear este a través de la HFB a las 800 l / hr.
- Después de 24 horas, tomar muestras de los medios. Cuantificar albúmina secretada por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla 1). Diluir las muestras de medios de comunicación 1 en 10 a 1 en 40 antes de su uso a fin de que las concentraciones de albúmina dentro del rango de la curva estándar.
Representative Results
la siembra de células es un paso crítico. La capacidad de las células para adherirse a la fibra en un 3D configuración es considerablemente menor que la observada para 2D plástico de cultivo tisular. Esto es probablemente debido al tiempo de contacto reducida entre la célula y el sustrato. En la HFB las células caen a través del módulo durante las fases estáticas de la siembra. Estos son considerablemente más corto en el tiempo en comparación con la fase estática continua utilizada en 2D. Las células tienen que hacer las conexiones con el sustrato en este momento. Además, debido a la naturaleza curvada de las fibras que no hay superficie plana para las células para descansar y hacer conexiones como existe en cultivo 2D. Mientras que esto puede ser agravada por la química de la fibra empleada sabemos que esto no es el caso para el polímero empleado en este estudio (datos no mostrados). Incrementando el tiempo de la siembra y la densidad de la siembra de células conduce a la formación de agregados de células que caen a través del módulo durante las fases estáticas en una r más rápidocomió que las células individuales y reduce aún más el tiempo de contacto entre las células y el sustrato. El aumento del tiempo también conduce a la coloración amarilla de los medios de comunicación ya que hay una alta densidad de células y no hay intercambio de los medios de comunicación durante esta etapa. Utilizando las condiciones descritas en los tipos Sección 4 de siembra de células de ~ 15% se logra consistentemente con las células HepG2 / C3A (Figura 5A). Mientras que esto puede ser considerado como una fracción de bajo hay suficientes células para generar fibras bien pobladas en cuestión de días (Figuras 5B y 6); después de un período de proliferación de siete días la densidad celular alcanzó en el HFB se está acercando a 3x10 5 / cm 2. Esta es una densidad apropiada para muchos ensayos que utilizan hepatocitos y pueden ser considerados como de alcanzar la confluencia.
Las tasas de proliferación obtenidos en la HFB son más lentas en comparación con la alcanzada en cultivos de células 2D (Figura 5C). Esta es la ONUprobable que sea debido a la pérdida de células en el flujo dinámico del sistema en el recuento de células en los medios de comunicación son bajos (promedio ± SEM: 20.343 células ± 3.674 células por 24 horas a confluencia, que es 4% de las células totales) y este no aumenta cuando la velocidad de permeación se gira hasta 400 l / h (datos no mostrados). También es poco probable que sea debido a una disminución de la viabilidad y la posterior pérdida de las células (véase la Figura 5D y a continuación). Se puede explicar, al menos en parte por el hecho de esta línea celular se derivó clonal de HepG2 y seleccionada por su capacidad de mostrar inhibición por contacto de la proliferación celular. Las células de la HFB se siembran a 6x la densidad de las células 2D que puede conducir a tasas de proliferación más lenta.
La viabilidad se mantiene alta durante todo el HFB con células que presentan> 90%. Mientras que hay una ligera disminución de la viabilidad en el extremo de salida en comparación con la entrada de esto no se encontró que era significativa (prueba de la t p = 0,22).
Vigilancia del consumo de glucosa y la producción de ácido láctico se ha utilizado para ajustar el volumen y la velocidad de alimentación de medios de comunicación en el sistema. El uso de 800 l / hr y un volumen total de los medios de comunicación 50 ml de la glucosa y los niveles de ácido láctico se mantienen arriba y abajo (respectivamente) los que se ven en la cultura estándar de plástico de cultivo de tejidos.
la secreción de albúmina es una función hepática clave llevadas a cabo por los hepatocitos. Es secretada en el suero donde juega varios papeles en el transporte y la homeostasis. La secreción de albúmina por las células cultivadas en el HFB es 15 veces mayor que la de las células cultivadas en 2D (Figura 7). Esto demuestra que las células son funcionales en la HFB y al menos en el caso de la secreción de la albúmina, esta función es elevado en la HFB.
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La Figura 1. El medio ambiente en vivo -como de un HFB. Las células se siembran en el exterior de las fibras porosas. Los medios de comunicación se entrega a través del lumen de fibra, imitando un capilar sanguíneo. (A) Sección longitudinal de una fibra (no a escala). (B) Sección transversal de un reactor 3 de fibra. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. El módulo de HFB. (A) Las dimensiones del módulo utilizado en este estudio. Las dimensiones se eligieron para adaptarse a las fibras 3 y cumplir con las necesidades del proyecto de investigación actual. Diferentes tamaños pueden ser fabricados y diseñados para los sistemas y las fibras individuales. (B) Una fotografía de la mÓDULO con conectores tapa de extremo y módulos conectados. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Módulo de fabricación. Las fibras (A) se corta a la medida y se inserta en el módulo. (B) Las fibras se pegan en el módulo, se deja secar. (C) Los extremos se cortan a ras con el vidrio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Sistema de HFB configuración. Las flechas indican la dirección del flujo de medios de comunicación. Rojo = tubo de alimentación. Amarillo = bomba de maser. Blanco = módulo de HFB. Verde = tubo de material retenido con la abrazadera. = Azul impregnan tubo. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. La siembra, la proliferación, la viabilidad y el análisis bioquímico. (A) Porcentaje de células sembradas. Los diamantes negros representan HFBs individuales. La barra roja es la media. (B) Las células densidades de siembra en y después de un período de proliferación de 7 días. el número de células en 2D se determinaron por tripsinización y recuento usando un hemocitómetro. El número de células HFB se determinaron usando el ensayo PicoGreen y una curva estándar generada a partir de células C3A 26. n = 5-6. Barras = SEM. (C) Población tiempos de duplicación. n = 5-7. Barras = SEM. (D) La viabilidad determinada por trypuna exclusión de azul en el extremo de una proliferación 7 días. De entrada, de salida central y representan regiones dentro del HFB. n = 3-5. Barras = SEM. (E & F) El consumo de glucosa y la producción de ácido láctico. Los niveles se controlaron a la botella de reserva (entrada) así como el retenido y permeado puntos de venta y competían para cultivo de rutina en el plástico de cultivo de tejidos (medio cambió el día 3 y 5). n = 3-5. Barras = SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6. Las imágenes de las células cultivadas en fibras en una HFB. Las células se sembraron y se cultivaron durante 48 h antes de se extirparon las fibras, se lavaron en PBS, se fijaron en paraformaldehído al 4%, se lavaron en PBS y núcleos teñidos con DAPI. Cada imagen es un compuesto de 12 "Objetivo apilados 'images con el fin de aumentar la profundidad de campo de la imagen resultante. Las áreas de mayor densidad celular e inferior se encuentran a lo largo de la fibra en este punto de tiempo y se muestran. Cuando están presentes, los límites de fibras se indican con una línea discontinua de color rojo. Las imágenes fueron tomadas en un microscopio de fluorescencia invertida. Imagen objetiva = 10X. Barra = 200 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7. La albúmina secreción. Las células se sembraron en plástico de cultivo tisular a 10.667 / cm 2 y en el HFB como se describe en la Sección 4. Las células se multiplicaron durante 6 días. Después de este período la proliferación de los medios de cultivo de tejidos de plástico y la cultura HFB se cambió de forma gratuita un medio de suero Williams E suplementado con glutamina y penicilina / streptomycin durante 24 horas. Las muestras del medio fueron tomadas y una albúmina cuantificaron por ELISA de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Tabla 1). n = 5-6. Barras = SEM. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Sección | Nombre del Equipo | Empresa | Gato. No. | notas | imágenes |
| 2 | Módulo HFB cristal | soham Científico | --- | Artículo de encargo. | |
| 2.1 | Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | ||
| 2.3 | Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | silícicoun pegamento. | |
| 2.5 | cinta de PTFE | Sigma-Aldrich | Z104388 | ||
| 3.2.1 | frasco de almacenamiento | Pescador | 11972619 | ||
| casquillo de la serie Q | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE las roscas de los adaptadores y la tuerca de ajuste. Adjuntar a la tapa de la serie Q. Adjuntar una sección de 8,5 cm del tubo de PTFE suministrado bajo el adaptador de 1 mm y una sección de 4 cm bajo el adaptador de 3 mm. |  | |
| Adaptador, macho, 1,0 mm de DI | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adaptador, macho, 3,0 mm de DI | Kinesis | 008NB30-KD5L | |||
| Tuerca de montaje | Kinesis | U-350 | |||
| tubo de neopreno | Pescador | 10366344 | Coloque el filtro Hepa a 6 cm de tubo de neopreno y adjuntar esto a la 'tuerca de ajuste'. Adjuntar un 2x 30 mm secciones de tubo L / S14 para las dos primeras lengüetas del conector en Y y una sección de 3 cm de tubo L / S16 a la parte inferior. Adjuntar esto a la lengüeta del adaptador de ID 3 mm. (Sección 3.2.1) |  | |
| HEPA-vent | Pescador | 11374634 | |||
| Y-conector, de púas | Cole Parmer | OU-06295-10 | |||
| L / tubo de silicona S16 | Cole Parmer | OU-96410-16 | |||
| L / S14 tubo de silicona | Cole Parmer | WZ-96410-14 | |||
| L / tubo de silicona S13 | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm para conectar el adaptador de 1,0 mm de púas en la tapa de la serie Q de la bomba de la bañera ING = tubo de alimentación. | ||
| WM bomba 205U / CA | Pescador | 1248-6300 | |||
| tubo de la bomba WM, PVC, azul-naranja, 0,25 mm de diámetro | Pescador | 12416310 | PTFE la rosca del adaptador macho y conecte el adaptador hembra. El trabajo de la tubería de la bomba sobre una de las púas. Repita este set-up en el otro extremo de la tubería. (Sección 3.2.1) |  | |
| Adaptador, macho, 1,0 mm de DI | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adaptador, femenino, 1,0 mm de DI | Kinesis | 008NB10-KD2L | |||
| 3.2.2 | casquillo Luer hembra | Cole Parmer | WZ-45508-64 | tapas de los extremos laterales del puerto. | blefig4.jpg "/>  |
| L / tubo de silicona S13 | Cole Parmer | OU-96410-13 | sección de 40 mm para conectar la tubería de la bomba a un conector del módulo. | ||
| L / tubo de silicona S16 | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm de L / S16 equipado a 3x = reductores conectores del módulo. (Sección 3.2.2) | ||
| reductor de púas de 1/8 "x 1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | |||
| 3.2.4 | L / tubo de silicona S13 | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm sección para conectar el retenido a la L / S14 del conector en Y en la tapa de la serie Q. |  |
| L / tubo de silicona S13 | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm sección para conectar el permeado a la L / S14 del conector en Y en la tapa de la serie Q. | ||
| Unión de púas recta | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Fijar el final de la L / S13 que se conectará con la L / S14 de la Y-conector. | ||
| 3.4.2 | Abrazadera | VWR | 229-0609 | ||
| 4.3 | El tubo de silicona de 4 mm | Pescador | FB68858 | Veces más de una sección de 40 mm de tubo y asegurar con a = Módulo de tapa de extremo de sujeción de cables. (Sección 4.3) |  |
| Abrazadera de cables | Pescador | 12326377 | |||
| 4.4 | rotador tubo MACSmix | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | Una adaptación puede ser necesaria para ATTACh los módulos. | |
| 4.5 | El orificio de inyección leur | Thistle Científico | IB-10820 | Coloque la tapa del extremo al puerto de inyección. (Sección 4.5) | |
| casquillo Luer hembra | Cole Parmer | WZ-45508-64 | |||
| 5 | kit ácido L-láctico | Megazyme | K-LATE | ||
| 5 | Kit de D-glucosa | Megazyme | K-GLUC | ||
| 6.2 | Bisturí / cuchillo de micro | InterFocus | 10315-12 | ||
| 7.4.3 | La albúmina ELISA | laboratorios Bethyl | E80-129 |
Tabla 1. Componentes de la HFB puesta a punto.
Discussion
Este manuscrito describe la puesta en marcha y operación de un sistema de fibra hueca biorreactor (HFB) para el cultivo de células de mamíferos y su utilidad se demuestra en la proliferación de la línea celular de hepatocitos HepG2 / C3A. El sistema está diseñado para encajar en el estante de una incubadora estándar y su configuración es suficiente para ser llevado a cabo por cualquier biólogo celular competente familiarizado con la técnica aséptica simple.
Las fibras utilizadas en el sistema de investigación que se describe aquí se fabrican en casa por el giro de fundición de inversión de fases (spinning) usando un polímero patentado no biodegradable. Es posible hacer las fibras por hilado a partir de una variedad de materiales adecuados para el cultivo celular, tanto biodegradables y no biodegradables, por ejemplo; policaprolactona (PCL) 27, ácido poli-L-lactida (PLLA) 28, poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) 29, polisulfona (PSU) 12 y polieteretercetona (PEEK) 13. Cada uno tiene diferentes propiedades de unaNewcastle deberán ser elegidos en base a las necesidades del sistema. Comprobar la compatibilidad de la fibra empleada con el etanol utilizado en la etapa de esterilización. PLGA se sabe que plastifica con etanol que requiere un tratamiento alternativo como antibiótico / antimicótico solución 25.
Las dimensiones de los módulos de vidrio utilizadas aquí fueron elegidos en base a las necesidades de la investigación actual. Los diferentes tamaños se pueden hacer por cualquier compañía de soplado de vidrio de buena reputación. Una consideración en el tamaño del módulo es el número de células, que está vinculada al número de fibras en el módulo y caudales probables. Los más células que hay en el módulo de la más altas las velocidades de flujo deberán ser con el fin de mantener condiciones de cultivo favorables en el extremo de salida del biorreactor. Esto llegará a un límite en cuanto algún momento y un poco de ensayo y error puede ser requerida con el monitoreo de las condiciones del medio en el permeado módulo. La modelación matemática puede proporcionar algunas ideas sobre las dimen módulo requeridossiones y velocidades de flujo 22.
Las dimensiones del aparato usado aquí está diseñado para que quepan en un estante incubadora. La longitud de la tubería es dictada por la longitud necesaria para llegar entre los conectores permitiendo al mismo tiempo también suficiente movimiento de los componentes para permitir la puesta en marcha y funcionamiento. Si se requiere el muestreo curso de tiempo, por ejemplo en el control de las condiciones de los medios en el módulo de impregnar a continuación, puertos de inyección se pueden añadir al producto retenido y permeado líneas para facilitar esto.
Un requisito previo para cualquier sistema de cultivo celular es mantener vivas las células y en la mayoría de los casos en crecimiento. A la luz de los estudios que demuestran un mayor in vivo -como fenotipo en las células cultivadas en sistemas de cultivo 3D también parece importante para proporcionar un entorno que imita el entorno en vivo encontrado por las células. Este último punto es a menudo descuidado en cultivo celular 2D a favor de la comodidad ofrece este sistema de cultivo. Tque HFB imita en redes capilares in vivo mediante la entrega de nutrientes a las células a través del lumen de las fibras. Los productos de desecho también se eliminan del sistema por el flujo dinámico. Esto crea un sistema in vivo -como para el cultivo celular y uno que imita el entorno en vivo visto por los hepatocitos, lo que hace este sistema una mejor opción en comparación con 2D de plástico de cultivo de tejidos para el cultivo de estas células. Esto es corroborado por el hecho de que las células secretan 15 veces la cantidad de albúmina, una función hepática importante, en el sistema de cultivo HFB en comparación con las cultivadas en 2D plástico de cultivo de tejidos.
Mientras que el sistema de HFB es adecuado para la mayoría si no todos los tipos de células dependientes de anclaje, el ejemplo aquí es para hepatocitos porque hay una necesidad real para poder cultura funcional, más in vivo -como hepatocitos para su uso en el desarrollo de fármacos por la industria farmacéutica y en el hígado artificial extracorpóreo para el apoyode pacientes con insuficiencia hepática. La necesidad de más células funcionales extiende más allá de estos ejemplos, en particular como el campo de la medicina regenerativa entra en una fase de trabajo de la traducción. Las ventajas de un entorno de cultivo in vivo más -como no deben pasarse por alto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass HFB Module | Soham Scientific | --- | Custom Item. (Section 2) |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
| Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
| PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
| Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 3.0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6 cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm to connect the 1.0 mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
| WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
| WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25 mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thread of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Female, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
| Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
| 4 mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
| Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
| D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
| Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
| Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |
References
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