O comportamento funcional de células em cultura pode ser melhorada por cultura em mais in vivo -like ambientes de cultura 3-dimensionais 16-21. Este manuscrito descreve o set-up e operação de um sistema de fibra biorreator oco para in vivo -como mamíferos cultura de tecidos.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
A cultura de tecidos é uma técnica estabelecida para o crescimento e / ou manutenção de células que tenha sido utilizado há mais de 100 anos 1,2. A conveniência de células que estudam e as respostas ex vivo tem alcance tanto vantagens que permitem experiências que de outra forma seria extremamente difícil, se não impossível, por exemplo, a geração de linhas celulares geneticamente modificadas ea utilização de células repórter em alto throughput screening ensaios 3. Mais recentemente cultura de tecidos deu origem ao campo da engenharia de tecidos, para a geração de modelos in vitro e em medicina regenerativa. Com estas aplicações, o interesse em sistemas de cultura dinâmicas em 3 dimensões (3D) tem crescido significativamente.
Os métodos de cultura em 3D (definido aqui como um substrato de cultura 3D e / ou a introdução de fluxo dinâmico direccional) melhor recapitular a arquitectura do ambiente celular in vivo, importante para atingir umamais uma função fisiológica semelhante. A capacidade de extrair, crescer, se diferenciar e células de transplante com o objectivo de reparar o tecido doente e danificada é um campo de estudo que tem um enorme potencial para o benefício do paciente e oportunidade comercial. Por exemplo, a utilização de queratinócitos autólogos para o tratamento de queimaduras (ver 4) e o uso de terapias à base de células para o tratamento de acidente vascular cerebral (ver 5). Da mesma forma, o mercado para os modelos in vitro abrange a descoberta de drogas para aplicações de medicina estratificada. A convenção em cultura de tecidos é o crescimento de tipos de células dependentes aderentes ou ancoradouro na 2-dimensional (2D) superfície de um balão de cultura de tecidos. Embora atualmente aceito como padrão-ouro em um ambiente de pesquisa, interesse recente em aplicações de engenharia de tecidos tem destacado o fato de que o actual ambiente de cultura de tecidos 2D é inadequado para o aumento de escala necessária na produção de células 6.
Para os tipos de células aderentes uma scaffold é requerido, que irá variar dependendo do uso final, tanto em termos de composição química e as propriedades mecânicas. Alguns sistemas utilizam andaimes como inserções bem-chapa consistindo de matriz altamente poroso formado a partir de templates alta emulsão de fase interna (ver 7) ou fibras electrospun (ver 8) que necessitam de adaptação mínimo de técnicas de cultura 2D convencionais. As células podem ser semeadas em microcarregadores de composições variadas e cultivadas em tanques agitados que fornecem nutrientes e moléculas de sinalização, e levar deteriorantes (transporte de massa) através de um ambiente bem misturado dinâmica 9. No entanto, estes sistemas são limitados em sua no ambiente vivo -como e outras melhorias podem ser feitas no que diz respeito à escala-up custos. Biorreactores de fibra oca (HFBs) é um sistema de cultura 3D que consistem de fibras fixadas em um módulo com células tipicamente semeadas no exterior das fibras porosas e meio entregue através do lúmen de fibra (revisto em 10) (Figura 1). HFBs oferecer um ambiente in vivo -like com as fibras que imitam capilares sanguíneos e protegendo as células a partir das tensões de corte associadas com a entrega dos meios dinâmica, enquanto permitindo corte definida para ser aplicada às células por meio de fluxo de fluido através das portas laterais, se desejado. Isso cria um sistema de cultura versátil com transporte de massa superior em que altas densidades celulares pode ser alcançado 11. O sistema de HFB é bem adequado para a manutenção de tipos celulares dependentes de ancoragem e tem sido utilizado para a cultura de uma variedade de células incluindo ratos ilhéus pancreáticos de Langerhans 12, rato β-TC-3 linha celular de insulinoma 12, hepatócitos humanos primários 13, osso humano As células mononucleares de medula 14, células Madin Darby de rim canino (MDCK) 15 e Caco-2 As células 16 para citar alguns.
Além das vantagens do sistema de transferência de massa e o aumento de escala, as células cultivadas em 3D tissistemas de cultura sue tendem a ser mais in vivo -como na morfologia e mais responsivo aos estímulos experimentais. Por exemplo hepatócitos primários de rato mostram uma morfologia mais cubóide, viabilidade aumentada, maior indução da actividade da enzima do citocromo P450 e aumento da sensibilidade à toxicidade do paracetamol, quando cultivada num andaime de poliestireno comercialmente disponíveis em comparação com células cultivadas em cultura 2D 17. Usando o mesmo andaime também tem sido mostrado a linha celular de hepatocarcinoma HepG2 para aumentar a produção de albumina de 18 um e mostrar mais in vivo -like resposta ao metotrexato em comparação com células cultivadas em 2D 19. Hepatócitos primários humanos demonstraram desdiferenciação retardada, maior atividade do citocromo-P450 e depuração aumentada para 4/5 compostos testados em um sistema de cultura de perfusão 20. Human células estaminais neuronais neurônios derivados e glia cultivadas em um andaime de poliestireno comercialmente disponível exibiu tanto elevada (potencial de ação) e baixa-FrequeNCY (potencial de campo local) actividade espontânea ao passo que nenhuma actividade neuronal foi detectada nas células cultivadas 2D 21. Células Caco-2 demonstraram diferenciação melhorada em comparação com um HFB cultura 2D medido pelo aumento da fosfatase alcalina, γ-glutamil transferase e a actividade de P-glicoproteína e de maior expressão de F-actina e na Zona-1 occludens proteína de 16. Apesar das vantagens, a cultura de rotina de células em outras do que uma superfície de cultura de tecidos balão 2D sistemas ainda não é praticado em muitos laboratórios, embora o número de publicações que mencionam cultura celular 3D é crescente (aumento de 8 vezes nos últimos 10 anos. Fonte : PubMed «resultados por Ano 'ferramenta sondado com" cultura 3D').
Este manuscrito descreve o set-up e as condições de funcionamento de um sistema de HFB para a cultura de células de mamíferos e demonstra a sua utilidade na cultura da linha celular HepG2 hepatocarcinoma / C3A. O objectivo deste método é para a cultura das células emum in vivo -como sistema mais cultura que retém bastante simplicidade para torná-lo receptivo para aqueles que são novos para sistemas de cultura 3D. A lógica por trás da utilização HFBs no pedido descrevem aqui, o que é para melhorar a previsibilidade dos modelos de fígado é que é teoricamente possível imitar uma sinusóide hepático dentro do ambiente HFB 22. Este não é actualmente possível com outros sistemas de cultura.
Este manuscrito descreve o set-up e operação de um sistema oco biorreator de fibra (HFB) para a cultura de células de mamíferos e sua utilidade é demonstrada em proliferando a linha de células de hepatócitos HepG2 / C3A. O sistema é projetado para caber na prateleira de uma incubadora padrão e seu set-up é simples o suficiente para ser levada a cabo por qualquer biólogo celular competente familiarizado com a técnica asséptica.
As fibras utilizadas no sistema de pesquisa aqui descritos são fabricados em casa por rotação de inversão de fase de fundição (fiação) utilizando um polímero não biodegradável proprietária. É possível fazer fibras de fiação a partir de uma variedade de materiais adequados para a cultura de células, tanto biodegradáveis e não biodegradáveis, por exemplo; de policaprolactona (PCL) 27, ácido poli-L-lactido (PLLA) 28, poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) 29, polisulfona (PSU) 12 e polieteretercetona (PEEK) 13. Cada um tem diferentes propriedades deND deve ser escolhida com base nas necessidades do sistema. Verifique a compatibilidade da fibra empregue com o etanol utilizado no passo de esterilização. PLGA é conhecido por plastificar com etanol necessitando de um tratamento alternativo, como antibióticos / solução antimicótico 25.
As dimensões dos módulos de vidro usadas aqui foram escolhidos com base nas necessidades da pesquisa actual. tamanhos diferentes pode ser feita por qualquer empresa sopro de vidro respeitável. Uma consideração no tamanho do módulo é o número de células, que está ligado ao número de fibras do módulo e as taxas de fluxo prováveis. As células mais existem no módulo quanto maior a taxa de fluxo terá de ser de modo a manter condições favoráveis de cultivo na extremidade de saída do bioreactor. Isso vai atingir um limite como algum momento e alguma tentativa e erro pode ser necessária com monitoramento das condições da mídia no permeado módulo. modelagem matemática pode fornecer alguns insights sobre as dimen módulo necessáriosões e taxas de fluxo 22.
As dimensões do aparelho utilizado aqui é concebido para se ajustar a uma prateleira incubadora. O comprimento do tubo é ditado pelo comprimento necessário para se atingir entre os conectores enquanto permitindo também o movimento suficiente de componentes para permitir a montagem e operação. Se a amostragem curso de tempo é necessário, por exemplo, no controlo das condições de media no módulo de permear, em seguida, as portas de injecção podem ser adicionados ao retentado e as linhas permear para facilitar isto.
Um pré-requisito para qualquer sistema de cultura de células é a de manter as células vivas e na maioria dos casos em crescimento. À luz de estudos que demonstram uma mais in vivo -like fenótipo em células cultivadas em sistemas de cultura 3D também parece importante para proporcionar um ambiente que imita de perto o ambiente in vivo encontrados pelas células. Este último ponto é muitas vezes negligenciada em cultura de células 2D em favor da conveniência deste sistema de cultura oferece. Tele HFB imita em redes capilares in vivo, fornecendo nutrientes para as células através do lúmen das fibras. Os resíduos de produtos também são removidos do sistema por o fluxo dinâmico. Isto cria um sistema in vivo -como para cultura de células e uma que imita de perto o ambiente in vivo visto pelos hepatócitos, tornando este sistema uma escolha melhor em comparação com 2D tecido de plástico de cultura para a cultura dessas células. Isto é corroborado pelo fato de as células secretam 15 vezes a quantidade de albumina, uma importante função hepática, no sistema de cultura HFB em comparação com aquelas cultivadas em 2D de plástico de cultura de tecidos.
Embora o sistema de HFB é adequada para a maioria se não todos os tipos de células dependentes de ancoragem, o exemplo aqui é para hepatócitos porque existe uma verdadeira necessidade de ser capaz de cultura funcional, in vivo mais -like hepatócitos para utilização no desenvolvimento de medicamentos pela indústria farmacêutica e em dispositivos de fígado bioartificiais para o apoio extracorpóreade pacientes com insuficiência hepática. A necessidade de células funcionais mais se estende para além destes exemplos, particularmente como o campo da medicina regenerativa entra numa fase de trabalho de translação. As vantagens de um ambiente in vivo cultura mais -como não deve ser menosprezada.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |