ההתנהגות התפקודית של תאים בתרבית ניתן לשפר על ידי culturing בלמעלה in vivo-כמו 3 ממדי סביבות תרבות 16-21. כתב יד זה מתאר את פעולת הגדרה ושל מערכת bioreactor סיבים חלולה עבור in vivo-כמו בתרבית רקמה יונקת.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
בתרבית רקמה היא טכניקה הוקמה לצמיחה ו / או התחזוקה של תאים נוצלו במשך 100 שנים 1,2. הנוחות של לימוד תאים ותגובות vivo לשעבר מרחיקה לכת יתרונות המאפשרים ניסויים שאחרת היה מאתגר מאוד אם לא בלתי אפשרי, למשל הדור של שורות תאים מהונדסות גנטי ושימוש תאי כתב מבחני מיון תפוקה גבוהה 3. לאחרונה בתרבית הרקמה הצמיחה בתחום הנדסת רקמות, לייצור מודלים במבחנת רפואת שיקום. בעזרת יישומים אלה, עניין מערכות התרבות דינמית 3-ממדי (3D) גדל באופן משמעותי.
3D שיטות תרבות (מוגדר כאן כמו מצע תרבות 3D ו / או את ההקדמה של זרימה דינמית כיוונית) טוב יותר לשחזר את הארכיטקטורה של סביבת הסלולר in vivo, חשובה להשגהתפקוד פיזיולוגי דמוי יותר. היכולת לחלץ, לגדול, להבדיל ותאי השתלה במטרה לתקן רקמה חולה ופגועה היא תחום המחקר ויש לו פוטנציאל אדיר לטובת מטופל הזדמנות מסחרית. לדוגמה השימוש קרטינוציטים עצמיים לטיפול בכוויות (ראה 4) ושימוש טיפולים מבוססי תאים לטיפול בשבץ (ראה 5). כמו כן, שוק מודלים במבחנה משתרע גילוי תרופות ליישומים ברפואה מרובדת. הכנס בתרבית רקמה במקביל גדלתי מספרם של סוגי תאים תלויים חסידים או למעגן על פני שטח 2-הממדים (2D) של בקבוק בתרבית רקמה. בעוד מקובל כיום כתקן זהב במסגרת מחקרית, הריבית האחרונה יישומי הנדסת רקמות הדגישה את העובדה כי הסביבה בתרבית רקמת 2D הנוכחית אינה מספקת עבור מדרוג כלפי מעלה נדרש בתא ייצור 6.
עבור סוגי תאים חסידים scaffolד נדרש, אשר ישתנה בהתאם לשימוש הסופי, הן מבחינת הרכב כימי ותכונות מכאניות. חלק מהמערכות להעסיק פיגומים וכן צלחת מוסיף מורכב המטריצה הנקבובית ביותר נוצרה בניית תבנית אמולסיה בשלב פנימית גבוהה (ראה 7) או סיבי electrospun (ראה 8) הדורשים הסתגלות מינימום מ טכניקות תרבות 2D קונבנציונליות. תאים יכולים להיות זורעים על microcarriers של קומפוזיציות שונות גדלו במיכלים שיעוורו לספק חומרים מזינים מולקולות איתות, ולבצע משם פסולת (להסעת המונים) באמצעות בסביבה מעורבת דינמית גם 9. עם זאת, מערכות אלו מוגבלים בסביבתם in vivo-כמו ושיפורים נוספים יכולים להתבצע לגבי לגמלן עלויות. Bioreactors סיבים חלולים (HFBs) הוא מערכת תרבות 3D מורכבת של סיבים קבועים לתוך מודול עם תאים בדרך כלל זרע על החלק החיצוני של הסיבים בתווך הנקבוביים מועברים דרך לומן הסיבים (הנסקרת ב 10) (איור 1). HFBs להציע סביבת in vivo-כמו עם הסיבים מחקו נימי דם ואת מגן על התאים מפני לחצי הגזירה הקשורות למשלוח תקשורת דינמי, תוך מתן אפשרות גזירה מוגדרת להיות מיושמת לתאים בוויה זרימת נוזל דרך היציאות בצד אם ירצה בכך. זה יוצר מערכת התרבות צדדית עם להסעת המונים מעולה שבו צפיפות תא גבוה ניתן להגיע 11. מערכת HFB היא גם מתאימה לשמירה על סוגי תאים תלויים למעגן ויש בו נעשתה שימוש לתרבות מגוון של תאים כולל איי עכברוש לבלב לנגרהנס 12, עכבר β-TC-3 שורת תאי אינסולינומה 12, hepatocytes אדם מן המעלה הראשון 13, עצמות אדם תאי mononuclear מח 14, תאי כליה כלביים מדין דארבי (MDCK) 15 ו קאקו-2 תאים 16 עד כמה שם.
בנוסף היכולות של העברת מסה מדרוג כלפי מעלה, מתאים הגדלים 3D tisמערכות התרבות לתבוע נוטות להיות יותר in vivo-כמו במורפולוגיה ועוד תגובה לרמזים ניסיוניים. לדוגמה להלשין hepatocytes העיקרי להראות מורפולוגיה cuboidal יותר, כדאיות גדלה, אינדוקציה יותר של פעילות אנזים ציטוכרום-P450 ורגישות מוגברת רעיל אקמול כאשר גדל פיגום קלקר זמין מסחרי לעומת תאי גדלים בתרבית 2D 17. שימוש באותו פיגום הקו הסלולרי hepatocarcinoma HepG2 הוכח גם כדי להגביר את ייצור אלבומין 18 ולהראות יותר in vivo-כמו בתגובה methotrexate לעומת תאים בתרבית 2D 19. Hepatocytes אדם מן המעלה הראשון הפגין dedifferentiation המושהית, פעילות ציטוכרום P450-גבוהה וגדילת אישור עבור 4/5 תרכובות נבדקות מערכת התרבות זלוף 20. גזע עצבי אדם תא עצב שמקורם גליה בתרבית פיגום קלקר זמין מסחרי הציגו הוא גבוה (פוטנציאל פעולה) ונמוך-frequency (פוטנציאל שדה מקומי) פעילות ספונטנית אך לא נעשה פעילות עצבית זוהה בתאי 2D התרבותיים 21. קאקו-2 תאים הפגינו בידול משופר בתוך HFB לעומת תרבות 2D נמדדת phosphatase אלקליין גדל, γ-glutamyltransferase ופעילות P-glycoprotein וביטוי גבוה של F-יקטין zona occludens-1 חלבון 16. למרות היתרונות, את culturing השגרתית של תאים במערכות מלבד משטח בקבוק בתרבית רקמת 2D היא עדיין לא התאמנה במעבדות רבות, אם כי מספר פרסומים בצטטו תרבית תאי 3D צומח (עלייה של 8-פי ב -10 השנים האחרונות. מקור : 'תוצאות לפי שנת PubMed כלי ומישש עם' תרבות 3D ').
כתב יד זה מתאר את ההגדרה ותנאי הפעלה של מערכת HFB עבור תרבית תאי יונקים והדגים השירות שלה culturing הקו הסלולרי hepatocarcinoma HepG2 / C3A. מטרת השיטה היא תרבות התאיםיותר מערכת תרבות בעיצומו-כמו אשר שומרת מספיק פשטות כדי להפוך אותו נוחה לאלה שחדשים מערכות תרבות 3D. הרציונל העומד מאחורי שימוש HFBs ביישום מתואר כאן, אשר הוא לשפר את יכולת החיזוי של מודלים כבדים היא כי זה אפשרי תיאורטית לחקות סינוסואידה כבד בתוך סביבת HFB 22. זה לא ריאלי כרגע עם מערכות תרבות אחרות.
כתב יד זה מתאר את הפעולה Set-up and של bioreactor סיבים חלולים (HFB) מערכת עבור תרבית תאים יונקים השירות שלה באה לידי ביטוי מתרבים הקו הסלולרי hepatocyte HepG2 / C3A. המערכת נועדה להתאים על המדף של חממה סטנדרטית ההגדרה שלה הוא פשוט מספיק כדי להתבצע על ידי כל ביולוג של תא מוסמך מכיר טכניקה מזוהמת.
הסיבים המשמשים במערכת המחקר המתואר כאן מיוצרים בבית על ידי ספין היפוך פאזה יציקה (ספינינג) באמצעות פולימר קניינית מתכלות. זה אפשרי לעשות סיבים ידי ספינינג ממגוון חומרים המתאימים תרבית תאים, הן מתכלות ובלתי מתכלים, למשל; polycaprolactone (PCL) 27, חומצה פולי-L-lactide (PLLA) 28, פולי (לקטית-שיתוף גליקולית וחומצה) (PLGA) 29, פוליסולפון (PSU) 12 ו polyetheretherketone (פיק) 13. לכל מאפיינים שונים בתnd צריך להיבחר בהתבסס על הצרכים של המערכת. בדוק את התאימות של הסיבים המועסקים עם אתנול המשמש צעד העיקור. PLGA ידוע plasticize עם אתנול דבר המחייב טיפול אלטרנטיבי כגון פתרון אנטיביוטי / antimycotic 25.
הממדים של מודולים הזכוכית משמשים כאן נבחרו בהתבסס על הצרכים של המחקר הנוכחי. בגדלים שונים יכול להיעשות על ידי כל חברה נושבת זכוכית מכובדת. שיקול בגודל מודול הוא מספר התאים, אשר קשור למספר הסיבים במודול וספיקות סבירות. ככל תאים יש המודול שבו הספיקות גבוהות צריכות להיות על מנת לשמור על תנאי תרבות חיוביים בסוף היצוא של bioreactor. זה יגיע מגבלה כמה נקודות וכמה ניסוי וטעייה עשויים להידרש עם ניטור של תנאי התקשורת לפעפע מודול. מודלים מתמטיים עשויים לספק כמה תובנה לתוך דימן מודול נדרשוהצטרפויות וספיקות 22.
הממדים של המנגנון המשמש כאן נועד כדי להתאים אותו מדף חממה. אורכו של הצינור מוכתב על ידי אורך צורך להגיע בין המחברים בזמן גם מה שמאפשר מספיק תנועה של רכיבים כדי לאפשר הגדרה ותפעול. אם הדגימה כמובן זמן נדרש, למשל ניטור של תנאי התקשורת במודול לחלחל ואז יציאות הזרקה ניתן להוסיף גם את retentate ויחלחל קווים כדי להקל על זה.
תנאי מוקדם לכל מערכת תרבית תאים הוא לשמור על תאים בחיים וברוב המקרים גדלו. לאור המחקרים מפגינים יותר in vivo-כמו פנוטיפ בתאים גדלים במערכת תרבות 3D זה גם נראה חשוב לספק סביבה תחקה את הסביבה vivo נתקלה ידי התאים. נקודה אחרונה זו לעיתים קרובות מוזנחת תרבית תאים 2D לטובת נוחות מערכת התרבות הזאת מציעה. Tהוא HFB מחק ברשתות נימי vivo על ידי מתן חומרים מזינים את התאים דרך לומן של סיבים. את חומרי הפסולת יוסרו גם מהמערכה ידי הזרימה הדינמית. זה יוצר מערכת in vivo-כמו תרבית תאים, וכזה המחקה את הסביבה vivo בעיני hepatocytes, מה שהופך מערכת זו בחירה טובה יותר לעומת פלסטיק בתרבית רקמה 2D עבור culturing תאים אלה. הדברים מקבלים תימוכין גם עובדת התאים מפרישים 15-לקפל את כמות אלבומין, פונקציה כבדה חשובה, במערכת התרבות HFB בהשוואה לאלו גדלו על פלסטיק בתרבית רקמת 2D.
בעוד מערכת HFB מתאימה רוב אם לא כל סוגי התאים התלויים למעגן, הדוגמא כאן היא עבור hepatocytes כי קיים צורך אמיתי להיות מסוגל תרבות פונקציונלית, יותר in vivo-כמו hepatocytes לשימוש בפיתוח תרופות על ידי תעשיית התרופות ובמכשירי הכבד bioartificial על התמיכה extracorporealמחולים אי ספיקת כבד. צורך התאים פונקציונליים יותר חורג דוגמאות אלה, במיוחד כשדה של רפואת רגנרטיבית נכנס לשלב עבודת translational. היתרונות של סביבת תרבות יותר in vivo-כמו לא צריכים להתעלם.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |