Le comportement fonctionnel des cellules en culture peut être améliorée par la mise en culture plus in vivo -comme des milieux de culture de 16-21 3 dimensions. Ce manuscrit décrit la mise en place et le fonctionnement d'un système de bioréacteur à fibres creuses pour vivo -comme mammifère culture de tissus dans.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
La culture tissulaire est une technique bien établie pour la croissance et / ou le maintien des cellules qui ont été utilisés pour plus de 100 ans 1,2. La commodité des cellules qui étudient et réponses ex vivo a de vastes avantages permettant des expériences qui seraient autrement extrêmement difficile , sinon impossible, par exemple la génération de lignées cellulaires génétiquement modifiées et l'utilisation de cellules rapporteurs en haut débit des tests de criblage 3. Plus récemment , une culture tissulaire a donné naissance au domaine de l' ingénierie tissulaire, pour la génération de modèles in vitro et pour la médecine régénératrice. Avec ces applications, l'intérêt pour dynamiques en 3 dimensions (3D) des systèmes de culture a augmenté de manière significative.
Les méthodes de culture en 3D (définies ici comme substrat de culture 3D et / ou l'introduction de l' écoulement dynamique directionnelle) à mieux récapituler l'architecture de l'environnement cellulaire in vivo importante pour parvenir à unplus fonction physiologique semblable. La capacité d'extraire, de grandir, de se différencier et de cellules de transplantation dans le but de réparer des tissus malades et endommagés est un champ d'étude qui a un énorme potentiel pour le bénéfice des patients et opportunité commerciale. Par exemple l'utilisation de kératinocytes autologues pour traiter les brûlures (voir 4) et l'utilisation des thérapies à base de cellules pour le traitement des accidents vasculaires cérébraux (voir 5). De même, le marché des modèles in vitro couvre la découverte de médicaments pour des applications en médecine stratifiée. La convention dans la culture tissulaire est la croissance de types de cellules adhérentes ou dépendantes d'ancrage sur le (2D) de surface 2 dimensions d'un flacon de culture tissulaire. Alors actuellement acceptée comme la norme d'or dans un contexte de recherche, l' intérêt récent dans les applications d'ingénierie tissulaire a mis en évidence le fait que l' environnement actuel de la culture de tissus 2D est insuffisante pour la mise à l' échelle requise dans la production de cellules 6.
Pour les types de cellules adhérentes un de scaffold est nécessaire, ce qui varie en fonction de l'utilisation finale, en termes de composition chimique et les propriétés mécaniques. Certains systèmes utilisent des échafaudages comme inserts bien-plaques constituées d' une matrice hautement poreuse formée à partir interne élevée templating phase d'émulsion (voir 7) ou des fibres électrofilées (voir 8) nécessitant un minimum d' adaptation des techniques de culture 2D classiques. Les cellules peuvent être ensemencées sur des microsupports de compositions variées et cultivées dans des cuves agitées qui fournissent des nutriments et des molécules de signalisation, et emportent les déchets (transport de masse) dans un environnement bien mélangé dynamique 9. Toutefois, ces systèmes sont limités dans leur vivo -comme l' environnement et d' autres améliorations peuvent être apportées en ce qui concerne d'intensifier les coûts. Bioréacteurs à fibres creuses (HFBs) sont un système de culture en 3D qui se composent de fibres fixées dans un module avec des cellules typiquement ensemencées à l'extérieur des fibres poreuses et des supports fournis à travers la lumière de la fibre (revue dans 10) (figure 1). HFBs offrent une vivo -like environnement avec les fibres mimant les capillaires sanguins et de blindage des cellules à partir des contraintes de cisaillement associées à la fourniture de médias dynamique, tout en permettant à un cisaillement défini à appliquer aux cellules par l' intermédiaire d'un écoulement de fluide à travers les orifices latéraux si on le souhaite. Cela crée un système de culture polyvalent avec le transport de masse supérieure dans laquelle les densités cellulaires élevées peuvent être atteintes 11. Le système de HFB est bien adapté pour le maintien de types de cellules dépendantes de l' ancrage et a été utilisée pour la culture d' une variété de cellules , y compris le rat des îlots pancréatiques de Langerhans 12, β-TC-3 souris insulinome lignée cellulaire 12, les hépatocytes humains primaires 13, de l' os humain les cellules mononucléées de la moelle 14, les cellules Madin Darby canine rénaux (MDCK) 15 et cellules Caco-2 16 pour ne citer que quelques – uns.
En plus des avantages du système de transfert de masse et de mise à l'échelle, les cellules cultivées en 3D tissystèmes de culture Sue ont tendance à être plus in vivo -comme dans la morphologie et plus sensible aux signaux expérimentaux. Par exemple , chez le rat hépatocytes primaires présentent une morphologie plus cuboïde, la viabilité accrue, une plus grande induction d' une activité enzymatique cytochrome P450 et une sensibilité accrue à la toxicité du paracétamol lorsqu'il est cultivé dans un échafaudage de polystyrène disponibles dans le commerce comparées à des cellules cultivées en culture 2D 17. En utilisant le même échafaudage de la lignée cellulaire d'hépatocarcinome HepG2 a également été montré pour augmenter la production d'albumine 18 et montrent une plus in vivo -comme réponse au méthotrexate par rapport à 2D cellules cultivées 19. Hépatocytes humains primaires ont démontré dédifférenciation retardé, l' accroissement des activités cytochrome P450 et augmentation de la clairance pour 4/5 des composés testés dans un système de culture de perfusion 20. cellules souches neurales humaines neurones dérivés et glie en culture dans un polystyrène échafaudage disponibles dans le commerce présentent à la fois élevé (potentiel d'action) et à faible Frequency (potentiel de champ local) d'activité spontanée alors qu'aucune activité neuronale a été détectée dans les cellules cultivées en 2D 21. Les cellules Caco-2 ont montré une différenciation accrue dans un HFB par rapport à la culture 2D mesurée par l' augmentation de la phosphatase alcaline, γ-glutamyl transférase et l' activité P-glycoprotéine et une expression plus élevée de F-actine et de zona occludens-1 protéine 16. Malgré les avantages, la mise en culture de routine de cellules dans des systèmes autres que la surface du ballon de culture de tissus 2D est toujours pas pratiquée dans de nombreux laboratoires, bien que le nombre de publications citant la culture cellulaire 3D est en croissance (augmentation de 8 fois au cours des 10 dernières années. Source : PubMed 'Résultats par année' outil sondé avec la «culture 3D»).
Ce manuscrit décrit la mise en place et les conditions de fonctionnement d'un système HFB pour la culture de cellules de mammifères et démontre son utilité dans la culture de la lignée cellulaire d'hépatocarcinome HepG2 / C3A. Le but de cette méthode consiste à cultiver les cellules enun système de type vivo plus dans la culture qui conserve assez de simplicité pour la rendre prête à ceux qui sont nouveaux systèmes de culture 3D. La raison derrière l' utilisation de HFBs dans l'application décrit ici, ce qui est d'améliorer la prévisibilité des modèles de foie est qu'il est théoriquement possible d'imiter une sinusoïde hépatique dans l'environnement HFB 22. Cela ne veut pas actuellement réalisable avec d'autres systèmes de culture.
Ce manuscrit décrit la mise en place et le fonctionnement d'un système creux bioréacteur de fibres (HFB) pour la culture de cellules de mammifères et de son utilité est démontrée dans la prolifération de la lignée cellulaire d'hépatocytes HepG2 / C3A. Le système est conçu pour tenir sur l'étagère d'un incubateur standard et sa mise en place est suffisante pour être effectuée par tout biologiste cellulaire compétent familier avec une technique aseptique simple.
Les fibres utilisées dans le système de recherche décrit ici sont fabriqués en interne par inversion de phase coulée centrifuge (spinning) en utilisant un polymère breveté non-biodégradable. Il est possible de fabriquer des fibres par filage à partir d'une variété de matériaux appropriés pour la culture cellulaire, à la fois biodégradables et non biodégradables, par exemple; polycaprolactone (PCL) 27, l' acide poly-L-lactide (PLLA) 28, le poly (acide lactique-co-glycolique) (PLGA) 29, de la polysulfone (PSU) et de 12 polyétheréthercétone (PEEK) 13. Chacun a des propriétés différentes d'une doit être choisi en fonction des besoins du système. Vérifier la compatibilité de la fibre utilisée avec l'éthanol utilisé dans l'étape de stérilisation. PLGA est connu pour plastifier avec de l' éthanol nécessitant un traitement alternatif, comme antibiotique / antimycosique solution 25.
Les dimensions des modules de verre utilisés ici ont été choisis en fonction des besoins de la recherche actuelle. Différentes tailles peuvent être faites par une entreprise de soufflage de verre de bonne réputation. Une considération de la taille du module est le nombre de cellules, qui est liée au nombre de fibres dans le module et de débits possibles. Les plus de cellules, il y a dans le module plus les débits devront être afin de maintenir des conditions de culture favorables à l'extrémité de sortie du bioréacteur. Cela va atteindre une limite un certain point et quelques essais et erreurs peuvent être nécessaires à la surveillance des conditions de médias dans le module perméat. La modélisation mathématique peut fournir quelques indications sur les dimen module requissions et des débits 22.
Les dimensions de l'appareil utilisé ici est conçu pour tenir sur une durée de l'incubateur. La longueur du tube est dictée par la longueur nécessaire pour atteindre entre les connecteurs tout en permettant un mouvement suffisant de composants pour permettre l'installation et le fonctionnement. Si l'échantillonnage au cours du temps est nécessaire, par exemple dans le suivi des conditions des médias dans le module perméat puis ports d'injection peuvent être ajoutés au rétentat et le perméat lignes pour faciliter cela.
Une condition préalable à tout système de culture cellulaire est de garder les cellules vivantes et dans la plupart des cas de plus en plus. À la lumière des études démontrant une plus in vivo -comme phénotype dans les cellules cultivées dans des systèmes de culture 3D , il semble également important de fournir un environnement qui imite étroitement l'environnement in vivo rencontré par les cellules. Ce dernier point est souvent négligé dans la culture cellulaire 2D en faveur de la commodité de ce système de culture offre. Til HFB mimétiques dans les réseaux capillaires in vivo en fournissant des nutriments aux cellules à travers la lumière des fibres. Les déchets sont éliminés du système par l'écoulement dynamique. Cela crée un système de type in vivo dans la culture cellulaire et qui imite étroitement l'environnement in vivo vu par les hépatocytes, ce qui rend ce système , un meilleur choix par rapport à 2D culture tissulaire en matière plastique pour la culture de ces cellules. Ceci est corroboré par le fait que les cellules sécrètent 15 fois la quantité d'albumine, une fonction hépatique importante, dans le système de culture HFB par rapport à ceux qui sont cultivés sur 2D culture de tissus en plastique.
Alors que le système HFB est adapté à la plupart des cas tous les types non d' ancrage de cellules dépendantes, l'exemple ici est pour hépatocytes parce qu'il ya un réel besoin d'être en mesure de la culture fonctionnelle, plus in vivo -comme hépatocytes pour une utilisation dans le développement de médicaments par l'industrie pharmaceutique et dans les dispositifs de foie bioartificiel pour le soutien extracorporelledes patients souffrant d'insuffisance hépatique. Le besoin de plus de cellules fonctionnelles va au-delà de ces exemples, en particulier le domaine de la médecine régénérative entre dans une phase de travail de traduction. Les avantages d'un environnement plus vivo -comme dans la culture ne doivent pas être négligés.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |