El comportamiento funcional de las células en cultivo puede ser mejorado por cultivo en más in vivo -como ambientes de cultivo 3-dimensionales 16-21. Este manuscrito describe la puesta en marcha y operación de un sistema de fibra hueca para el biorreactor -como el cultivo de tejidos en mamíferos in vivo.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
El cultivo de tejidos es una técnica establecida para el crecimiento y / o mantenimiento de las células que se ha utilizado durante más de 100 años 1,2. La conveniencia de las células que estudian y respuestas ex vivo tiene profundas ventajas que permiten experimentos que de otro modo sería extremadamente difícil, si no imposible, por ejemplo la generación de líneas de células de ingeniería genética y el uso de células indicadoras en ensayos de cribado de alto rendimiento 3. Más recientemente cultivo de tejidos ha dado lugar al campo de la ingeniería de tejidos, para la generación de modelos in vitro y para la medicina regenerativa. Con estas aplicaciones, el interés en los sistemas de cultivo dinámicas de 3 dimensiones (3D) ha crecido de manera significativa.
Métodos de cultivo 3D (definidos aquí como un sustrato de cultivo 3D y / o la introducción de flujo dinámico direccional) recapitular mejor la arquitectura del entorno celular in vivo, importante para lograr unamás función fisiológica similar. La capacidad de extraer, crecer, diferenciarse y células de trasplante con el objetivo de reparar el tejido dañado y enfermo es un campo de estudio que tiene un enorme potencial para el beneficio del paciente y la oportunidad comercial. Por ejemplo el uso de queratinocitos autólogos para el tratamiento de quemaduras (véase 4) y el uso de terapias basadas en células para el tratamiento del accidente cerebrovascular (ver 5). Asimismo, el mercado de los modelos in vitro se extiende por el descubrimiento de fármacos para aplicaciones de medicina estratificados. La convención en cultivo de tejidos es el crecimiento de tipos de células dependientes de anclaje o adherentes en la superficie de 2 dimensiones (2D) de un matraz de cultivo de tejidos. Mientras que actualmente aceptado como el estándar de oro en un contexto de investigación, el reciente interés en aplicaciones de ingeniería de tejidos ha puesto de relieve el hecho de que el medio ambiente actual de cultivo de tejidos 2D es inadecuada para la ampliación requerida en la producción de 6 celdas.
Para los tipos de células adherentes un scaffold se requiere, que variará dependiendo del uso final, tanto en términos de la composición química y propiedades mecánicas. Algunos sistemas emplean como andamios insertos de placa de pocillos que consisten en la matriz altamente porosa formada a partir de plantillas de alta emulsión de fase interna (ver 7) o fibras electrospun (véase 8) que requieren la adaptación de las técnicas de cultivo mínimo 2D convencionales. Las células pueden ser sembradas en microvehículos de diferentes composiciones y se cultivaron en tanques agitados que proporcionan nutrientes y moléculas de señalización, y llevar los productos de desecho (transporte de masas) a través de un entorno bien mezclado dinámico 9. Sin embargo, estos sistemas están limitados en su vivo -como medio ambiente y mejoras adicionales se pueden hacer con respecto a aumentar la escala de costes. Biorreactores de fibra hueca (HFBs) son un sistema de cultivo 3D que constan de fibras fijas en un módulo con las células sembradas típicamente en el exterior de las fibras porosas y medios entregados a través del lumen de fibra (revisado en 10) (Figura 1). HFBs ofrecen un entorno in vivo -como con las fibras imitan los capilares sanguíneos y los blindajes de las células a partir de los esfuerzos de corte asociados con la entrega de medios dinámica, al tiempo que permite al cizallamiento se define para ser aplicado a las células a través de los flujo de fluido a través de los puertos secundarios si se desea. Esto crea un sistema de cultivo versátil con el transporte de masa superior en la que la alta densidad de células se puede llegar a 11. El sistema de HFB es muy adecuado para el mantenimiento de tipos de células dependientes de anclaje y se ha usado para cultivar una variedad de células incluyendo rata islotes pancreáticos de Langerhans 12, línea celular de insulinoma 12, los hepatocitos humanos primarios 13 de ratón-TC-3 β, hueso humano células mononucleares de médula ósea 14, las células Madin Darby de riñón canino (MDCK) 15 y Caco-2 células 16 para nombrar unos pocos.
Además de las ventajas del sistema de transferencia de masa y de ampliación, las células cultivadas en 3D tisLos sistemas de cultivo sue tienden a ser más in vivo -como en la morfología y más sensible a las señales experimentales. Por ejemplo hepatocitos de rata primarios muestran una morfología más cúbico, el aumento de la viabilidad, la mayor inducción de la actividad de la enzima citocromo P450 y el aumento de la sensibilidad a la toxicidad del paracetamol cuando se cultiva en un andamio de poliestireno disponible en el mercado en comparación con las células que crecen en cultivo 2D 17. Usando el mismo andamio la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 también se ha demostrado que aumenta la producción de albúmina 18 y muestran una más in vivo -como respuesta al metotrexato en comparación con las células cultivadas 2D 19. Hepatocitos humanos primarios demostraron desdiferenciación retardada, una mayor actividad del citocromo P450 y un mayor espacio libre para 4/5 compuestos ensayados en un sistema de cultivo de perfusión 20. de células madre neurales humanas neuronas derivadas y células gliales cultivadas en un andamio de poliestireno disponibles comercialmente exhibidos tanto alta (potencial de acción) y de bajo frequeNCY (potencial de campo local) la actividad espontánea mientras que ninguna actividad neuronal se detectó en las células cultivadas 2D 21. Las células Caco-2 demostraron una mayor diferenciación en un HFB comparación con el cultivo 2D medido por el aumento de la fosfatasa alcalina, γ-glutamil transferasa y la actividad de P-glicoproteína y una mayor expresión de F-actina y Zona occludens-1 de proteína 16. A pesar de las ventajas, el cultivo de rutina de las células en sistemas distintos de una superficie del matraz de cultivo de tejido 2D todavía no se practica en muchos laboratorios, aunque el número de publicaciones que citan el cultivo de células 3D está creciendo (aumento de 8 veces en los últimos 10 años. Fuente : PubMed 'resultados por Año' herramienta se sondeó con la "cultura 3D ').
Este manuscrito describe la configuración y las condiciones de funcionamiento de un sistema de HFB para el cultivo de células de mamíferos y demuestra su utilidad en el cultivo de la línea celular de hepatocarcinoma HepG2 / C3A. El objetivo de este método es para cultivar las células enun sistema más in vivo -como cultura que retiene suficiente sencillez para que sea susceptible de aquellos que son nuevos en los sistemas de cultivo en 3D. La razón detrás de la utilización HFBs en la aplicación describir aquí, que es mejorar la previsibilidad de los modelos del hígado es que es teóricamente posible para imitar una sinusoide hepático dentro del entorno HFB 22. Esto no es factible en la actualidad con otros sistemas de cultivo.
Este manuscrito describe la puesta en marcha y operación de un sistema de fibra hueca biorreactor (HFB) para el cultivo de células de mamíferos y su utilidad se demuestra en la proliferación de la línea celular de hepatocitos HepG2 / C3A. El sistema está diseñado para encajar en el estante de una incubadora estándar y su configuración es suficiente para ser llevado a cabo por cualquier biólogo celular competente familiarizado con la técnica aséptica simple.
Las fibras utilizadas en el sistema de investigación que se describe aquí se fabrican en casa por el giro de fundición de inversión de fases (spinning) usando un polímero patentado no biodegradable. Es posible hacer las fibras por hilado a partir de una variedad de materiales adecuados para el cultivo celular, tanto biodegradables y no biodegradables, por ejemplo; policaprolactona (PCL) 27, ácido poli-L-lactida (PLLA) 28, poli (ácido láctico-co-glicólico) (PLGA) 29, polisulfona (PSU) 12 y polieteretercetona (PEEK) 13. Cada uno tiene diferentes propiedades de unaNewcastle deberán ser elegidos en base a las necesidades del sistema. Comprobar la compatibilidad de la fibra empleada con el etanol utilizado en la etapa de esterilización. PLGA se sabe que plastifica con etanol que requiere un tratamiento alternativo como antibiótico / antimicótico solución 25.
Las dimensiones de los módulos de vidrio utilizadas aquí fueron elegidos en base a las necesidades de la investigación actual. Los diferentes tamaños se pueden hacer por cualquier compañía de soplado de vidrio de buena reputación. Una consideración en el tamaño del módulo es el número de células, que está vinculada al número de fibras en el módulo y caudales probables. Los más células que hay en el módulo de la más altas las velocidades de flujo deberán ser con el fin de mantener condiciones de cultivo favorables en el extremo de salida del biorreactor. Esto llegará a un límite en cuanto algún momento y un poco de ensayo y error puede ser requerida con el monitoreo de las condiciones del medio en el permeado módulo. La modelación matemática puede proporcionar algunas ideas sobre las dimen módulo requeridossiones y velocidades de flujo 22.
Las dimensiones del aparato usado aquí está diseñado para que quepan en un estante incubadora. La longitud de la tubería es dictada por la longitud necesaria para llegar entre los conectores permitiendo al mismo tiempo también suficiente movimiento de los componentes para permitir la puesta en marcha y funcionamiento. Si se requiere el muestreo curso de tiempo, por ejemplo en el control de las condiciones de los medios en el módulo de impregnar a continuación, puertos de inyección se pueden añadir al producto retenido y permeado líneas para facilitar esto.
Un requisito previo para cualquier sistema de cultivo celular es mantener vivas las células y en la mayoría de los casos en crecimiento. A la luz de los estudios que demuestran un mayor in vivo -como fenotipo en las células cultivadas en sistemas de cultivo 3D también parece importante para proporcionar un entorno que imita el entorno en vivo encontrado por las células. Este último punto es a menudo descuidado en cultivo celular 2D a favor de la comodidad ofrece este sistema de cultivo. Tque HFB imita en redes capilares in vivo mediante la entrega de nutrientes a las células a través del lumen de las fibras. Los productos de desecho también se eliminan del sistema por el flujo dinámico. Esto crea un sistema in vivo -como para el cultivo celular y uno que imita el entorno en vivo visto por los hepatocitos, lo que hace este sistema una mejor opción en comparación con 2D de plástico de cultivo de tejidos para el cultivo de estas células. Esto es corroborado por el hecho de que las células secretan 15 veces la cantidad de albúmina, una función hepática importante, en el sistema de cultivo HFB en comparación con las cultivadas en 2D plástico de cultivo de tejidos.
Mientras que el sistema de HFB es adecuado para la mayoría si no todos los tipos de células dependientes de anclaje, el ejemplo aquí es para hepatocitos porque hay una necesidad real para poder cultura funcional, más in vivo -como hepatocitos para su uso en el desarrollo de fármacos por la industria farmacéutica y en el hígado artificial extracorpóreo para el apoyode pacientes con insuficiencia hepática. La necesidad de más células funcionales extiende más allá de estos ejemplos, en particular como el campo de la medicina regenerativa entra en una fase de trabajo de la traducción. Las ventajas de un entorno de cultivo in vivo más -como no deben pasarse por alto.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |