Summary
De functionele gedrag van cellen in kweek kan worden verbeterd door het kweken meer in vivo-achtige 3-dimensionale kweek omgevingen 16-21. Dit manuscript beschrijft de opzet en exploitatie van een holle vezel bioreactor systeem voor in vivo-achtige zoogdieren weefselkweek.
Introduction
Weefselkweek is een gevestigde techniek voor de groei en / of onderhouden van cellen die is gebruikt voor meer dan 100 jaar 1,2. Het gemak van het bestuderen cellen en reacties ex vivo heeft verreikende voordelen waardoor experimenten die anders zeer moeilijk zo niet onmogelijk is, bijvoorbeeld de productie van genetisch gemanipuleerde cellijnen en het gebruik van reporter cellen in high throughput screening assays 3. Recenter weefselkweek heeft geleid tot het gebied van weefselmanipulatie gegeven voor het genereren van in vitro modellen en regeneratieve geneeskunde. Met deze toepassingen, is de belangstelling voor dynamische 3-dimensionale (3D) kweeksystemen aanzienlijk gegroeid.
3D kweekmethoden (hier gedefinieerd als 3D cultuur substraat en / of de introductie van directionele dynamische stroom) beter recapituleren de architectuur van de in vivo cellulaire omgeving, belangrijk voor het bereiken van eenmeer fysiologische-achtige functie. Het vermogen om te extraheren, groei, differentiatie en transplantatie cellen met als doel het herstellen zieke en beschadigde weefsel een vakgebied dat een enorm voordeel voor de patiënt en commercieel potentieel heeft. Bijvoorbeeld het gebruik van autologe keratinocyten voor behandeling van brandwonden (zie 4) en het gebruik van celtherapie voor de behandeling van een beroerte (zie 5). Ook de markt voor in vitro modellen overspant preklinisch onderzoek gestratificeerd geneeskunde toepassingen. De conventie in weefselkweek is de groei van hechtende of ankerplaats soorten afhankelijk zijn cel op de 2-dimensionale (2D) oppervlak van een weefselkweek kolf. Terwijl momenteel aanvaard als de gouden standaard in een onderzoeksomgeving, heeft de recente interesse in tissue engineering-toepassingen gewezen op het feit dat de huidige 2D weefselkweek omgeving is onvoldoende voor de gewenste opschaling in cel productie 6.
Voor hechtende celtypen een scaffold is vereist, die zal variëren afhankelijk van het eindgebruik, zowel wat betreft de chemische samenstelling en mechanische eigenschappen. Sommige systemen maken gebruik van steigers en-plaat inserts die bestaat uit zeer poreuze matrix gevormd uit hoge interne fase emulsie template (zie 7) of electrospun vezels (zie 8) vereist minimale aanpassing van conventionele 2D kweektechnieken. Cellen kunnen worden gezaaid op microdragers van wisselende samenstelling en gekweekt in geroerde tanks die voedingsstoffen en signaalstoffen te leveren, en weg te voeren afvalstoffen (massatransport) door middel van een dynamische en gemengde omgeving 9. Echter, deze systemen beperkt in hun in vivo-achtige omgeving en verder kan worden verbeterd met betrekking tot opschaling kosten. Holle vezel bioreactoren (HFBs) zijn een 3D kweeksysteem dat bestaat uit een module met cellen meestal gezaaid op de buitenzijde van de poreuze vezels en media die door de vezel lumen vaste vezels (besproken in 10) (figuur 1). HFBs bieden een in vivo-achtige omgeving met de vezels nabootsen van bloedvaten en het afschermen van de cellen van de schuifspanning die aan dynamische media delivery, terwijl gedefinieerde shear via fluïdumstroming toe te passen op de cellen via de zijpoorten indien gewenst. Dit zorgt voor een veelzijdige cultuur systeem met superieure massatransport waarin hoge celdichtheden kan worden bereikt 11. Het HFB systeem is zeer geschikt voor het onderhoud van verankering afhankelijke celtypes en is gebruikt om de cultuur verschillende cellen waaronder rat pancreatische eilandjes van Langerhans 12, muis β-TC-3 insulinoma cellijn 12, primaire humane hepatocyten 13, menselijk bot beenmerg mononucleaire cellen 14, Madin Darby niercellen van honden (MDCK) 15 en Caco-2 cellen 16 te noemen.
Naast het systeem voordelen van diffusie en opschaling, gekweekt in 3D tissue cultuur systemen hebben de neiging meer in vivo-achtige in morfologie en meer inspelen op experimentele signalen te zijn. Bijvoorbeeld rat hepatocyten vertonen een kubische morfologie, verhoogde levensvatbaarheid grotere inductie van cytochroom-P450 enzym activiteit en verhoogde gevoeligheid voor paracetamol toxiciteit wanneer gekweekt in een commercieel verkrijgbare polystyreen scaffold vergeleken met cellen gekweekt in 2D kweek 17. Met dezelfde scaffold hepatocarcinoma de cellijn HepG2 werd ook aangetoond dat albumine productie verhogen en 18 een in vivo vertonen achtige respons op methotrexaat vergelijking met 2D-gekweekte cellen 19. Primaire humane hepatocyten aangetoond vertraagde dedifferentiatie, hogere cytochroom P450 activiteit en een verhoogde klaring voor 4/5 verbindingen getest in een perfusie kweeksysteem 20. Menselijke neurale stamcellen afgeleid neuronen en glia gekweekt in een commercieel verkrijgbare polystyreen steiger vertoonden zowel hoge (actiepotentiaal) en lage-frequency (lokale veld potentiële) spontane activiteit terwijl er geen neuronale activiteit werd gedetecteerd in de 2D-gekweekte cellen 21. Caco-2 cellen toonden verbeterde differentiatie in een HFB vergelijking met 2D kweek gemeten door verhoogde alkalische fosfatase, γ-glutamyltransferase en P-glycoproteïne activiteit en de expressie van F-actine en zona occludens-1 eiwit 16. Ondanks de voordelen, wordt de routine kweken van cellen anders dan een 2D weefselkweek kolf oppervlaktesystemen nog niet toegepast in veel laboratoria, hoewel het aantal publicaties citeren 3D celkweek groeit (8-voudige toename in de afgelopen 10 jaar. Source : PubMed 'Resultaten per Year' hulpmiddel onderzocht met '3D-cultuur').
Dit manuscript beschrijft de set-up en de werkomstandigheden van een HFB systeem voor zoogdiercellen cultuur en toont zijn nut in het kweken van de hepatocarcinoma cellijn HepG2 / C3A. Het doel van deze methode is de cellen te kweken ineen in vivo-achtige cultuur systeem dat genoeg eenvoud behoudt om het vatbaar zijn voor diegenen die nieuw zijn voor 3D-cultuur systemen. De grondgedachte achter het gebruiken HFBs de toepassing beschrijven hier namelijk het verbeteren van de voorspelbaarheid van levermodellen is dat het theoretisch mogelijk is om een leversinusoid nabootsen in het milieu 22 HFB. Dit is momenteel niet haalbaar is met andere kweeksystemen.
Protocol
1. Vezels
- Vervaardiging van de vezels door de fase-inversie rotatie casting (spinning). Details van deze methode zijn in 23,24.
Opmerking: Voor dit werk de vezels worden vervaardigd in-house gebruik van een niet-bioafbreekbaar polymeer proprietary, NMP als oplosmiddel en H 2 O als niet-oplosmiddel. Details van andere geschikte polymeren zijn te vinden in de discussie. De vezels die in het hier beschreven systeem 1.05mm buitendiameter met een 600-700 urn lumendiameter. De vezels zijn poreus poriediameters meten van 2,28 pm ± 1,5 urn (gemiddelde ± standaarddeviatie). Dit is bedoeld om cellen te scheiden van het materiaaltransport in de vezel lumen, repliceren de lever sinusoïde of vasculatuur van andere weefsels. Vezels kunnen ook worden gekocht bij membraanleveranciers zoals Pall.
2. Module Fabrication
OPMERKING: De modules die in dit onderzoek zijn gemaakt van 1 mm dik boorsilicaatglas met 2 zijpoorten(Figuur 2A). De vezels in de beschreven module een buitenste oppervlak van 4,95 cm2 die gelijk aan ongeveer de helft van een putje van een 6-wells plaat.
- Siliconize modules voor het eerste gebruik van het coaten van het binnenoppervlak met Sigmacote (Tabel 1) en laten drogen in een zuurkast. Autoclaaf (121 ° C, 1 atm, 20 min) om de levensduur van de behandeling verhogen.
- Met behulp van een scalpel gesneden 75 mm lange vezels en plaats drie vezels in elke module verlaten ~ 7 mm extra lengte aan elk uiteinde (figuur 3A).
- Plaats ~ 0,5 ml siliconenlijm (Tabel 1) in een weegschuitje. Gebruik een P200 pipet tip te halen een kleine hoeveelheid silicone en werk de lijm in de uiteinden van de module rond de vezels naar een 3-5 mm plug (Figuur 3B) te vormen. Laten drogen> 3 uur.
- Met behulp van een scalpel te snijden de siliconen gelijk met de glas-module uiteinden (figuur 3C).
- wikkel eenkleine hoeveelheid (~ 4 lagen) van polytetrafluorethyleen (PTFE) tape rond één zijpoort.
3. System Setup en Sterilisatie
OPMERKING: Pompslangen en modules met vezels worden niet geautoclaveerd en worden gesteriliseerd met behulp van 70% ethanol. De auteurs bevelen kalibreren van de pompslang met de pomp te gebruiken. De onderstaande procedure wordt uitgevoerd in een laminaire stroming kap uitgevoerd.
- Autoclaaf (in paragraaf 2.1) alle autoclaveerbaar componenten voorafgaand aan de set-up.
- Opstelling
- Breng 10 ml 70% ethanol in het reservoir fles en het opzetten van het reservoir fles, Q-serie cap, vulopening, pomp en de pomp buis (tabel 1), zoals in figuur 4.
- Losjes Plaats een eindkap over de PTFE-afgeplakte zijpoort. Schuif de uiteinden van de L / S16 moduleconnectoren via module uiteinden en vrije zijpoort. Sluit een 40 mm gedeelte van L / S13 slang aan de module connector dichtst bij de afgetopte zijpoort (Tabel 1) zoals in figuur 2B
- Sluit de module aan de pomp buizen, zorgen om de module te oriënteren zodat de bedekte zijpoort is het dichtst bij de pomp.
- Sluit de permeaatleiding en retentaat lijn naar de moduleconnectoren en L / S14 de Y-connector op het reservoir fles (tabel 1). Zorg ervoor dat de set-up lijkt op het schema in figuur 4.
- Sterilisatie
- Pomp ethanol via de module bij 800 pl / uur (267 pl / hr per vezel) voor genoeg tijd om unautoclaved onderdelen voor> 30 min te behandelen (pas keer als er andere steriliseren van methoden worden gebruikt, zie 25).
- Wassen
- Om de ethanol uitwassen van het systeem, schakelt u eerst de pomp en laat de slang. Ten eerste, verwijder de pomp slang van de module adapter slang. Houd de module omhoog naar de ethanol weglopen van de vezels en retentaat lijn, terug in het reservoir fles. Verwijder de zijpoort einde dop van de module e uitlekkene ethanol uit de module zelf, en de permeaatleiding. Maak de zijpoort einde cap. Omkeren van de stroom van media op de pomp aan de pomp slang en diervoeders lijn van ethanol uitlekken. Schakel de pomp, en sluit de pomp slang aan op de module adapter.
- Schroef de ethanol fles uit het deksel en te vervangen door een fles met 10 ml van de celgroei medium (zoals EMEM, GMEM, DMEM of RPMI) zonder serum. Pomp het medium door het systeem bij 800 pl / uur, totdat het retentaat lijn zit vol met media. Klem de retentaat lijn te doordringen van de media te dwingen door middel van de vezels om de module te wassen. Wassen ~ 2 uur.
4. Zaaien
OPMERKING: De media en supplementen gebruikt in dit protocol moeten worden die zijn vastgesteld voor het gewenste type cel. Raadpleeg de literatuur, de Europese Collection of Cell Cultures (ECACC) en de American Type Culture Collection (ATCC) voor meer informatie. Voorafgaand aan deze methode cellen moeten maintained volgens vastgestelde protocollen voor het gewenste celtype. Voor dit werk werden de hepatocarcinoma cellijn HepG2 / C3A subkloon onderhouden volgens de aanbevelingen van de distributeurs (ATCC).
LET OP: Het zaaien protocol hieronder presenteerde ook dient om voorafgaand pre-cultuur van de module met celkweekmedium celgroei. Indien een uitgebreidere voorkweek dan vereist dit dient vóór het zaaien module door afvoeren van het wassen inhoud van het systeem vervangen door kweekmedium en doordringt deze via de module voor enkele uren plaatsvinden. Zie paragraaf 7.5.2.1 voor meer informatie over het vervangen van de media in het systeem.
- Bereid een enkele celsuspensie door behandeling met trypsine volgens vastgestelde protocollen voor het gewenste celtype. Een algemeen protocol voor een T75 cultuur is als volgt:
Opmerking: Het aantal cellen voor gebruik in de seeding stap moet empirisch bepaald voor het gewenste celtype. De hier beschreven bioreactoren worden geënt op een 35-voudig hogere CELls dichtheid (cellen / cm2) dan die in 2D weefselkweek plastic voor een 7 daagse cultuur.- Was de cellen door toevoeging van 10 ml fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), aspireren, voeg 3 ml 0,05% trypsine ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) (voldoende om de cellen te dekken) en incubeer bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 5 minuten.
- Oogst cellen in 7 ml kweekmedium aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) aan de trypsine te neutraliseren. Meng goed, voeg 10 ul van de kamer van een hemocytometer en tel de cellen.
- Centrifugeer bij 200 xg gedurende 5 minuten om de cellen te pelleteren.
- Zuig het supernatant en resuspendeer cellen bij 4x10 6 / ml in kweekmedium aangevuld zoals vereist voor het gewenste celtype.
- Zet de pomp uit en laat de vulopening en de module als in 3.4.1.
- Maak de module uit de module connectors en bevestig module eindkappen (tabel 1) pre-gesteriliseerd in 70% ethanol, het verlaten van een zijpoort gratis. </ Li>
- Transfer ~ 500 ul van de celsuspensie (2x10 6 cellen) (4.1.4) aan de module met een 18 G naald en 1 ml spuit en zorg ervoor belvorming te voorkomen en niet om de vezels beschadigen.
- Cap de zijkant poort met behulp van een eindkap. Incubeer de cellen bij 37 ° C, 5% CO2 gedurende 2-4 uur met handmatig draaien van de module bij 180 ° per 5 minuten. Als alternatief kunnen de modules met een intermitterende mengen instelling (tabel 1) worden bevestigd aan een buis rotator.
- Na zaaien Gelieve een eindkap op een injectiepoort (tabel 1) vooraf gesteriliseerd in 70% ethanol en bevestig deze aan de PTFE-vastgebonden zijpoort. Verwijder de andere zijpoort eindkap en langzaam leeglopen van de cellen door het injecteren van lucht in de bijgevoegde injectiepoort met behulp van een 27 G naald en 1 ml spuit.
- Vervang de injectiepoort met een eindkap. Langzaam vult de module met media met behulp van de gratis kant-poort en een G naald 18 met een 1 ml spuit. remove de module eindkappen en bevestig de module om de slang met behulp van de module connectors.
- Vervang het wassen media fles met een inhoud van 50 ml groei media en aanvullingen volgens de procedure beschreven in 7.5.2.1. Pomp het groeimedium door het systeem 800 ul / uur.
5. proliferatie
LET OP: De vezels gebruikt in het onderzoek systeem hier beschreven zijn ingesteld om doordringen bij ~ 80 ul / uur, met een 800 ul / uur voeding.
- Gebruik de vezels om de cellen gedurende perioden van maximaal 7 dagen groeien in een bevochtigde incubator ingesteld op 37 ° C, 5% CO2.
OPMERKING: Controle van voedingsstoffen en metabolieten in de groeifase nuttige informatie over de verspreiding, metabolische opname en uitgang van de cellen en voedingsstoffen en metabolieten niveaus in de media leveren. Bijvoorbeeld glucose gebruik en lactaatproductie. Kits zijn verkrijgbaar bij verschillende leveranciers die deze factoren kunnen kwantificeren van media (zie
6. Excision
OPMERKING: Vezels kunnen worden uitgesneden uit de module aan het einde van een experiment voor analyse.
- Koppel en laat de HFB.
- Plaats een scalpel / micro mes (tabel 1) mes tussen het glas en siliconen. Draai de module om zo verder, van silicone uit het glas. Herhaal deze procedure aan beide uiteinden van de module.
- Met behulp van het mes haak uit de siliconen stekker van het ene uiteinde en trek. Zorg ervoor dat de vezels met zich meebrengt. 7. Cel Analyse
- celaantallen
OPMERKING: Bij de C3A cellen die in deze studie elk tijdstip binnen de 7 dagen groeiperiode zijn geschikt voor gebruik in deze berekening groei niet wezenlijk veranderen via celdichtheden die op dit tijdsbestek.- Na excisie (hoofdstuk 6) dompel de vezels in PBS te wassen en snijd ze in een 1,5 ml buis met 0,5 ml Tris EDTA (TE) buffer. Onderwerpen deze twee vries-dooi cycli bij -80 ° C vriezer. Meet de DNA-inhoud met PicoGreen en celaantallen bepaald door deze waarde te vergelijken met een standaardcurve die met het gewenste celtype 26.
- Celproliferatie tarieven
- Met het aantal cellen berekend op twee verschillende tijdstippen berekenen de specifieke groeisnelheid μ (vergelijking 1) waarin Ln (X1) is de natuurlijke logaritme van het aantal cellen op het eerste tijdstip en Ln (X2) is de natuurlijke logaritme van de cel nummer op de tweede keer punt.
μ = (Ln (X2) -Ln (X1)) / tijd (uur) (1)
Hieruit berekent de populatie verdubbelingstijd (dT) (Vergelijking 2) waarin μ de specifieke groeisnelheid.
dT = Ln2 / μ (2)
- Met het aantal cellen berekend op twee verschillende tijdstippen berekenen de specifieke groeisnelheid μ (vergelijking 1) waarin Ln (X1) is de natuurlijke logaritme van het aantal cellen op het eerste tijdstip en Ln (X2) is de natuurlijke logaritme van de cel nummer op de tweede keer punt.
- cellevensvatbaarheid
- Na excisie (Sectie 6) Dompel de vezels in PBS te wassen en snijden ze in een 1,5 ml buis die 500 pi 0,05% trypsine ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA). Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten.
- Meng en voeg 10 ul van celsuspensie tot 10 pi trypan blauw. Load 10 ul op een hemocytometer en tel het aantal doden (blauw) en levend cellen.
- Imaging
- Na excisie dompel de vezels in PBS te wassen en met een schaar om ze in kleinere stukken in een 24-wells plaat. Voeg 400 ul 4% paraformaldehyde (in PBS) en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 20 min.
- Wassen met PBS door pipetteren 400 ul aan en uit. Herhaal this stap met verse PBS.
- Voeg 400 ul 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) verdund in PBS tot ca. 100 ng / ml en incuberen bij kamertemperatuur gedurende 20 min. Beschermen tegen licht.
- Was met PBS tweemaal (zoals 7.3.2) en eenmaal met H2O Voeg een fluorescentie montage medium om het beeld van de vezel en bedek onmiddellijk gegevens voordat de monsters droog te verzamelen (DAPI ex / em; 359/461 nm).
- Neem beelden op verschillende focale vliegtuigen en het gebruik van 'focussen stapelen' software (bijv stack focuser plugin voor ImageJ, hieronder) om een samengestelde afbeelding toont een sterk uitgebreid diepte van het veld te maken. Dit is nodig omdat de vezels niet plat.
- Download ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij/) en de 'stack-focuser' plugin (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html).
- In ImageJ Open de afbeeldingen te stapelen. Vervolgens in het menu 'Image' ga naar 'Stacks' - 'Images te stapelen'. In het menu 'Plugins' ga naar 'Stack focusser'. Geef een n voor NxN kernel. Trial and error met 'n' kunnen met het oog op een afbeelding met weinig 'ruis' te genereren nodig zijn. Waarden tussen 11 en 77 hebben de neiging om goed te werken.
- albumine-uitscheiding
LET OP: Dit is een hepatocyt celfunctie-test en niet een algemene test van de celfunctie.- Zaad cellen (HepG2 / C3A) op 2D weefselkweek plastic op 10.667 / cm2 en gedurende 6 dagen. Zaad HFBs zoals beschreven in paragraaf 4 en te groeien voor 6 dagen.
- Naar aanleiding van deze proliferatie periode verandert het kweekmedium (EMEM + 10% FBS, 1x glutamine & 1x penicilline / streptomycine) voor de weefselkweek plastic en HFB om een serum vrije Williams E medium aangevuld met 1x glutamine en 1x penicilline / streptomycine gedurende 24 uur:
- Giet de slangen en HFB module volgens de in 3.4.1 zetten stappen. Draai het reservoir fles en vervang dit met een fles met daarin de Williams E media. Pomp deze door de HFB 800 ul / uur.
- Na 24 uur, neem media monsters. Kwantificeren uitgescheiden albumine door ELISA volgens de instructies van de fabrikant (Tabel 1). Verdun mediamonsters 1 op 10 tot 1 op 40 voor gebruik om albumine concentraties in het bereik van de standaardkromme te brengen.
Representative Results
Zaaien van cellen is een kritische stap. Het vermogen van cellen te hechten aan de vezel in een 3D opstelling is aanzienlijk minder dan die waargenomen voor 2D weefselkweek kunststof. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de verminderde contacttijd tussen cel en substraat. In het HFB vallen de cellen door de module tijdens de statische fase van zaaien. Dit zijn aanmerkelijk kortere tijd vergeleken met een continue vaste fase toegepast in 2D. Cellen voor de verbinding met het substraat in deze tijd. Bovendien, vanwege de gebogen aard van de vezels geen vlak oppervlak voor de cellen om te rusten en verbanden alsof er in 2D cultuur. Hoewel dit kan worden verergerd door de chemie van de vezel gebruikten we weten dat dit niet het geval voor het polymeer gebruikt in deze studie (gegevens niet getoond). Uitgebreid zaaien tijd en cellen entdichtheid leidt tot de vorming van cel aggregaten die tijdens de statische fase sneller r door de module vallenaten dan enkele cellen en verder vermindert de contacttijd tussen de cellen en de ondergrond. Verhogen van de tijd leidt ook tot vergeling van de media als er een hoge dichtheid van cellen en geen media uitwisseling tijdens deze stap. Met behulp van de in paragraaf 4 cell seeding tarieven van ~ 15% beschreven voorwaarden wordt consequent bereikt met de HepG2 / C3A-cellen (Figuur 5A). Hoewel dit kan worden beschouwd als een kleine fractie er genoeg cellen om goed bevolkte vezels binnen enkele dagen (Figuren 5B en 6) te genereren; na een zevendaagse periode proliferatie celdichtheid bereikt in de HFB nadert 3x10 5 / cm2. Dit is een geschikte dichtheid voor veel assays gebruik hepatocyten en kan worden beschouwd als het bereiken van confluentie.
De proliferatie tarieven bereikt in de HFB trager in vergelijking met die in 2D celkweek (figuur 5C). Dit is unwaarschijnlijk te wijten aan het verlies van cellen in de dynamische stroom van het systeem celtellingen in de media lage (gemiddeld ± SEM: 20.343 cellen ± 3674 cellen per 24 uur bij confluentie, die 4% van de totale cellen) en deze niet toeneemt wanneer de permeatiesnelheid wordt gedraaid tot 400 ul / uur (gegevens niet getoond). Het is ook waarschijnlijk te wijten aan een afname van de levensvatbaarheid en daaropvolgende verlies van cellen (zie Figuur 5D en lager). Het kan worden verklaard, althans gedeeltelijk doordat deze cellijn klonaal is afgeleid van HepG2 en geselecteerd op het vermogen om contact remming van celproliferatie vertonen. De cellen in de HFB worden gezaaid met 6x de dichtheid van de 2D-cellen die kunnen leiden tot lagere proliferatiesnelheden.
Levensvatbaarheid blijft hoog gedurende de HFB met cellen vertonen> 90%. Terwijl er een lichte afname in levensvatbaarheid aan het uitlaateinde opzichte van de inlaat was dit niet bleek significant (t-test p = 0,22).
Monitoring van glucose consumptie en productie van melkzuur is gebruikt voor het afstemmen van de media voeding en media-volume in het systeem. Met behulp van 800 pl / uur en een totale media volume van 50 ml glucose en melkzuur niveaus boven hieronder (respectievelijk) worden onderhouden en die bij standaard weefselkweek plastic cultuur.
Albumine-uitscheiding is een belangrijke leverfunctie door hepatocyten uitgevoerd. Het wordt uitgescheiden in het serum wanneer verschillende rollen bij transport en homeostase speelt. De albumine afscheiding door cellen gekweekt in het HFB is 15 maal hoger dan in cellen gekweekt op 2D (Figuur 7). Dit toont de functionele cellen in de HFB althans bij albumine secretie, wordt deze functie verhoogd in het HFB.
jpg "/>
Figuur 1. De in vivo-achtige omgeving van een HFB. Cellen worden gezaaid op de buitenzijde van de poreuze vezels. Media wordt geleverd door de vezel lumen, het nabootsen van een capillair bloed. (A) Longitudinale sectie van een vezel (niet op schaal). (B) Dwarsdoorsnede van een 3 vezels reactor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. De HFB module. (A) De afmetingen van de module die in deze studie. De afmetingen werden gekozen om 3 vezels te passen en te voldoen aan de behoeften van de huidige onderzoeksproject. Verschillende maten kunnen worden vervaardigd en op maat gemaakt voor individuele systemen en vezels. (B) Een foto van de module met aangehechte eindkap en module connectors. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Module vervaardiging. (A) vezels worden op maat gesneden en in de module geplaatst. (B) vezels worden gelijmd in de module drogen. (C) De uiteinden zijn gelijk met het glas te snijden. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. HFB systeem set-up. Pijlen geven de richting van de media flow. Rood = vulopening. Geel = pomp tuworden. Wit = HFB-module. Groen = retentaat buis met klem. Blauw = doordringen buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. Seeding, proliferatie, levensvatbaarheid en biochemische analyse. (A) Percentage van cellen gezaaid. Zwarte diamanten vertegenwoordigen individuele HFBs. De rode balk is het gemiddelde. (B) Cellen Concentratie bij het zaaien en na een 7 dagen proliferatie periode. 2D celaantallen werden bepaald door behandeling met trypsine en tellen met een hemocytometer. HFB celaantallen werden bepaald met de PicoGreen-test en een standaard curve bereid uit C3A cellen 26. n = 5-6. Staven = SEM. (C) populatie verdubbelingstijd. n = 5-7. Staven = SEM. (D) Levensvatbaarheid bepaald door trypEen blauw uitsluiting op na een 7 dagen proliferatie. Inlet, centrale en uitlaat vertegenwoordigen de regio's binnen de HFB. n = 3-5. Staven = SEM. (E & F) Glucose consumptie en productie van melkzuur. Niveaus werden gevolgd bij het reservoir fles (inlaat) en het retentaat en permeaat outlets en compered routine cultuur op weefselkweekkunststof (media veranderd op dag 3 en 5). n = 3-5. Bars = SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Beelden van cellen gekweekt op weefsels in een HFB. Cellen werden gezaaid en gedurende 48 uur voor vezels werden uitgesneden, in PBS gewassen, in 4% paraformaldehyde in PBS en kernen gekleurd met DAPI gewassen. Elk beeld is een samenstelling van 12 'Focus gestapeld' images om de scherptediepte van het resulterende beeld te verhogen. Gebieden van hogere en lagere celdichtheid staan langs de vezel op dit tijdstip en getoond. Wanneer aanwezig vezels grenzen worden aangegeven met een rode stippellijn. Beelden werden genomen op een omgekeerde fluorescentie microscoop. Afbeelding = 10X objectief. Bar = 200 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Albumine-uitscheiding. Cellen werden gezaaid in weefselkweekplaten kunststof op 10.667 / cm2 en in het HFB zoals beschreven in hoofdstuk 4. De cellen werden verspreid gedurende 6 dagen. Na deze periode werd de proliferatie weefselkweek plastic en HFB cultuur media veranderd voor een serum gratis Williams E medium aangevuld met glutamine en penicilline / streptomycin voor 24 uur. Media werden monsters genomen en een albumine gekwantificeerd door ELISA volgens de instructies van de fabrikant (Tabel 1). n = 5-6. Bars = SEM. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| sectie | Naam van de apparatuur | Bedrijf | Kat. Nee. | Notes | Afbeeldingen |
| 2 | Glass HFB Module | Soham Scientific | --- | Aangepaste item. | |
| 2.1 | Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | ||
| 2.3 | Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicéén Glue. | |
| 2.5 | PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | ||
| 3.2.1 | reservoir fles | Visser | 11972619 | ||
| Q-serie cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE de schroefdraad van de adapters en montage moer. Hechten aan de Q-serie cap. Bevestig een paragraaf 8.5 cm van de meegeleverde PTFE-buis onder de 1 mm adapter en een 4 cm doorsnede onder de 3 mm adapter. |  | |
| Adapter, Man, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, Man, 3,0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | |||
| fitting Nut | Kinesis | U-350 | |||
| neopreen slang | Visser | 10366344 | Bevestig het HEPA-filter tot 6 cm van neopreen slang en bevestig dit aan de 'fitting nut'. Bevestig een 2 x 30 mm secties L / S14 slang aan de bovenste twee weerhaken van de Y-connector en een 3 cm doorsnede L / S16 buis naar beneden. Bevestig deze aan de weerhaak van de 3 mm ID adapter. (Paragraaf 3.2.1) |  | |
| HEPA-vent | Visser | 11374634 | |||
| Y-connector, met weerhaken | Cole Parmer | OU-06295-10 | |||
| L / S16 Silicone slang | Cole Parmer | OU-96410-16 | |||
| L / S14 Silicone slang | Cole Parmer | WZ-96410-14 | |||
| L / S13 Silicone slang | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm aan de 1,0 mm prikkeldraad adapter aan te sluiten op de Q-serie cap aan de pomp tub ing = Feed buis. | ||
| WM 205U / CA pomp | Visser | 1248-6300 | |||
| WM pomp buizen, PVC, blauw-oranje, 0,25 mm boring | Visser | 12416310 | PTFE de schroefdraad van de mannelijke adapter en sluit de vrouwelijke adapter. Brei de pomp slang over een van de weerhaken. Herhaal deze opstelling aan het andere uiteinde van de slang. (Paragraaf 3.2.1) |  | |
| Adapter, Man, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | |||
| Adapter, Female, 1,0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | |||
| 3.2.2 | Vrouwelijke Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Zijpoort eindkappen. | blefig4.jpg "/>  |
| L / S13 Silicone slang | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm sectie om de pompslang verbinden met een connector. | ||
| L / S16 Silicone slang | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm L / S16 gemonteerd op 3x verloopstukken = module connectors. (Paragraaf 3.2.2) | ||
| Barbed verloopstuk 1/8 "x 1/16" | Cole Parmer | 30.616-43 | |||
| 3.2.4 | L / S13 Silicone slang | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm doorsnede aan het retentaat verbinden met de L / S14 de Y-connector op de Q-serie cap. |  |
| L / S13 Silicone slang | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm sectie om het permeaat te sluiten op de L / S14 de Y-connector op de Q-serie cap. | ||
| Straight prikkeldraad union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Hechten aan het einde van de L / S13 die verbinden met de L / S14 de Y-connector. | ||
| 3.4.2 | Klem | VWR | 229-0609 | ||
| 4.3 | 4 mm Siliconen slang | Visser | FB68858 | Vouw over een 40 mm deel van de buis en zet vast met een kabelbinder = Module eindkap. (Paragraaf 4.3) |  |
| Kabelbinder | Visser | 12326377 | |||
| 4.4 | MACSmix buis rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | Een aanpassing kan worden verlangd dat Attach de modules. | |
| 4.5 | Leur Injection-poort | Thistle Scientific | IB-10820 | Bevestig de eindkap aan de injectiepoort. (Paragraaf 4.5) | |
| Vrouwelijke Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | |||
| 5 | L-melkzuur kit | Megazyme | K-LATE | ||
| 5 | D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | ||
| 6.2 | Scalpel / micro mes | Interfocus | 10.315-12 | ||
| 7.4.3 | albumine ELISA | Bethyl Labs | E80-129 |
Tabel 1. Onderdelen van de HFB set-up.
Discussion
Dit manuscript beschrijft de opzet en exploitatie van een holle vezel bioreactor (HFB) voor zoogdiercellen cultuur en het nut ervan is aangetoond in prolifererende de hepatocyte cellijn HepG2 / C3A. Het systeem is ontworpen om te passen op de plank van een standaard incubator en de set-up is eenvoudig genoeg door een bevoegde celbioloog vertrouwd met aseptische techniek te worden uitgevoerd.
De vezels die in het onderzoekssysteem beschreven worden geproduceerd in huis door faseomkering rotatie gieten (spinnen) met een niet-bioafbreekbaar polymeer eigendom. Het is mogelijk om vezels te maken door het draaien van een verscheidenheid van materialen die geschikt zijn voor celkweek, zowel biologisch afbreekbare als niet-biologisch afbreekbaar, bijvoorbeeld; polycaprolacton (PCL) 27, poly-L-lactide zuur (PLLA) 28, poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) 29, polysulfon (PSU) 12 en polyetheretherketon (PEEK) 13. Elk heeft verschillende eigenschappen van eennd worden gekozen op basis van de behoeften van het systeem. De overeenstemming van de gebruikte vezel met het ethanol in de sterilisatiestap. PLGA is bekend dat het plastificeren met ethanol noodzakelijk een alternatieve behandeling, zoals antibiotica / antimycotische oplossing 25.
De afmetingen van de glasmodule hier gebruikt werden gekozen op basis van de behoeften van het huidige onderzoek. De verschillende grootte kan worden gemaakt door een gerenommeerde glasblazen bedrijf. Een overweging bij moduulmaat het aantal cellen, dat gekoppeld is aan het aantal vezels in de module en mogelijke stroomsnelheden. Hoe meer cellen zijn in de module hoe hoger de stroomsnelheden moeten zijn om gunstige kweekomstandigheden handhaven op het uitstroomeinde van de bioreactor. Dit zal een limiet bepaald punt en wat trial and error vereist kan zijn met toezicht op media-omstandigheden in de module permeaat te bereiken. Wiskundige modellering kan enig inzicht in de benodigde module Dimen biedengen en debieten 22.
De afmetingen van de inrichting die hier gebruikt is bedoeld om te passen op een incubator plank. De lengte van de buis wordt bepaald door de lengte die nodig is om te bereiken tussen de aansluitingen, terwijl ook de mogelijkheid voor genoeg beweging van componenten mogelijk te maken voor de set-up en bediening. Als tijdsverloop bemonstering nodig is, bijvoorbeeld bij de bewaking van mediaomstandigheden in de module doordringen dan injectiepoorten kan worden toegevoegd aan het retentaat en permeaat lijnen om dit te vergemakkelijken.
Een voorwaarde voor een celcultuur is om cellen in leven en in de meeste gevallen blijven groeien. In het licht van onderzoeken die een in vivo-achtige fenotype in gekweekte cellen in 3D kweeksystemen lijkt het ook belangrijk om een omgeving die nauw bootst de in vivo omgeving waarmee de cellen. Dit laatste punt wordt vaak verwaarloosd in 2D celkweek in het voordeel van het gemak deze cultuur systeem biedt. THij HFB bootst in vivo capillaire netwerken door het leveren van voedingsstoffen naar de cellen door het lumen van de vezels. De afvalstoffen van het uit het systeem door de dynamische stroom. Hierdoor ontstaat een in vivo-achtige voor celcultuur en die nabootst de in vivo omgeving gezien door hepatocyten, waardoor dit systeem een betere keuze dan 2D weefselkweek kunststof voor het kweken van deze cellen. Dit wordt bevestigd door het feit dat de cellen scheiden 15 maal de hoeveelheid albumine, een belangrijke leverfunctie, in het HFB kweeksysteem vergeleken met die geteeld op 2D weefselkweek plastic.
Terwijl het HFB systeem is geschikt voor de meeste, zo niet alle verankering afhankelijke celtypen voorbeeld hier voor hepatocyten omdat er een reële behoefte kunnen cultuur functioneler, in vivo-achtige hepatocyten voor gebruik bij de ontwikkeling van geneesmiddelen door de farmaceutische industrie en in bioartificial lever apparaten voor extracorporale ondersteuningvan leverfalen patiënten. De behoefte aan meer functionele cellen verder reikt dan deze voorbeelden, met name op het gebied van regeneratieve geneeskunde gaat een fase van translationeel werk. De voordelen van een in-vivo-achtige cultuur milieu mag niet worden verwaarloosd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Glass HFB Module | Soham Scientific | --- | Custom Item. (Section 2) |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
| Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
| PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
| Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 3.0 mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1) |
| Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6 cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80 cm to connect the 1.0 mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
| WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
| WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25 mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Male, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thread of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Adapter, Female, 1.0 mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40 mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
| L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55 cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45 cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
| Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
| Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
| 4 mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
| MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
| Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| Female Luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
| L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
| D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
| Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
| Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |
References
- Lewis, W. H. Experimental evidence in support of the theory of outgrowth of the axis cylinder. American J Anat. 6 (1), 461-471 (1906).
- Harrison, R. G. The development of peripheral nerve fibers in altered surroundings. Wilhelm Roux Arch Entwickl Mech Org. 30 (2), 15-33 (1910).
- Ding, L., et al. A genome-scale RNAi screen for Oct4 modulators defines a role of the Paf1 complex for Embryonic Stem Cell identity. Cell Stem Cell. 4 (5), 403-415 (2009).
- Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering -In vivo and in vitro applications. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4), 352-366 (2011).
- Sinden, J. D., Vishnubhatla, I., Muir, K. W. Prospects for stem cell-derived therapy in stroke. Prog Brain Res. 201, 119-167 (2012).
- Ouyang, A., Yang, S. -T. A two-stage perfusion fibrous bed bioreactor system for mass production of embryonic stem cells. Expert Opin Biol Ther. 8 (7), 895-909 (2008).
- Carnachan, R. J., Bokhari, M., Przyborski, S. A., Cameron, N. R. Taloring the morphology of emulsion-templated porous polymers. Soft Matter. 2 (7), 608-616 (2006).
- Deshpande, P., et al. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants. Biomaterials. 34 (21), 5088-5106 (2013).
- Storm, M. P., Orchard, C. B., Bone, H. K., Chaudhuri, J. B., Welham, M. J. Three-dimensional culture systems for the expansion of pluripotent embryonic stem cells. Biotechnol Bioeng. 107 (4), 683-695 (2010).
- Wung, N., Acott, S. M., Tosh, D., Ellis, M. J. Hollow fibre membrane bioreactors for tissue engineering applications. Biotechnol Lett. 36 (12), 2357-2366 (2014).
- Ellis, M., Jarman-Smith, M., Chaudhuri, J. B. Bioreactor systems for tissue engineering: A four-dimensional challenge. Bioreactors for tissue engineering; principles, design and operation. Chaudhuri, J., Al-Rubeai, , Springer. Chapter 1 1-18 (2005).
- Silva, A. I., Mateus, M. Development of a polysulfone hollow fibre vascular bio-artificial pancreas device for in vitro studies. J Biotechnol. 139 (3), 236-249 (2009).
- De Bartolo, L., et al. Human hepatocyte functions in a crossed hollow fiber membrane bioreactor. Biomaterials. 30 (13), 2531-2543 (2009).
- Schmelzer, E., Finoli, A., Nettleship, I., Gerlach, J. C. Long-term three-dimensional perfusion culture of human adult bone marrow mononuclear cells in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 112 (4), 801-810 (2015).
- Tapia, F., et al. Production of high-titer human influenza A virus with adherent and suspension MDKC cells cultured in a single-use hollow fiber bioreactor. Vaccine. 32 (8), 1003-1011 (2014).
- Deng, X., Zhang, G., Shen, C., Yin, J., Meng, Q. Hollow fiber culture accelerates differentiation of Caco-2 cells. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (15), 6943-6955 (2013).
- Schutte, M., et al. Rat primary hepatocytes show enhanced performance and sensitivity to acetaminophen during three-dimensional culture on a polystyrene scaffold designed for routine use. Assay Drug Dev Technol. 9 (5), 475-486 (2011).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Novel cell culture device enabling three-dimensional cell growth and improved cell function. Biochem Biophys Res Commun. 354 (4), 1095-1100 (2007).
- Bokhari, M., Carnachan, R. J., Cameron, N. R., Przyborski, S. A. Culture of HepG2 liver cells on three dimensional polystyrene scaffolds enhances cell structure and function during toxicological challenge. J Anat. 211 (4), 567-576 (2007).
- Vivares, A., et al. Morphological behaviour and metabolic capacity of cryopreserved human primary hepatocytes cultivated in a perfused multiwell device. Xenobiotica. 45 (1), 29-44 (2015).
- Smith, I., et al. Human neural stem cell-derived cultures in three-dimensional substrates form spontaneously functional neuronal networks. J Tissue Eng Regen Med. , Epub ahead of print (2015).
- Davidson, A. J., Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. A theoretical approach to Zonation in a bioartificial liver. Biotechnol Bioeng. 109 (1), 234-243 (2012).
- Mulder, M. The basic principles of membrane technology. 2nd ed. , Kluwer Academic Publishers. Chapter 3 section 4 (1996).
- Ellis, M. J., Chaudhuri, J. B. Poly(lactic-co-glycolic acid) hollow fibre membranes for use as a tissue engineering scaffold. Biotechnol Bioeng. 96 (1), 177-187 (2007).
- Shearer, H., Ellis, M. J., Perera, S. P., Chaudhuri, J. B. Effects of common sterilization methods on the structure and properties of poly(D,L lactic-co-glycolic acid) scaffolds. Tissue Eng. 12 (10), 2717-2727 (2006).
- Forsey, R. W., Chaudhuri, J. B. Validity of DNA analysis to determine cell numbers in tissue engineering scaffolds. Biotechnol Lett. 31 (6), 819-823 (2009).
- Williamson, M. R., Coombes, A. G. A. Gravity spinning of polycaprolactone fibres for applications in tissue engineering. Biomaterials. 25 (3), 459-465 (2004).
- El-Salmawy, A., et al. Preparation and properties of pronectin F-coated biodegradable hollow fibres. J Artif Organs. 8 (4), 245-251 (2005).
- Meneghello, G., et al. Fabrication and characterization of poly(lactic-co-glycolic acid)/polyvinyl alcohol blended hollow fibre membranes for tissue engineering applications. J Memb Sci. 344 (1-2), 55-61 (2009).
