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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

के लिए खोखले फाइबर Bioreactors Published: May 26, 2016 doi: 10.3791/53431
Automatic Translation
1, 2, 3, 2, 1, 2, 4, 1
1Department of Chemical Engineering and Centre for Regenerative Medicine, University of Bath, 2MRC Centre for Drug Safety Science and Institute of Translational Medicine, University of Liverpool, 3Mechanical Engineering, University College London, 4Department of Applied Mathematics, Liverpool John Moores University

Summary

संस्कृति में कोशिकाओं के कार्य व्यवहार 3 आयामी संस्कृति वातावरण 16-21 की तरह विवो में और अधिक में संवर्धन द्वारा सुधार किया जा सकता है। इस पांडुलिपि में विवो तरह स्तनधारी टिशू कल्चर के लिए सेट अप और एक खोखला फाइबर बायोरिएक्टर प्रणाली के संचालन का वर्णन है।

Introduction

टिशू कल्चर के विकास और / या कोशिकाओं है कि 100 से अधिक वर्षों 1,2 के लिए उपयोग किया गया है के रखरखाव के लिए एक स्थापित तकनीक है। का अध्ययन कोशिकाओं और प्रतिक्रियाओं पूर्व vivo की सुविधा तक, प्रयोगों कि अन्यथा यदि बेहद चुनौतीपूर्ण असंभव नहीं होगा की अनुमति के फायदों तक पहुंच गया है, उदाहरण के लिए आनुवंशिक रूप से इंजीनियर सेल लाइनों की पीढ़ी और उच्च throughput स्क्रीनिंग assays 3 में रिपोर्टर कोशिकाओं का उपयोग करें। अभी हाल ही में टिशू कल्चर में इन विट्रो मॉडल की पीढ़ी के लिए और पुनर्योजी चिकित्सा के लिए ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र को जन्म दिया है। इन आवेदनों के साथ, गतिशील 3-आयामी (3 डी) संस्कृति प्रणालियों में रुचि काफी वृद्धि हुई है।

3 डी संस्कृति तरीकों (एक 3 डी संस्कृति सब्सट्रेट और / या दिशात्मक गतिशील प्रवाह की शुरूआत के रूप में यहाँ परिभाषित) बेहतर विवो सेलुलर पर्यावरण की वास्तुकला, एक को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण पुनरावृत्तिअधिक शारीरिक-तरह कार्य करते हैं। रोगग्रस्त और क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत करने के उद्देश्य से निकालने, बड़े होते हैं, अंतर और प्रत्यारोपण की कोशिकाओं की क्षमता के अध्ययन के एक क्षेत्र रोगी लाभ और व्यावसायिक अवसर के लिए एक विशाल क्षमता है। उदाहरण के लिए जलता इलाज के लिए ऑटोलॉगस keratinocytes (देखें 4) और स्ट्रोक के उपचार के लिए सेल आधारित चिकित्सा के उपयोग के उपयोग (देखें 5)। इसी तरह, इन विट्रो मॉडल के लिए बाजार स्तरीकृत दवा आवेदन करने के लिए दवाओं की खोज तक फैला है। टिशू कल्चर में सम्मेलन एक टिशू कल्चर कुप्पी की 2-आयामी (2 डी) सतह पर पक्षपाती या लंगर निर्भर प्रकार की कोशिकाओं की वृद्धि है। नदीम वर्तमान में एक अनुसंधान की स्थापना में सोने के मानक के रूप में स्वीकार कर लिया है, ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में हाल ही में ब्याज तथ्य यह है कि वर्तमान 2D टिशू कल्चर पर्यावरण सेल उत्पादन 6 में आवश्यक पैमाने अप के लिए अपर्याप्त है पर प्रकाश डाला गया है।

पक्षपाती सेल प्रकार एक scaffol के लिएडी की आवश्यकता है, अंत का उपयोग करने के आधार पर अलग अलग होंगे, जो दोनों रासायनिक संरचना और यांत्रिक गुणों के संदर्भ में। कुछ सिस्टम मचानों को रोजगार के रूप में अच्छी तरह से प्लेट अत्यधिक झरझरा मैट्रिक्स उच्च आंतरिक चरण पायस templating से गठन से मिलकर सम्मिलित करता है (7 देखें) या Electrospun फाइबर (8 देखें) पारंपरिक 2D संस्कृति तकनीक से न्यूनतम अनुकूलन की जरूरत पड़ेगी। प्रकोष्ठों बदलती रचनाओं के microcarriers पर वरीयता प्राप्त किया जा सकता है और हड़कंप मच टैंक है कि पोषक तत्वों और संकेतन अणुओं देने में हो, और एक गतिशील अच्छी तरह से मिश्रित वातावरण के माध्यम से 9 अपशिष्ट उत्पादों (जन परिवहन) दूर ले। हालांकि, इन प्रणालियों उनके vivo तरह के माहौल में सीमित कर रहे हैं और आगे सुधार पैमाने अप करने के लिए लागत संबंध के साथ बनाया जा सकता है। खोखले फाइबर बायोरिएक्टर (HFBs) एक 3 डी संस्कृति प्रणाली है कि आम तौर पर झरझरा फाइबर और मीडिया फाइबर लुमेन के माध्यम से दिया के बाहर पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के साथ एक मॉड्यूल में तय तंतुओं से मिलकर कर रहे हैं (1 में समीक्षा की0) (चित्रा 1)। HFBs फाइबर रक्त केशिकाओं नकल उतार और गतिशील मीडिया वितरण के साथ जुड़े कतरनी तनाव से कोशिकाओं परिरक्षण, जबकि इजाजत दी परिभाषित कतरनी अगर वांछित पक्ष बंदरगाहों के माध्यम से द्रव का प्रवाह के माध्यम से कोशिकाओं को लागू किया जा करने के लिए एक साथ इन विवो तरह के माहौल प्रदान करते हैं। यह बेहतर जन परिवहन, जिसमें उच्च सेल घनत्व 11 पहुँचा जा सकता है के साथ एक बहुमुखी संस्कृति प्रणाली बनाता है। HFB प्रणाली अच्छी तरह से लंगर निर्भर प्रकार की कोशिकाओं के रखरखाव के लिए अनुकूल है और संस्कृति के लिए आइलेट्स 12, माउस β-टीसी -3 insulinoma सेल लाइन 12, प्राथमिक मानव hepatocytes 13, मानव हड्डी के चूहे अग्नाशय टापू सहित कोशिकाओं की एक किस्म का इस्तेमाल किया गया है मज्जा कोशिकाओं mononuclear 14, Madin डार्बी कुत्ते गुर्दे की कोशिकाओं (MDCK) 15 और Caco-2 कोशिकाओं 16 एक ही नाम है।

बड़े पैमाने पर स्थानांतरण और बड़े पैमाने अप करने की प्रणाली के फायदे के अलावा, कोशिकाओं 3 डी आज़ादी में उगाईमुकदमा संस्कृति प्रणालियों और अधिक विवो की तरह आकृति विज्ञान में और अधिक प्रयोगात्मक संकेतों के लिए उत्तरदायी होते हैं। उदाहरण के लिए चूहे प्राथमिक hepatocytes एक अधिक cuboidal आकृति विज्ञान, वृद्धि की व्यवहार्यता, साइटोक्रोम-P450 एंजाइम गतिविधि का अधिक से अधिक प्रेरण और वृद्धि की संवेदनशीलता पेरासिटामोल की विषाक्तता को दिखाने के लिए जब 2 डी संस्कृति 17 में विकसित कोशिकाओं की तुलना में एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polystyrene पाड़ में हो। एक ही पाड़ हिपेटोकार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 भी एल्बुमिन उत्पादन 18 बढ़ाने के लिए और 2 डी संवर्धित कोशिकाओं की तुलना में 19 methotrexate के जवाब की तरह विवो में एक और अधिक दिखाने के लिए दिखाया गया है का उपयोग करना। प्राथमिक मानव hepatocytes देरी dedifferentiation, उच्च साइटोक्रोम-P450 गतिविधि का प्रदर्शन किया और 4/5 यौगिकों एक छिड़काव संस्कृति प्रणाली 20 में परीक्षण के लिए मंजूरी की वृद्धि हुई। मानव तंत्रिका स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स और glia एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polystyrene पाड़ में संवर्धित दोनों उच्च (संभावित कार्रवाई) और कम freque का प्रदर्शनncy (स्थानीय क्षेत्र की क्षमता) कोई neuronal गतिविधि जबकि सहज गतिविधि 2 डी संवर्धित कोशिकाओं 21 में पाया गया था। Caco-2 कोशिकाओं 2 डी संस्कृति में वृद्धि हुई alkaline फॉस्फेट, γ-glutamyltransferase और पी ग्लाइकोप्रोटीन गतिविधि और एफ actin और Zona occludens -1 प्रोटीन 16 की उच्च अभिव्यक्ति द्वारा मापा की तुलना में एक HFB में बढ़ाया भेदभाव का प्रदर्शन किया। फायदे के बावजूद, एक 2 डी टिशू कल्चर कुप्पी सतह की तुलना में अन्य प्रणालियों में कोशिकाओं की दिनचर्या संवर्धन फिर भी, कई प्रयोगशालाओं में अभ्यास नहीं है, हालांकि 3 डी सेल संस्कृति का हवाला देते हुए प्रकाशनों की संख्या (पिछले 10 साल में 8 गुना वृद्धि बढ़ रही है। स्रोत : '3 डी संस्कृति') के साथ जांच उपकरण PubMed 'वर्ष से परिणाम के लिए'।

यह पांडुलिपि स्तनधारी सेल संस्कृति के लिए सेट अप और एक HFB प्रणाली के परिचालन की स्थिति का वर्णन करता है और हिपेटोकार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 / C3A संवर्धन में इसकी उपयोगिता को दर्शाता है। इस विधि का उद्देश्य संस्कृति में कोशिकाओं हैएक अधिक विवो तरह संस्कृति प्रणाली है कि काफी सादगी बरकरार रखती है यह जो 3 डी संस्कृति प्रणालियों के लिए नए हैं के लिए उत्तरदायी बनाने के लिए। आवेदन में HFBs का उपयोग कर पीछे तर्क यहाँ का वर्णन है, जो सुधार करने के लिए जिगर मॉडल के predictability कि यह HFB पर्यावरण के भीतर एक 22 यकृत sinusoid नकल करने के लिए सैद्धांतिक रूप से संभव है है। यह वर्तमान में अन्य संस्कृति सिस्टम के साथ संभव नहीं है।

Protocol

1. फाइबर

  1. कास्टिंग चरण उलटा स्पिन से फाइबर (कताई) निर्माण। इस विधि का विवरण 23,24 में पाया जा सकता है।
    नोट:, एन एम पी विलायक और एच 2 ओ गैर विलायक के रूप में के रूप में इस काम के लिए फाइबर एक गैर biodegradable मालिकाना बहुलक का उपयोग कर घर में निर्मित कर रहे हैं। अन्य उपयुक्त पॉलिमर के विवरण चर्चा में पाया जा सकता है। यहाँ वर्णित प्रणाली में इस्तेमाल किया फाइबर एक 600-700 माइक्रोन लुमेन व्यास के साथ 1.05mm बाहरी व्यास हैं। फाइबर ताकना व्यास 2.28 मीटर ± 1.5 माइक्रोन को मापने के साथ असुरक्षित हैं (मानक विचलन ± मतलब है)। इस फाइबर लुमेन में मीडिया फ़ीड से कोशिकाओं को अलग करने के लिए, जिगर sinusoid या अन्य ऊतकों के वाहिका नकल बनाया गया है। फाइबर भी इस तरह के पाल के रूप में झिल्ली आपूर्तिकर्ताओं से खरीदा जा सकता है।

2. मॉड्यूल निर्माण

नोट: इस अध्ययन में इस्तेमाल मॉड्यूल 2 पक्ष बंदरगाहों के साथ 1 मिमी मोटी borosilicate ग्लास से बना रहे हैं(2A चित्रा)। मॉड्यूल यहाँ वर्णित में फाइबर 4.95 सेमी 2 जो एक 6 अच्छी तरह से थाली की एक अच्छी तरह से लगभग आधे के बराबर है की एक बाहरी सतह क्षेत्र है।

  1. Sigmacote (तालिका 1) के साथ भीतरी सतह कोटिंग और एक धूआं हुड में सूखे की अनुमति देकर पहला प्रयोग से पहले Siliconize मॉड्यूल। आटोक्लेव (121 डिग्री सेल्सियस, 1 एटीएम, 20 मिनट) उपचार के जीवन में वृद्धि करने के लिए।
  2. एक छुरी 75 मिमी लंबी फाइबर का उपयोग कटौती और प्रत्येक के अंत (चित्रा 3 ए) पर छोड़ने ~ 7 मिमी अतिरिक्त लंबाई प्रत्येक मॉड्यूल में तीन फाइबर डालें।
  3. प्लेस ~ एक वजन नाव में सिलिकॉन गोंद (तालिका 1) के 0.5 मिलीलीटर। सिलिकॉन की एक छोटी राशि लेने के लिए और चारों ओर फाइबर एक 3-5 मिमी प्लग (चित्रा 3 बी) के रूप में मॉड्यूल के सिरों में गोंद काम करने के लिए एक P200 विंदुक टिप का उपयोग करें। > 3 घंटे के लिए शुष्क करने की अनुमति दें।
  4. एक छुरी का प्रयोग कांच मॉड्यूल समाप्त होता है (चित्रा 3 सी) के साथ सिलिकॉन फ्लश काटा।
  5. लपेटें एकpolytetrafluoroethylene (PTFE) की छोटी राशि (~ 4 परतों) एक तरफ बंदरगाह के आसपास टेप।

3. सिस्टम सेटअप और नसबंदी

नोट: पंप ट्यूबिंग और फाइबर के साथ मॉड्यूल autoclaved नहीं कर रहे हैं और 70% इथेनॉल का उपयोग निष्फल रहे हैं। लेखकों औजार पंप के साथ पंप ट्यूबिंग इस्तेमाल किया जा करने के लिए सलाह देते हैं। नीचे प्रक्रिया एक लामिना का प्रवाह हुड में किया जाता है।

  1. आटोक्लेव (धारा 2.1 के रूप में) सभी घटकों autoclavable सेट-अप करने से पहले।
  2. सेट अप
    1. , क्यू श्रृंखला टोपी, आहार नली, पंप और पंप ट्यूबिंग (तालिका 1) चित्रा 4 में के रूप में जलाशय की बोतल और जलाशय बोतल सेट-अप में 10 मिलीलीटर 70% इथेनॉल रखें।
    2. शिथिल PTFE टेप पक्ष पोर्ट पर एक अंत टोपी जगह है। मॉड्यूल समाप्त होता है और मुक्त पक्ष पोर्ट पर एल / S16 मॉड्यूल कनेक्टर्स के सिरों स्लाइड। चित्रा 2B में के रूप में एल / S13 मॉड्यूल कनेक्टर छाया हुआ पक्ष बंदरगाह निकटतम करने के लिए ट्यूबिंग (तालिका 1) की एक 40 मिमी धारा कनेक्ट
    3. पंप ट्यूबिंग के लिए मॉड्यूल कनेक्ट मॉड्यूल बोध कराता है, ताकि छाया हुआ पक्ष बंदरगाह पंप निकटतम है सुनिश्चित करने।
    4. चूना लाइन और मॉड्यूल कनेक्टर्स और एल / जलाशय बोतल पर वाई-कनेक्टर के S14 (तालिका 1) के लिए retentate लाइन कनेक्ट। सुनिश्चित करें कि सेट-अप चित्रा 4 में schematics जैसा दिखता है।
  3. बंध्याकरण
    1. 800 μl / पर्याप्त समय> 30 मिनट के लिए unautoclaved घटकों के इलाज के लिए मानव संसाधन (फाइबर प्रति 267 μl / घंटा) पर मॉड्यूल के माध्यम से इथेनॉल पंप (बार समायोजित करता है, तो अन्य स्टरलाइज़ तरीकों का इस्तेमाल कर रहे हैं, 25 देखें)।
  4. धुलाई
    1. सिस्टम से बाहर इथेनॉल धोने के लिए, पहले पंप बंद कर देते हैं और ट्यूबिंग नाली। सबसे पहले, मॉड्यूल एडाप्टर ट्यूबिंग से पंप ट्यूबिंग अलग। फाइबर और retentate लाइन से बाहर इथेनॉल के निकास के लिए, वापस जलाशय बोतल में ऊपर मॉड्यूल पकड़ो। मॉड्यूल वें पलायन करने से साइड बंदरगाह अंत टोपी निकालेंमॉड्यूल ही है, और चूना लाइन से ई इथेनॉल। पक्ष बंदरगाह अंत टोपी पुनः अनुलग्न। पंप ट्यूबिंग और इथेनॉल के फ़ीड लाइन के निकास के लिए पंप पर मीडिया के प्रवाह को उल्टा। पंप बंद कर दें, और मॉड्यूल एडाप्टर के लिए पंप ट्यूबिंग पुनः अनुलग्न।
    2. ढक्कन से इथेनॉल बोतल खोलना और सीरम के बिना (जैसे EMEM, GMEM, DMEM या RPMI) के रूप में सेल के विकास के माध्यम के 10 मिलीग्राम से युक्त एक बोतल के साथ बदलें। 800 μl प्रणाली के माध्यम से मध्यम पम्प / घंटा retentate लाइन तक मीडिया से भरा है। मॉड्यूल धोने के लिए फाइबर के माध्यम से मीडिया के पारगमन के लिए मजबूर करने retentate लाइन दबाना। ~ 2 घंटे के लिए धो लें।

4. सीडिंग

नोट: मीडिया और इस प्रोटोकॉल में इस्तेमाल उन है कि वांछित सेल प्रकार के लिए स्थापित कर रहे हैं होना चाहिए की आपूर्ति करता है। कृपया साहित्य का उल्लेख है, अधिक जानकारी के लिए सेल संस्कृतियों के यूरोपीय संग्रह (ECACC) और अमेरिकी प्रकार संस्कृति संग्रह (ATCC)। पहले mainta के लिए इस विधि कोशिकाओं होना चाहिएined वांछित सेल प्रकार के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार। इस कार्य के लिए हिपेटोकार्सिनोमा सेल लाइन HepG2 / C3A subclone वितरकों सिफारिशों (ATCC) के अनुसार बनाए रखा गया।

नोट: यह भी नीचे प्रस्तुत बोने प्रोटोकॉल सेल के विकास के लिए पूर्व-संस्कृति पूर्व सेल संस्कृति के माध्यम से मॉड्यूल के लिए कार्य करता है। एक अधिक व्यापक पूर्व-संस्कृति तो आवश्यक होना चाहिए इस सिस्टम से धोने मीडिया draining विकास मीडिया के साथ की जगह है और कुछ घंटों के लिए मॉड्यूल के माध्यम से इस permeating द्वारा मॉड्यूल बोने से पहले बाहर किया जाना चाहिए। व्यवस्था में मीडिया की जगह पर जानकारी के लिए खंड 7.5.2.1 देखें।

  1. वांछित सेल प्रकार के लिए स्थापित प्रोटोकॉल के अनुसार trypsinization द्वारा एक एकल कक्ष निलंबन तैयार करें। एक T75 संस्कृति के लिए एक सामान्य प्रोटोकॉल इस प्रकार है:
    नोट: कोशिकाओं की संख्या बोने कदम में उपयोग करने के अनुभव से अपने वांछित सेल प्रकार के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। बायोरिएक्टर यहाँ वर्णित एक 35 गुना अधिक सेल पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैंरास घनत्व (सेल / 2 सेमी) की तुलना में एक 7 दिन संस्कृति के लिए 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक में इस्तेमाल किया।
    1. 10 मिलीलीटर फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस), महाप्राण जोड़कर कोशिकाओं को धो लें, तो 3 मिलीलीटर 0.05% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) जोड़ने (पर्याप्त कोशिकाओं को कवर करने के लिए) और 5 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेते हैं।
    2. 7 मिलीलीटर विकास मीडिया में हार्वेस्ट कोशिकाओं 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक trypsin बेअसर। अच्छी तरह मिक्स, एक hemocytometer के चैम्बर के लिए 10 μl जोड़ें और कोशिकाओं की गिनती।
    3. 5 मिनट के लिए 200 XG पर अपकेंद्रित्र गोली कोशिकाओं।
    4. विकास मीडिया में 4x10 6 मिलीग्राम / सतह पर तैरनेवाला और resuspend कोशिकाओं के रूप में वांछित सेल प्रकार के लिए आवश्यक पूरक aspirate।
  2. पंप बंद करें और आहार नली और 3.4.1 के रूप में मॉड्यूल नाली।
  3. मॉड्यूल कनेक्टर्स से मॉड्यूल को अलग करें और मॉड्यूल अंत टोपियां (तालिका 1) 70% इथेनॉल में पूर्व निष्फल देते हैं, मुक्त एक तरफ बंदरगाह छोड़ने। </ Li>
  4. एक 18 जी सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर, देखभाल करने के बुलबुले के गठन से बचने के लिए और नहीं तंतुओं को नुकसान करने के लिए मॉड्यूल के लिए सेल निलंबन (2x10 6 कोशिकाओं) (4.1.4) का ~ 500 μl स्थानांतरण।
    1. एक अंत टोपी का उपयोग कर पक्ष बंदरगाह कैप। 180 ° हर 5 मिनट से मॉड्यूल के मैनुअल मोड़ के साथ 2-4 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 में कोशिकाओं को सेते हैं। वैकल्पिक मॉड्यूल एक आंतरायिक मिश्रण सेटिंग (तालिका 1) के साथ एक ट्यूब रोटेटर से जुड़ा जा सकता है।
  5. बोने के बाद, एक इंजेक्शन बंदरगाह (तालिका 1) 70% इथेनॉल में पूर्व निष्फल पर एक अंत टोपी देते हैं, और PTFE टेप पक्ष बंदरगाह के लिए इस देते हैं। दूसरी तरफ पोर्ट अंत टोपी निकालें और धीरे धीरे एक 27 जी सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज का उपयोग कर संलग्न इंजेक्शन बंदरगाह में हवा इंजेक्शन लगाने के द्वारा कोशिकाओं नाली।
    1. एक अंत टोपी के साथ इंजेक्शन बंदरगाह बदलें। धीरे-धीरे मुक्त करने के पक्ष बंदरगाह और 1 मिलीलीटर सिरिंज के साथ एक 18 जी सुई का उपयोग कर मीडिया के साथ मॉड्यूल भरें। रेमोमॉड्यूल अंत टोपियां ve और मॉड्यूल कनेक्टर्स का उपयोग करने के लिए ट्यूबिंग मॉड्यूल देते हैं।
  6. 50 मिलीलीटर विकास मीडिया और प्रक्रिया 7.5.2.1 में विस्तृत निम्नलिखित की खुराक से युक्त एक साथ धोने मीडिया बोतल बदलें। 800 μl / घंटा प्रणाली के माध्यम से विकास मीडिया पम्प।

5. प्रसार

नोट: फाइबर यहाँ वर्णित अनुसंधान प्रणाली में इस्तेमाल एक 800 μl / घंटा फ़ीड दर के साथ ~ 80 μl / घंटा तर करने, सेट कर रहे हैं।

  1. एक humidified इनक्यूबेटर 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 पर सेट में से 7 दिन की अवधि के लिए कोशिकाओं को विकसित करने के लिए फाइबर का प्रयोग करें।
    नोट: विकास के चरण के दौरान पोषक तत्वों और चयापचयों की निगरानी प्रसार पर उपयोगी जानकारी, चयापचय तेज और कोशिकाओं और मीडिया में पोषक तत्व और मेटाबोलाइट स्तर के उत्पादन प्रदान कर सकते हैं। उदाहरण के लिए उपयोग और लैक्टेट उत्पादन ग्लूकोज। किट विभिन्न आपूर्तिकर्ताओं कि मीडिया से इन कारकों quantitate कर सकते हैं से उपलब्ध हैं (देखें

6. छांटना

नोट: फाइबर विश्लेषण के लिए एक प्रयोग के अंत में मॉड्यूल से excised जा सकता है।

  1. हाल चलाना और HFB नाली।
  2. एक छुरी / माइक्रो चाकू (तालिका 1) गिलास और सिलिकॉन के बीच ब्लेड डालें। मॉड्यूल बारी के रूप में तो गिलास से सिलिकॉन दूर कटौती करने के लिए। मॉड्यूल के दोनों सिरों पर इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
  3. ब्लेड का प्रयोग एक छोर से सिलिकॉन प्लग बाहर हुक और धीरे से खींच। सुनिश्चित करें कि फाइबर इसके साथ आते हैं।
    4. 7. सेल विश्लेषण

    1. सेल नंबर
      नोट: विकास दर काफी हद तक सेल घनत्व इस समय सीमा में प्राप्त के साथ बदल नहीं है के रूप में इस अध्ययन के 7 दिन के विकास की अवधि के भीतर किसी भी समय अंक इस गणना में उपयोग के लिए उपयुक्त हैं में इस्तेमाल C3A कोशिकाओं के लिए।
      1. छांटना (धारा 6) के बाद धोने और उन्हें 0.5 मिलीलीटर Tris EDTA (ते) बफर युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कटौती करने के लिए पीबीएस में फाइबर डुबकी। एक में दो फ्रीज पिघलना चक्र के लिए इस विषय -80 सेल्सियस फ्रीजर। डीएनए सामग्री को मापने PicoGreen का उपयोग करते हुए और एक मानक वांछित सेल प्रकार 26 के साथ किए गए वक्र करने के लिए इस मूल्य की तुलना द्वारा सेल नंबर का निर्धारण।
    2. सेल प्रसार दरों
      1. सेल नंबर की गणना के दो अलग अलग समय बिंदुओं पर गणना का उपयोग कर विशिष्ट विकास दर μ (समीकरण 1) जहां एल.एन. (X1) पहली बार बिंदु और एल.एन. (X2) पर सेल नंबर की प्राकृतिक प्रवेश है सेल का प्राकृतिक लॉग है दूसरी बार बिंदु पर नंबर।
        μ = (एल.एन. (X2) -Ln (X1)) / समय (मानव संसाधन) (1)

        इस से जनसंख्या दुगनी बार (डीटी) (2 समीकरण) जहां μ विशिष्ट विकास दर की गणना है।

        डीटी = LN2 / μ (2)
    3. सेल व्यवहार्यता
      1. छांटना (धारा 6) के बाद धोने और उन्हें 500 μl 0.05% trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) युक्त एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में कटौती करने के लिए पीबीएस में फाइबर डुबकी। 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      2. मिक्स और 10 μl trypan नीले रंग के लिए सेल निलंबन के 10 μl जोड़ें। लोड 10 μl एक रुधिरकोशिकामापी पर और मृत (नीला) और जीवित कोशिकाओं की संख्या गिनती।
    4. इमेजिंग
      1. छांटना के बाद धोने और कैंची का उपयोग करने के लिए उन्हें एक 24 अच्छी तरह से थाली में छोटे लंबाई में कटौती करने के लिए पीबीएस में फाइबर डुबकी। (पीबीएस) में 400 μl 4% paraformaldehyde जोड़ें और 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं।
      2. μl पर और बंद 400 pipetting द्वारा पीबीएस के साथ धो लें। दोहराएँ थीताजा पीबीएस के साथ कदम है।
      3. 400 μl 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) पीबीएस में लगभग पतला जोड़ें। 100 एनजी / एमएल और 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं। लाइट से बचाएँ।
      4. दो बार (7.3.2) के रूप में पीबीएस के साथ धोने और एक बार एच 2 ओ के साथ एक प्रतिदीप्ति बढ़ते मध्यम तुरंत फाइबर और छवि को कवर करने के लिए सूखी नमूने से पहले डेटा एकत्र करने के लिए जोड़ें (DAPI पूर्व / उन्हें; 359/461 एनएम)।
      5. विभिन्न फोकल विमानों पर चित्र लेने और 'स्टैकिंग ध्यान केंद्रित' सॉफ्टवेयर का उपयोग (जैसे, ImageJ के लिए ढेर focuser प्लगइन, नीचे) क्षेत्र के एक तेजी से बढ़ा गहराई दिखा एक समग्र छवि बनाने के लिए। के रूप में फाइबर फ्लैट नहीं हैं यह आवश्यक है।
        1. डाउनलोड ImageJ (http://imageJ.nih.gov/ij/) और 'ढेर focuser' प्लगइन (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/stack-focuser.html)।
        2. ImageJ में खोलने छवियों खड़ी होने के लिए। फिर 'छवि' मेनू में 'ढेर' के लिए जाना - 'ढेर के लिए छवियाँ'। 'प्लगइन्स' मेनू में 'ढेर focuser करने के लिए जाना'। nxn कर्नेल के लिए एक एन निर्दिष्ट करें। ट्रायल और 'एन' के साथ त्रुटि आदेश छोटे से 'शोर' के साथ एक छवि उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो सकता है। 11 और 77 के बीच मूल्यों में अच्छी तरह से काम करते हैं।
    5. एल्बुमिन स्राव
      नोट: यह एक hepatocyte सेल समारोह परीक्षण और न सेल समारोह की एक सामान्य परीक्षण है।
      1. बीज कोशिकाओं 10667/2 सेमी में (HepG2 / C3A) 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक पर और 6 दिनों के लिए हो। बीज HFBs धारा 4 में वर्णित है और 6 दिनों के लिए बढ़ने के रूप में।
      2. इस अवधि प्रसार संस्कृति मीडिया (EMEM + 10% FBS, 1x glutamine और 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन) टिशू कल्चर प्लास्टिक और HFB एक सीरम मुक्त विलियम्स ई मीडिया 1x glutamine और 24 घंटे के लिए 1x पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक करने के लिए बदलाव के बाद:
        1. ट्यूबिंग और HFB मॉड्यूल कदम 3.4.1 में निर्धारित निम्नलिखित नाली। जलाशय बोतल खोलना और विलियम्स ई मीडिया वाले एक बोतल के साथ इस जगह। 8 पर HFB के माध्यम से इस पंप00 μl / घंटा।
      3. 24 घंटा के बाद, मीडिया के नमूने ले। निर्माता के निर्देशों (तालिका 1) के अनुसार एलिसा द्वारा secreted एल्बुमिन यों। आदेश मानक वक्र की सीमा के भीतर एल्बुमिन सांद्रता में लाने के लिए 10 से 40 में 1 करने के लिए पतला मीडिया नमूने 1 उपयोग करने से पहले।

Representative Results

सेल बोने एक महत्वपूर्ण कदम है। एक 3 डी सेट-अप में फाइबर का पालन करने के लिए कोशिकाओं की क्षमता 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक के लिए देखा है कि तुलना में काफी कम है। यह सेल और सब्सट्रेट के बीच कम संपर्क समय के कारण होने की संभावना है। HFB में कोशिकाओं को बोने के स्थिर चरणों के दौरान मॉड्यूल के माध्यम से गिर जाते हैं। ये काफी 2 डी में इस्तेमाल एक निरंतर स्थिर चरण की तुलना में समय में कम कर रहे हैं। कोशिकाओं को इस समय में सब्सट्रेट करने के लिए कनेक्शन बनाने के लिए है। इसके अतिरिक्त, फाइबर की घुमावदार प्रकृति के कारण वहाँ कोई सपाट सतह कोशिकाओं आराम और कनेक्शन बनाने वहाँ 2 डी संस्कृति में है की तरह करने के लिए है। नदीम इस फाइबर के रसायन शास्त्र से भी बढ़ सकता कार्यरत हम इस इस अध्ययन में कार्यरत बहुलक के लिए मामला होने के लिए नहीं पता है (डेटा) नहीं दिखाया। बोने का समय और सेल बोने घनत्व में वृद्धि सेल समुच्चय के गठन कि एक तेजी से आर पर स्थिर चरणों के दौरान मॉड्यूल के माध्यम से गिर करने के लिए सुरागएकल कक्षों से खाया और आगे कोशिकाओं और सब्सट्रेट के बीच संपर्क समय कम कर देता है। समय बढ़ाने से भी मीडिया की पीली की ओर जाता है के रूप में वहाँ कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व और इस कदम के दौरान कोई मीडिया मुद्रा है। शर्तों के ~ का 15% की धारा 4 सेल बोने दरों में वर्णित का प्रयोग लगातार HepG2 / C3A कोशिकाओं (चित्रा 5 ए) के साथ प्राप्त कर रहे हैं। ; नदीम यह एक कम अंश माना जा सकता है कि वहाँ काफी कोशिकाओं दिन (आंकड़े 5 ब और 6) के एक मामले में अच्छी तरह से आबादी वाले तंतुओं पैदा कर रहे हैं एक सात दिन की अवधि प्रसार सेल घनत्व HFB में पहुँच 3x10 5/2 सेमी से आ रहा है के बाद। यह कई assays hepatocytes के उपयोग और संगम तक पहुंचने जा करने के लिए माना जा सकता है के लिए एक उपयुक्त घनत्व है।

जब 2 डी सेल संस्कृति (चित्रा 5C) में हासिल की तुलना में प्रसार HFB में हासिल की दरों में धीमी कर रहे हैं। यह संयुक्त राष्ट्र हैऔर इस: सिस्टम के गतिशील प्रवाह में कोशिकाओं की कमी के कारण के रूप में मीडिया में सेल मायने रखता है (संगम पर 24 घंटा प्रति 3674 कोशिकाओं, कुल कोशिकाओं के 4% है जो ± 20,343 कोशिकाओं ± SEM के औसत) कम कर रहे हैं होने की संभावना जब पारगमन दर 400 μl / घंटा अप करने के लिए दिया जाता है वृद्धि नहीं करता है (डेटा) नहीं दिखाया। यह भी व्यवहार्यता में कमी और कोशिकाओं के बाद नुकसान (देखें चित्र 5 डी और नीचे) के कारण होने की संभावना नहीं है। यह तथ्य इस सेल लाइन clonally HepG2 से ली गई है और सेल प्रसार के संपर्क निषेध दिखाने के लिए अपनी क्षमता पर चयनित किया गया था द्वारा समझाया जा सकता है कम से कम हिस्से में। HFB में कोशिकाओं 6x पर 2 डी कोशिकाओं जो धीमी प्रसार दर के लिए नेतृत्व कर सकते हैं के घनत्व वरीयता प्राप्त हैं।

व्यवहार्यता का प्रदर्शन> 90% कोशिकाओं के साथ HFB भर में उच्च बनी हुई है। Whilst वहाँ एक मामूली प्रवेश की तुलना में आउटलेट अंत में व्यवहार्यता में कमी आई है यह महत्वपूर्ण (टी परीक्षण पी होना नहीं पाया गया = 0.22)।

ग्लूकोज की खपत और लैक्टिक एसिड के उत्पादन की निगरानी धुन करने के लिए प्रणाली में मीडिया फ़ीड दर और मीडिया मात्रा इस्तेमाल किया गया है। 800 μl / घंटा और मिलीलीटर ग्लूकोज और लैक्टिक एसिड के स्तर से ऊपर बनाए रखा और नीचे (क्रमशः) कर रहे हैं 50 के कुल मीडिया की मात्रा मानक टिशू कल्चर प्लास्टिक संस्कृति में देखा उन का उपयोग करना।

एल्बुमिन स्राव एक प्रमुख जिगर hepatocytes द्वारा किए गए कार्य है। यह सीरम जहां यह परिवहन और homeostasis में कई भूमिकाएं निभाता में स्रावित होता है। HFB में विकसित कोशिकाओं द्वारा एल्बुमिन स्राव है कि अधिक से अधिक 15 गुना (चित्रा 7) 2 डी पर विकसित कोशिकाओं में है। यह दर्शाता है कि कोशिकाओं HFB में कार्यात्मक और कम से कम एल्बुमिन स्राव के मामले में, इस समारोह HFB में ऊपर उठाया जाता है।

जेपीजी "/>
चित्र 1 में विवो की तरह एक HFB का माहौल है। प्रकोष्ठों झरझरा फाइबर के बाहर पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं। मीडिया फाइबर लुमेन के माध्यम से दिया जाता है, एक रक्त केशिका नकल उतार। (ए) एक फाइबर के अनुदैर्ध्य खंड (पैमाने पर नहीं)। (बी) के पार एक 3 फाइबर रिएक्टर की धारा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. HFB मॉड्यूल। (ए) इस अध्ययन में इस्तेमाल मॉड्यूल के आयाम। आयामों 3 फाइबर वर्तमान अनुसंधान परियोजना की जरूरतों को फिट और पूरा करने के लिए चुने गए हैं। विभिन्न आकारों निर्मित है और अलग-अलग प्रणालियों और फाइबर के लिए सिलवाया जा सकता है। (बी) एम की एक तस्वीरसंलग्न अंत टोपी और मॉड्यूल कनेक्टर्स के साथ odule। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. मॉड्यूल निर्माण। (ए) फाइबर आकार में कटौती और मॉड्यूल में डाला जाता है। (बी) फाइबर मॉड्यूल, सूखे की अनुमति दी में चिपका रहे हैं। (सी) समाप्त होता है कांच से भरा काट रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. HFB सिस्टम सेट अप। तीर से संकेत मिलता मीडिया के प्रवाह की दिशा। लाल = आहार नली। पीला = पंप Tuहो सकता है। व्हाइट = HFB मॉड्यूल। क्लैंप के साथ ग्रीन = retentate ट्यूब। ब्लू = चूना ट्यूब। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. बोने, प्रसार, व्यवहार्यता और जैव रासायनिक विश्लेषण। (ए) वरीयता प्राप्त कोशिकाओं का प्रतिशत। काले हीरे व्यक्ति HFBs प्रतिनिधित्व करते हैं। लाल पट्टी मतलब है। (बी) कोशिकाओं सीडिंग पर और एक दिन 7 प्रसार अवधि के बाद घनत्व। 2 डी सेल नंबर trypsinization द्वारा और एक रुधिरकोशिकामापी का उपयोग गिनती निर्धारित किया गया है। HFB सेल नंबर PicoGreen परख और एक मानक वक्र C3A कोशिकाओं 26 से उत्पादित का उपयोग कर निर्धारित किया गया है। एन = 5-6। सलाखों = SEM। (सी) जनसंख्या बार दोहरीकरण। एन = 5-7। सलाखों = SEM। (डी) व्यवहार्यता TRYP द्वारा निर्धारितएक दिन 7 प्रसार के अंत में एक नीले अपवर्जन। इनलेट, केंद्रीय और आउटलेट HFB भीतर क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते। एन = 3-5। सलाखों = SEM। (ई एंड एफ) ग्लूकोज की खपत और लैक्टिक एसिड उत्पादन। स्तर जलाशय बोतल (प्रवेश) के साथ ही retentate पर नजर रखी और दुकानों चूना और टिशू कल्चर प्लास्टिक पर नियमित संस्कृति के लिए संचालन किया गया (मीडिया दिन 3 और 5 पर बदल)। एन = 3-5। सलाखों = SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6. एक HFB में फाइबर पर विकसित कोशिकाओं की छवियाँ। कोशिकाओं वरीयता प्राप्त और इससे पहले कि फाइबर excised थे 48 घंटे के लिए बड़े हो रहे थे, पीबीएस में धोया, 4% paraformaldehyde में तय, पीबीएस और DAPI के साथ दाग नाभिक में धोया। प्रत्येक छवि 12 की एक समग्र भारतीय सैन्य अकादमी खड़ी फोकस 'हैआदेश में GES परिणामस्वरूप छवि के क्षेत्र की गहराई बढ़ाने के लिए। उच्च और निम्न घनत्व सेल के क्षेत्रों में इस समय बिंदु पर फाइबर के साथ पाए जाते हैं और दिखाए जाते हैं। जहां वर्तमान फाइबर सीमाओं एक लाल धराशायी लाइन के साथ चिह्नित हैं। छवियाँ एक औंधा प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर ले जाया गया। छवि = 10X उद्देश्य। बार = 200 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 7
चित्रा 7. Albumin स्राव। प्रकोष्ठों धारा 4 प्रकोष्ठों 6 दिनों के लिए प्रचुर मात्रा में थे के रूप में वर्णित 10667/2 सेमी और HFB में टिशू कल्चर प्लास्टिक पर वरीयता प्राप्त कर रहे थे। इस अवधि के बाद प्रसार टिशू कल्चर प्लास्टिक और HFB संस्कृति मीडिया एक सीरम मुक्त विलियम्स ई मीडिया glutamine और पेनिसिलिन / streptomyci के साथ पूरक के लिए बदल गया था24 घंटे के लिए एन। मीडिया के नमूने ले जाया गया और एक एल्बुमिन निर्देश (तालिका 1) विनिर्माण के अनुसार एलिसा द्वारा मात्रा। एन = 5-6। सलाखों = SEM। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

अनुभाग उपकरण का नाम कंपनी बिल्ली। नहीं। टिप्पणियाँ इमेजिस
2 ग्लास HFB मॉड्यूल सोहम वैज्ञानिक --- कस्टम आइटम।
2.1 Sigmacote® सिग्मा Aldrich SL2
2.3 Silicoset 151 Intertronics ACCSS151 Silicएक गोंद।
2.5 PTFE टेप सिग्मा Aldrich Z104388
3.2.1 जलाशय बोतल मछुआ 11972619
क्यू श्रृंखला टोपी Kinesis 00932Q-3V PTFE एडेप्टर और फिटिंग अखरोट का पेंच धागे। क्यू श्रृंखला टोपी को देते हैं। 1 मिमी एडाप्टर के तहत आपूर्ति PTFE ट्यूबिंग के एक 8.5 सेमी अनुभाग और 3 मिमी एडाप्टर के तहत एक 4 सेमी खंड संलग्न। टेबल चित्रा 1
एडाप्टर, पुरुष, 1.0 मिमी आईडी Kinesis 008NB10-KD5L
एडाप्टर, पुरुष, 3.0 मिमी आईडी Kinesis 008NB30-KD5L
फिटिंग अखरोट Kinesis U-350
नवीनीकरण ट्यूबिंग मछुआ 10366344 neoprene ट्यूबिंग के 6 सेमी Hepa फिल्टर देते हैं और 'फिटिंग अखरोट' के लिए इस देते हैं। वाई-कनेक्टर के शीर्ष दो अकड़ और नीचे करने के लिए एल / S16 ट्यूबिंग का एक 3 सेमी अनुभाग के लिए एल / S14 ट्यूबिंग का एक 2x 30 मिमी वर्गों संलग्न। 3 मिमी आईडी एडाप्टर के कंटिया को यह संलग्न। (धारा 3.2.1) टेबल चित्रा 2
HEPA वेंट मछुआ 11374634
वाई-कनेक्टर, कांटेदार कोल परमार कहां-06295-10
एल / S16 सिलिकॉन टयूबिंग कोल परमार कहां-96410-16
एल / S14 सिलिकॉन टयूबिंग कोल परमार WZ-96410-14
एल / S13 सिलिकॉन टयूबिंग कोल परमार कहां-96410-13 80 सेमी पंप टब के लिए Q-Series टोपी पर 1.0 मिमी कांटेदार एडाप्टर कनेक्ट करने के लिए आईएनजी = आहार नली।
WM 205U / सीए पंप मछुआ 1248-6300
WM पंप ट्यूबिंग, परमवीर चक्र, नीले, नारंगी, 0.25 मिमी बोर मछुआ 12416310 PTFE पुरुष एडाप्टर के पेंच धागे और महिला अनुकूलक कनेक्ट। अकड़ में से एक पर पंप ट्यूबिंग काम करते हैं। ट्यूबिंग के दूसरे छोर पर इस सेट अप दोहराएँ। (धारा 3.2.1) टेबल चित्रा 3
एडाप्टर, पुरुष, 1.0 मिमी आईडी Kinesis 008NB10-KD5L
एडाप्टर, महिला, 1.0 मिमी आईडी Kinesis 008NB10-KD2L
3.2.2 महिला Luer टोपी कोल परमार WZ-45508-64 पक्ष बंदरगाह अंत टोपियां। blefig4.jpg "/> टेबल चित्रा 5
एल / S13 सिलिकॉन टयूबिंग कोल परमार कहां-96410-13 40 मिमी धारा एक मॉड्यूल कनेक्टर के लिए पंप ट्यूबिंग कनेक्ट करने के लिए।
एल / S16 सिलिकॉन टयूबिंग कोल परमार कहां-96410-16 3x एल 30 मिमी / S16 reducers = मॉड्यूल कनेक्टर्स 3x करने के लिए फिट है। (धारा 3.2.2)
कंटीले प्रसारण 1/8 "x 1/16" कोल परमार 30616-43
3.2.4 एल / S13 सिलिकॉन टयूबिंग कोल परमार कहां-96410-13 55 सेमी खंड एल क्यू श्रृंखला टोपी पर वाई-कनेक्टर / S14 के लिए retentate कनेक्ट करने के लिए। टेबल चित्रा 6
एल / S13 सिलिकॉन टयूबिंग कोल परमार कहां-96410-13 45 सेमी खंड एल क्यू श्रृंखला टोपी पर वाई-कनेक्टर / S14 को चूना कनेक्ट करने के लिए।
सीधे कांटेदार संघ कोल परमार WZ-30612-43 एल / S13 कि वाई-कनेक्टर के एल / S14 के साथ जुड़ जाएगा के अंत को देते हैं।
3.4.2 दबाना VWR 229-0609
4.3 4 मिमी सिलिकॉन टयूबिंग मछुआ FB68858 टयूबिंग की एक 40 मिमी खंड पर गुना और एक केबल टाई = मॉड्यूल अंत टोपी के साथ सुरक्षित है। (धारा 4.3) टेबल चित्रा 7
केबल टाई मछुआ 12326377
4.4 MACSmix ट्यूब रोटेटर Miltenyi बायोटेक 130-090-753 एक अनुकूलन attac करने के लिए आवश्यक हो सकता हैज मॉड्यूल।
4.5 Leur इंजेक्शन बंदरगाह थीस्ल वैज्ञानिक आईबी 10820 इंजेक्शन बंदरगाह के अंत टोपी संलग्न। (धारा 4.5)
महिला Luer टोपी कोल परमार WZ-45508-64
5 एल लैक्टिक एसिड किट Megazyme कश्मीर देर
5 डी ग्लूकोज किट Megazyme कश्मीर gluc
6.2 स्केल्पल / माइक्रो चाकू InterFocus 10315-12
7.4.3 एल्बुमिन एलिसा Bethyl लैब्स E80-129

तालिका 1 HFB सेट-अप के अवयव।

Discussion

यह पांडुलिपि स्तनधारी सेल संस्कृति के लिए सेट अप और एक खोखला फाइबर बायोरिएक्टर (HFB) प्रणाली के संचालन का वर्णन है और इसकी उपयोगिता hepatocyte सेल लाइन HepG2 / C3A proliferating में प्रदर्शन किया है। प्रणाली एक मानक इनक्यूबेटर और इसके सेट-अप की शेल्फ पर फिट करने के लिए डिज़ाइन किया गया है पर्याप्त किसी भी सक्षम सेल जीवविज्ञानी सड़न रोकनेवाला तकनीक से परिचित द्वारा किया जा करने के लिए सरल है।

यहाँ वर्णित अनुसंधान प्रणाली में इस्तेमाल किया फाइबर कास्टिंग (कताई) एक गैर biodegradable मालिकाना बहुलक का उपयोग कर चरण उलटा स्पिन द्वारा घर में निर्मित कर रहे हैं। यह सेल संस्कृति के लिए उपयुक्त है, दोनों biodegradable और गैर biodegradable, उदाहरण के लिए सामग्री की एक किस्म से कताई द्वारा फाइबर बनाने के लिए संभव है; पॉलिकैप्रोलैक्टोन (पीसीएल) 27, पाली एल lactide एसिड (PLLA) 28, पाली (लैक्टिक-सह-एसिड) (पीएलजीए) 29, polysulfone (पीएसयू) 12 और polyetheretherketone (तिरछी) 13। प्रत्येक अलग गुण एक हैएन डी प्रणाली की जरूरतों के आधार पर चुना जाना चाहिए। नसबंदी चरण में इस्तेमाल इथेनॉल के साथ कार्यरत फाइबर की अनुकूलता की जांच। पीएलजीए इथेनॉल ऐसे एंटीबायोटिक / कवकनाशी समाधान 25 के रूप में एक वैकल्पिक उपचार की जरूरत के साथ Plasticize करने के लिए जाना जाता है।

कांच यहां इस्तेमाल किया मॉड्यूल के आयामों वर्तमान अनुसंधान की जरूरतों के आधार पर चुने गए हैं। विभिन्न आकारों किसी भी सम्मानित कांच उड़ाने कंपनी द्वारा बनाया जा सकता है। मॉड्यूल आकार में एक विचार कोशिकाओं की संख्या है, जो मॉड्यूल में फाइबर और संभावना प्रवाह दरों की संख्या से जुड़ा हुआ है। अधिक कोशिकाओं वहाँ मॉड्यूल उच्च प्रवाह दरों के आदेश बायोरिएक्टर का बहिर्वाह अंत में अनुकूल संस्कृति की स्थिति बनाए रखने के लिए की आवश्यकता होगी रहे हैं। यह एक सीमा के कुछ बिंदु और कुछ परीक्षण और त्रुटि के रूप में मॉड्यूल चूना में मीडिया की स्थिति की निगरानी के साथ आवश्यक हो सकता तक पहुंच जाएगा। गणितीय मॉडलिंग आवश्यक मॉड्यूल Dimen में कुछ अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता हैवजहें और प्रवाह की दर 22।

यहां इस्तेमाल तंत्र के आयाम एक मशीन शेल्फ पर फिट करने के लिए बनाया गया है। टयूबिंग की लंबाई लंबाई whilst भी घटकों के लिए पर्याप्त आंदोलन की अनुमति सेट-अप और ऑपरेशन के लिए अनुमति देने के लिए कनेक्टर्स के बीच तक पहुँचने की जरूरत से निर्धारित होता है। समय के पाठ्यक्रम के नमूने की आवश्यकता है, मॉड्यूल में मीडिया की स्थिति की निगरानी में उदाहरण के लिए तो इंजेक्शन बंदरगाहों retentate करने के लिए जोड़ा जा सकता है चूना और लाइनों चूना इस सुविधा के लिए।

किसी भी सेल संस्कृति प्रणाली के लिए एक शर्त कोशिकाओं को जीवित और सबसे बढ़ रहा मामलों में रखने के लिए है। 3 डी संस्कृति प्रणालियों में विकसित कोशिकाओं में phenotype तरह विवो में एक और अधिक का प्रदर्शन अध्ययन के प्रकाश में यह भी एक वातावरण है कि निकट vivo वातावरण में कोशिकाओं द्वारा सामना करना पड़ा mimics प्रदान करने के लिए महत्वपूर्ण लगता है। यह आखिरी बिंदु अक्सर सुविधा इस संस्कृति प्रणाली प्रदान करता है के पक्ष में 2 डी सेल संस्कृति में उपेक्षित है। टीवह फाइबर के लुमेन के माध्यम से कोशिकाओं को पोषक तत्वों देने से विवो केशिका नेटवर्क में mimics HFB। अपशिष्ट उत्पादों को भी गतिशील प्रवाह से प्रणाली से हटा रहे हैं। यह सेल संस्कृति और एक है कि निकट vivo वातावरण hepatocytes द्वारा देखा mimics के लिए एक विवो तरह सिस्टम बनाता है, इस प्रणाली के लिए एक बेहतर विकल्प बनाने के लिए इन कोशिकाओं संवर्धन के लिए 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक की तुलना में। यह इस तथ्य से मंडित है कोशिकाओं छिपाना 15 गुना 2 डी टिशू कल्चर प्लास्टिक पर हो उन लोगों की तुलना एल्बुमिन की राशि, एक महत्वपूर्ण यकृत समारोह, HFB संस्कृति प्रणाली में।

नदीम HFB प्रणाली सबसे नहीं तो सब लंगर निर्भर प्रकार की कोशिकाओं के लिए अनुकूल है, उदाहरण के लिए यहाँ hepatocytes है क्योंकि दवा उद्योग द्वारा कार्यात्मक संस्कृति, अधिक विवो तरह दवा के विकास में उपयोग के लिए hepatocytes करने में सक्षम होना करने के लिए एक असली जरूरत है वहाँ और बाह्य-समर्थन के लिए bioartificial जिगर उपकरणों मेंजिगर की विफलता रोगियों की। अधिक कार्यात्मक कोशिकाओं के लिए की जरूरत है इन उदाहरणों से परे फैली हुई है, खासकर के रूप में पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र translational काम का एक चरण में प्रवेश करती है। एक अधिक विवो तरह संस्कृति पर्यावरण के फायदे अनदेखी नहीं की जानी चाहिए।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Glass HFB Module Soham Scientific  ---  Custom Item. (Section 2)
Sigmacote Sigma-Aldrich SL2 (Section 2.1)
Silicoset 151 Intertronics ACCSS151 Silicone Glue. (Section 2.3)
PTFE tape Sigma-Aldrich Z104388 (Section 2.5)
Reservoir bottle Fisher 11972619 PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1)
Q-series cap Kinesis 00932Q-3V PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1)
Adapter, Male, 1.0 mm ID Kinesis 008NB10-KD5L PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1)
Adapter, Male, 3.0 mm ID Kinesis 008NB30-KD5L PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1)
Fitting Nut Kinesis U-350 PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5 cm section of the supplied PTFE tubing under the 1 mm adapter and a 4 cm section under the 3 mm adapter. (Section 3.2.1)
Neoprene tubing Fisher 10366344 Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1)
HEPA-vent Fisher 11374634 Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1)
Y-connector, barbed Cole Parmer OU-06295-10 Attach the Hepa filter to 6 cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1)
L/S16 Silicone tubing Cole Parmer OU-96410-16 Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1)
L/S14 Silicone tubing Cole Parmer WZ-96410-14 Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30 mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3 cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3 mm ID adapter. (Section 3.2.1)
L/S13 Silicone tubing Cole Parmer OU-96410-13 80 cm to connect the 1.0 mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1)
WM 205U/CA pump Fisher 1248-6300 (Section 3.2.1)
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25 mm bore Fisher 12416310 PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1)
Adapter, Male, 1.0 mm ID Kinesis 008NB10-KD5L PTFE the screw thread of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1)
Adapter, Female, 1.0 mm ID Kinesis 008NB10-KD2L PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1)
Female Luer cap Cole Parmer WZ-45508-64 Side port end caps. (Section 3.2.2)
L/S13 Silicone tubing Cole Parmer OU-96410-13 40 mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2)
L/S16 Silicone tubing Cole Parmer OU-96410-16 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2)
Barbed reducer 1/8"x1/16" Cole Parmer 30616-43 3x 30 mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2)
L/S13 Silicone tubing Cole Parmer OU-96410-13 55 cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4)
L/S13 Silicone tubing Cole Parmer OU-96410-13 45 cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4)
Straight barbed union Cole Parmer WZ-30612-43 Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4)
Clamp VWR 229-0609 (Section 3.4.2)
4 mm Silicone tubing Fisher FB68858 Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3)
Cable tie Fisher 12326377 Fold over a 40 mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3)
MACSmix tube rotator Miltenyi Biotech 130-090-753 An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4)
Leur Injection port Thistle Scientific IB-10820 Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5)
Female Luer cap Cole Parmer WZ-45508-64 Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5)
L-lactic acid kit Megazyme K-LATE (Section 5)
D-glucose kit Megazyme K-GLUC (Section 5)
Scalpel / micro knife InterFocus 10315-12 (Section 6.2)
Albumin ELISA Bethyl Labs E80-129 (Section 7.4.3)

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References

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Storm, M. P., Sorrell, I., Shipley, R., Regan, S., Luetchford, K. A., Sathish, J., Webb, S., Ellis, M. J. Hollow Fiber Bioreactors for In Vivo-like Mammalian Tissue Culture. J. Vis. Exp. (111), e53431, doi:10.3791/53431 (2016).

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