Den funksjonelle virkemåten av celler i kultur kan forbedres ved å dyrke i flere in vivo-lignende tre-dimensjonale kulturmiljøer 16-21. Dette manuskriptet beskriver oppsett og drift av en hul fiber bioreaktor system for in vivo-lignende pattedyr vev kultur.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
Vevskultur er en etablert teknikk for vekst og / eller vedlikehold av celler som har vært benyttet i over 100 år 1,2. Bekvemmeligheten av å studere celler og svar ex vivo har vidtrekkende fordeler slik eksperimenter som ellers ville være ekstremt utfordrende om ikke umulig, for eksempel generering av genmanipulerte cellelinjer og bruk av reporter celler i høy gjennomstrømning utvelgelsesassays 3. Mer nylig vev kultur har gitt opphav til feltet tissue engineering, for generering av in vitro-modeller og regenerativ medisin. Med disse programmene, har interessen for dynamiske tre-dimensjonal (3D) kultursystemer vokst betydelig.
3D-kultur metoder (definert her som en 3D-kultur substrat og / eller innføring av retnings dynamisk strømnings) bedre rekapitulere arkitektur av in vivo cellulære miljø, viktig for å oppnå enmer fysiologisk-lignende funksjon. Evnen til å trekke ut, vokse, differensiere og transplanterte cellene med sikte på å reparere sykt og skadet vev er et fagområde som har et stort potensial for pasienten nytte og kommersiell mulighet. For eksempel bruk av autologe keratinocytter for behandling av sår (se 4) og bruk av cellebaserte terapier for behandling av slag (se 5). Likeledes markedet for in vitro-modeller spenner medisiner til stratifisert medisin applikasjoner. Konvensjonen i vevskultur er fremveksten av heft eller forankringsavhengige celletyper på to-dimensjonale (2D) overflaten av en vev kultur kolbe. Mens tiden akseptert som gullstandarden i et forskningsprosjekt setting, har nyere interesse i vev tekniske applikasjoner streket det faktum at dagens 2D vevskultur miljøet er utilstrekkelig for den nødvendige opptrappingen i celleproduksjon 6.
For tilhenger celletyper en scaffold er nødvendig, noe som vil variere avhengig av sluttanvendelsen, både når det gjelder den kjemiske sammensetning og mekaniske egenskaper. Noen systemer benytter stillaser samt plate innsatser består av svært porøs matrise dannet av høy intern fase emulsjon templat (se 7) eller elektrospunnede fibre (se 8) krever minimum tilpasning fra konvensjonelle 2D kultur teknikker. Celler kan bli seedet på mikro av varierende komposisjoner og vokst i rørt tanker som leverer næringsstoffer og signalmolekyler, og bære bort avfall (massetransport) gjennom en dynamisk godt blandet miljø 9. Imidlertid er disse systemer begrenset i sin in vivo-lignende miljø og ytterligere forbedringer kan gjøres med hensyn til å skalere opp kostnader. Hule fiber bioreaktorer (HFBs) er et 3D-kultur-system som består av fibre festet til en modul med celler som vanligvis seeded på utsiden av de porøse fibre og medium som leveres gjennom fiber lumen (oversikt i ett0) (figur 1). HFBs har en in vivo-lignende miljø med fibrene som etterligner blodkapillærer og skjerming cellene fra de skjærspenninger i forbindelse med dynamisk leveringsmedium, samtidig som definert skjær å bli brukt til celler via fluidstrømning gjennom sideportene hvis ønskelig. Dette skaper et allsidig kultursystem med overlegne massetransport hvor høy celletetthet kan nås 11. HFB-systemet er godt egnet for opprettholdelse av forankringsavhengige celletyper og har blitt anvendt for å dyrke forskjellige celler, inkludert rotte pankreatiske Langerhans-øyer 12, mus β-TC-3-insulinoma cellelinje 12, primære humane hepatocytter 13, human bone marg mononukleære celler 14, Madin Darby canine nyreceller (MDCK) 15 og Caco-2 celler 16 for å nevne noen.
I tillegg til system fordelene ved masseoverføring og oppskalering, celler dyrket i 3D tissaksøke kultur systemer har en tendens til å være mer in vivo-lignende i morfologi og mer mottakelig for eksperimentelle signaler. For eksempel rotte primære hepatocytter viser et mer cuboidal morfologi, økt levedyktighet, større induksjon av cytokrom P450-enzym-aktivitet og økt følsomhet for paracetamol toksisitet når dyrket i et kommersielt tilgjengelig polystyren stillaset sammenlignet med celler dyrket i kultur 2D 17. Ved anvendelse av samme stillaset den hepatokarsinom cellelinje HepG2 har også blitt vist å øke produksjonen albumin 18 og viser et mer in vivo-lignende respons på metotreksat sammenlignet med 2D-dyrkede celler 19. Primære humane hepatocytter demonstrert forsinket dedifferentiation, høyere cytokrom-P450 aktivitet og økt clearance for 4/5 forbindelser testet i et perfusjon kultur system 20. Human neural stamceller avledet neuroner og glia dyrket i et kommersielt tilgjengelig polystyren stillas oppviste både høy (aksjonspotensial) og lav-frekvens CNCY (lokal feltpotensial) spontan aktivitet mens ingen neuronal aktivitet ble påvist i 2D-dyrkede celler 21. Caco-2 celler vist forbedret differensiering i en HFB i forhold til 2D kultur målt ved økt alkalisk fosfatase, γ-glutamyltransferase og P-glykoprotein aktivitet og høyere uttrykk av F-aktin og zona okkludens-1 protein 16. Til tross for fordelene, blir rutine dyrking av celler i annet enn et 2D vevskulturkolbe overflatesystemer likevel ikke praktisert i mange laboratorier, selv om det antall publikasjoner som siterer 3D cellekultur vokser (8-ganger økning i de siste 10 årene. Kilde : PubMed 'Resultater av året "verktøy undersøkt med" 3D kultur ").
Dette manuskriptet beskriver oppsett og driftsforhold for et HFB system for pattedyrcellekultur og demonstrerer sin nytte i dyrking av hepatokarsinom cellelinje HepG2 / C3A. Formålet med denne metoden er å kultur ble cellene ien mer in vivo-lignende kultur system som beholder nok enkelhet å gjøre det mottagelig for de som er nye til 3D-kultur-systemer. Begrunnelsen for å bruke HFBs i søknaden beskriver her, som er å forbedre forutsigbarheten av lever modeller er at det er teoretisk mulig å etterligne en lever sinusoid i HFB miljø 22. Dette er ikke tiden bart med andre kultursystemer.
Dette manuskriptet beskriver oppsett og drift av en hul fiber bioreaktor (HFB) system for pattedyrcellekultur og dens nytte er demonstrert i proliferating hepatocytter cellelinje HepG2 / C3A. Systemet er designet for å passe på sokkelen av en standard inkubator og sin set-up er enkel nok til å bli utført av en kompetent celle biolog kjent med aseptisk teknikk.
Fibrene brukes i forskningssystemet som er beskrevet her er produsert i huset av fase inversjon spin casting (spinning) ved bruk av en ikke-nedbrytbare proprietær polymer. Det er mulig å gjøre fibrene ved spinning fra en rekke materialer som er egnet for cellekulturer, både biologisk nedbrytbare og ikke-nedbrytbare, for eksempel; polykaprolakton (PCL) 27, poly-L-laktid syre (PLLA) 28, poly (melke-ko-glykolsyre) (PLGA) 29, polysulfon (PSU) 12 og polyetereterketon (PEEK) 13. Hver har ulike egenskaper ennd bør velges basert på behovene i systemet. Kontroller kompatibiliteten av den anvendte fiber med etanolen anvendes i steriliseringstrinn. PLGA er kjent for å mykne med etanol som nødvendiggjør en alternativ behandling, for eksempel antibiotisk / antimykotisk oppløsning 25.
Dimensjonene av glassmoduler som brukes her ble valgt basert på behovene til dagens forskning. Ulike størrelser kan gjøres av noen anerkjente glassblåsing selskap. En vurdering i modulen størrelse er antall celler, som er knyttet til det antall fibre i modulen og sannsynlige strømningshastigheter. Jo flere celler det er i modulen jo høyere strømningshastighetene må være for å opprettholde gode dyrkningsforhold ved utløpsenden av bioreaktoren. Dette vil nå en grense som bestemt tidspunkt, og noen prøving og feiling kan være nødvendig med overvåking av mediaforhold i modulen permeatet. Matematisk modellering kan gi noen innsikt i de nødvendige modul dimensjoner og strømningshastigheter 22.
Dimensjonene på apparatet som anvendes her er utformet for å passe inn i en inkubator hylle. Lengden av røret er diktert av lengden nødvendig for å nå mellom kontaktene samtidig som det tillater tilstrekkelig bevegelse av komponenter for å gi rom for oppsett og operasjon. Hvis tidsforløpet prøvetaking er nødvendig, for eksempel ved overvåkning av medie forhold i modulen permeat deretter injeksjonsporter kan tilsettes til retentatet og permeatet linjer for å lette dette.
En forutsetning for en hvilken som helst cellekultursystem er å holde cellene i live og i de fleste tilfeller vokser. I lys av studier som viser en mer in vivo-lignende fenotype i celler dyrket i 3D kultursystemer virker det også viktig å gi et miljø som etterligner in vivo miljøet støtt av cellene. Dette siste punktet er ofte neglisjert i 2D cellekultur i favør av bekvemmelig denne kulturen systemet tilbyr. Than HFB etterligner in vivo-kapillære nettverk ved å levere næringsstoffer til cellene gjennom hulrommet av fibrene. Avfallsprodukter blir også fjernet fra systemet av den dynamiske strømnings. Dette skaper en in vivo-lignende system for celledyrking og en som etterligner in vivo miljø sett av hepatocytter, noe som gjør dette system et bedre valg i forhold til 2D vevskultur plast for dyrking av disse cellene. Dette bekreftes av det faktum at cellene utskiller 15-ganger mengden av albumin, en viktig leverfunksjon, i det HFB kultursystemet sammenlignet med de som var dyrket på 2D-vevskultur plast.
Mens HFB-systemet er egnet til de fleste om ikke alle forankringsavhengige celletyper, i eksemplet her er for hepatocytter, fordi det er et reelt behov for å være i stand til kultur funksjonell, mer in vivo -lignende hepatocytter for anvendelse i legemiddelutvikling av den farmasøytiske industrien og i kunstige biologiske lever enheter for ekstrastøtteleverpasienter. Behovet for flere funksjonelle celler som strekker seg forbi disse eksemplene, særlig som feltet av regenerativ medisin går inn i en fase av translatorisk arbeid. Fordelene med en mer in vivo-lignende kultur miljø bør ikke bli oversett.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |