De functionele gedrag van cellen in kweek kan worden verbeterd door het kweken meer in vivo-achtige 3-dimensionale kweek omgevingen 16-21. Dit manuscript beschrijft de opzet en exploitatie van een holle vezel bioreactor systeem voor in vivo-achtige zoogdieren weefselkweek.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
Weefselkweek is een gevestigde techniek voor de groei en / of onderhouden van cellen die is gebruikt voor meer dan 100 jaar 1,2. Het gemak van het bestuderen cellen en reacties ex vivo heeft verreikende voordelen waardoor experimenten die anders zeer moeilijk zo niet onmogelijk is, bijvoorbeeld de productie van genetisch gemanipuleerde cellijnen en het gebruik van reporter cellen in high throughput screening assays 3. Recenter weefselkweek heeft geleid tot het gebied van weefselmanipulatie gegeven voor het genereren van in vitro modellen en regeneratieve geneeskunde. Met deze toepassingen, is de belangstelling voor dynamische 3-dimensionale (3D) kweeksystemen aanzienlijk gegroeid.
3D kweekmethoden (hier gedefinieerd als 3D cultuur substraat en / of de introductie van directionele dynamische stroom) beter recapituleren de architectuur van de in vivo cellulaire omgeving, belangrijk voor het bereiken van eenmeer fysiologische-achtige functie. Het vermogen om te extraheren, groei, differentiatie en transplantatie cellen met als doel het herstellen zieke en beschadigde weefsel een vakgebied dat een enorm voordeel voor de patiënt en commercieel potentieel heeft. Bijvoorbeeld het gebruik van autologe keratinocyten voor behandeling van brandwonden (zie 4) en het gebruik van celtherapie voor de behandeling van een beroerte (zie 5). Ook de markt voor in vitro modellen overspant preklinisch onderzoek gestratificeerd geneeskunde toepassingen. De conventie in weefselkweek is de groei van hechtende of ankerplaats soorten afhankelijk zijn cel op de 2-dimensionale (2D) oppervlak van een weefselkweek kolf. Terwijl momenteel aanvaard als de gouden standaard in een onderzoeksomgeving, heeft de recente interesse in tissue engineering-toepassingen gewezen op het feit dat de huidige 2D weefselkweek omgeving is onvoldoende voor de gewenste opschaling in cel productie 6.
Voor hechtende celtypen een scaffold is vereist, die zal variëren afhankelijk van het eindgebruik, zowel wat betreft de chemische samenstelling en mechanische eigenschappen. Sommige systemen maken gebruik van steigers en-plaat inserts die bestaat uit zeer poreuze matrix gevormd uit hoge interne fase emulsie template (zie 7) of electrospun vezels (zie 8) vereist minimale aanpassing van conventionele 2D kweektechnieken. Cellen kunnen worden gezaaid op microdragers van wisselende samenstelling en gekweekt in geroerde tanks die voedingsstoffen en signaalstoffen te leveren, en weg te voeren afvalstoffen (massatransport) door middel van een dynamische en gemengde omgeving 9. Echter, deze systemen beperkt in hun in vivo-achtige omgeving en verder kan worden verbeterd met betrekking tot opschaling kosten. Holle vezel bioreactoren (HFBs) zijn een 3D kweeksysteem dat bestaat uit een module met cellen meestal gezaaid op de buitenzijde van de poreuze vezels en media die door de vezel lumen vaste vezels (besproken in 10) (figuur 1). HFBs bieden een in vivo-achtige omgeving met de vezels nabootsen van bloedvaten en het afschermen van de cellen van de schuifspanning die aan dynamische media delivery, terwijl gedefinieerde shear via fluïdumstroming toe te passen op de cellen via de zijpoorten indien gewenst. Dit zorgt voor een veelzijdige cultuur systeem met superieure massatransport waarin hoge celdichtheden kan worden bereikt 11. Het HFB systeem is zeer geschikt voor het onderhoud van verankering afhankelijke celtypes en is gebruikt om de cultuur verschillende cellen waaronder rat pancreatische eilandjes van Langerhans 12, muis β-TC-3 insulinoma cellijn 12, primaire humane hepatocyten 13, menselijk bot beenmerg mononucleaire cellen 14, Madin Darby niercellen van honden (MDCK) 15 en Caco-2 cellen 16 te noemen.
Naast het systeem voordelen van diffusie en opschaling, gekweekt in 3D tissue cultuur systemen hebben de neiging meer in vivo-achtige in morfologie en meer inspelen op experimentele signalen te zijn. Bijvoorbeeld rat hepatocyten vertonen een kubische morfologie, verhoogde levensvatbaarheid grotere inductie van cytochroom-P450 enzym activiteit en verhoogde gevoeligheid voor paracetamol toxiciteit wanneer gekweekt in een commercieel verkrijgbare polystyreen scaffold vergeleken met cellen gekweekt in 2D kweek 17. Met dezelfde scaffold hepatocarcinoma de cellijn HepG2 werd ook aangetoond dat albumine productie verhogen en 18 een in vivo vertonen achtige respons op methotrexaat vergelijking met 2D-gekweekte cellen 19. Primaire humane hepatocyten aangetoond vertraagde dedifferentiatie, hogere cytochroom P450 activiteit en een verhoogde klaring voor 4/5 verbindingen getest in een perfusie kweeksysteem 20. Menselijke neurale stamcellen afgeleid neuronen en glia gekweekt in een commercieel verkrijgbare polystyreen steiger vertoonden zowel hoge (actiepotentiaal) en lage-frequency (lokale veld potentiële) spontane activiteit terwijl er geen neuronale activiteit werd gedetecteerd in de 2D-gekweekte cellen 21. Caco-2 cellen toonden verbeterde differentiatie in een HFB vergelijking met 2D kweek gemeten door verhoogde alkalische fosfatase, γ-glutamyltransferase en P-glycoproteïne activiteit en de expressie van F-actine en zona occludens-1 eiwit 16. Ondanks de voordelen, wordt de routine kweken van cellen anders dan een 2D weefselkweek kolf oppervlaktesystemen nog niet toegepast in veel laboratoria, hoewel het aantal publicaties citeren 3D celkweek groeit (8-voudige toename in de afgelopen 10 jaar. Source : PubMed 'Resultaten per Year' hulpmiddel onderzocht met '3D-cultuur').
Dit manuscript beschrijft de set-up en de werkomstandigheden van een HFB systeem voor zoogdiercellen cultuur en toont zijn nut in het kweken van de hepatocarcinoma cellijn HepG2 / C3A. Het doel van deze methode is de cellen te kweken ineen in vivo-achtige cultuur systeem dat genoeg eenvoud behoudt om het vatbaar zijn voor diegenen die nieuw zijn voor 3D-cultuur systemen. De grondgedachte achter het gebruiken HFBs de toepassing beschrijven hier namelijk het verbeteren van de voorspelbaarheid van levermodellen is dat het theoretisch mogelijk is om een leversinusoid nabootsen in het milieu 22 HFB. Dit is momenteel niet haalbaar is met andere kweeksystemen.
Dit manuscript beschrijft de opzet en exploitatie van een holle vezel bioreactor (HFB) voor zoogdiercellen cultuur en het nut ervan is aangetoond in prolifererende de hepatocyte cellijn HepG2 / C3A. Het systeem is ontworpen om te passen op de plank van een standaard incubator en de set-up is eenvoudig genoeg door een bevoegde celbioloog vertrouwd met aseptische techniek te worden uitgevoerd.
De vezels die in het onderzoekssysteem beschreven worden geproduceerd in huis door faseomkering rotatie gieten (spinnen) met een niet-bioafbreekbaar polymeer eigendom. Het is mogelijk om vezels te maken door het draaien van een verscheidenheid van materialen die geschikt zijn voor celkweek, zowel biologisch afbreekbare als niet-biologisch afbreekbaar, bijvoorbeeld; polycaprolacton (PCL) 27, poly-L-lactide zuur (PLLA) 28, poly (melkzuur-co-glycolzuur) (PLGA) 29, polysulfon (PSU) 12 en polyetheretherketon (PEEK) 13. Elk heeft verschillende eigenschappen van eennd worden gekozen op basis van de behoeften van het systeem. De overeenstemming van de gebruikte vezel met het ethanol in de sterilisatiestap. PLGA is bekend dat het plastificeren met ethanol noodzakelijk een alternatieve behandeling, zoals antibiotica / antimycotische oplossing 25.
De afmetingen van de glasmodule hier gebruikt werden gekozen op basis van de behoeften van het huidige onderzoek. De verschillende grootte kan worden gemaakt door een gerenommeerde glasblazen bedrijf. Een overweging bij moduulmaat het aantal cellen, dat gekoppeld is aan het aantal vezels in de module en mogelijke stroomsnelheden. Hoe meer cellen zijn in de module hoe hoger de stroomsnelheden moeten zijn om gunstige kweekomstandigheden handhaven op het uitstroomeinde van de bioreactor. Dit zal een limiet bepaald punt en wat trial and error vereist kan zijn met toezicht op media-omstandigheden in de module permeaat te bereiken. Wiskundige modellering kan enig inzicht in de benodigde module Dimen biedengen en debieten 22.
De afmetingen van de inrichting die hier gebruikt is bedoeld om te passen op een incubator plank. De lengte van de buis wordt bepaald door de lengte die nodig is om te bereiken tussen de aansluitingen, terwijl ook de mogelijkheid voor genoeg beweging van componenten mogelijk te maken voor de set-up en bediening. Als tijdsverloop bemonstering nodig is, bijvoorbeeld bij de bewaking van mediaomstandigheden in de module doordringen dan injectiepoorten kan worden toegevoegd aan het retentaat en permeaat lijnen om dit te vergemakkelijken.
Een voorwaarde voor een celcultuur is om cellen in leven en in de meeste gevallen blijven groeien. In het licht van onderzoeken die een in vivo-achtige fenotype in gekweekte cellen in 3D kweeksystemen lijkt het ook belangrijk om een omgeving die nauw bootst de in vivo omgeving waarmee de cellen. Dit laatste punt wordt vaak verwaarloosd in 2D celkweek in het voordeel van het gemak deze cultuur systeem biedt. THij HFB bootst in vivo capillaire netwerken door het leveren van voedingsstoffen naar de cellen door het lumen van de vezels. De afvalstoffen van het uit het systeem door de dynamische stroom. Hierdoor ontstaat een in vivo-achtige voor celcultuur en die nabootst de in vivo omgeving gezien door hepatocyten, waardoor dit systeem een betere keuze dan 2D weefselkweek kunststof voor het kweken van deze cellen. Dit wordt bevestigd door het feit dat de cellen scheiden 15 maal de hoeveelheid albumine, een belangrijke leverfunctie, in het HFB kweeksysteem vergeleken met die geteeld op 2D weefselkweek plastic.
Terwijl het HFB systeem is geschikt voor de meeste, zo niet alle verankering afhankelijke celtypen voorbeeld hier voor hepatocyten omdat er een reële behoefte kunnen cultuur functioneler, in vivo-achtige hepatocyten voor gebruik bij de ontwikkeling van geneesmiddelen door de farmaceutische industrie en in bioartificial lever apparaten voor extracorporale ondersteuningvan leverfalen patiënten. De behoefte aan meer functionele cellen verder reikt dan deze voorbeelden, met name op het gebied van regeneratieve geneeskunde gaat een fase van translationeel werk. De voordelen van een in-vivo-achtige cultuur milieu mag niet worden verwaarloosd.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |