Функциональное поведение клеток в культуре может быть улучшена путем культивирования в более в естественных условиях -как 3-мерных сред для культивирования 16-21. Эта рукопись описывает настройку и работу полой волоконной системы биореактора для в естественных условиях -like млекопитающих культуре ткани.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
Тканевая культура является признанным методом для роста и / или поддержания клеток , которые были использованы в течение более 100 лет 1,2. Удобства изучения клеток и ответов исключая виво имеет далеко идущие преимущества позволит проводить эксперименты , которые иначе были бы чрезвычайно сложно , если не невозможно, например, поколение генетически сконструированных клеточных линий и использование репортерных клеток в высокопроизводительного скрининга анализов 3. Совсем недавно тканевой культуры привело к области тканевой инженерии, для создания моделей в пробирке и для регенеративной медицины. С помощью этих приложений, интерес в динамических системах культуры 3-мерные (3D) значительно вырос.
Способы культивирования 3D (определенные здесь в качестве субстрата 3D культуры и / или введения направленного динамического потока) лучше резюмировать архитектуру сотовой среды в естественных условиях, важно для достиженияболее физиологичным подобные функции. Способность извлекать, расти, дифференцировать и клетки после трансплантации с целью восстановления больных и поврежденных тканей является полем исследования, которое имеет огромный потенциал для пользы пациента и коммерческой возможности. Например, использование аутологичных кератиноцитов для лечения ожогов (см 4) и применение терапии на основе клеток для лечения инсульта (см 5). Кроме того, на рынке моделей в пробирке охватывает обнаружение наркотиков в стратифицированных применения лекарственных средств. Конвенция в тканевой культуре является рост прикрепленных или анкерными типов зависимых клеток на 2-мерном (2D) поверхности тканевой культуральной колбы. Хотя в настоящее время принят в качестве золотого стандарта в условиях исследования, в последнее время интерес в инженерных приложениях тканевых особо отметил тот факт , что текущая среда 2D культуры ткани недостаточно для необходимого расширения масштабов производства клеток 6.
Для адгезивных типов ячейки а scaffold требуется, которая будет варьироваться в зависимости от конечного использования, с точки зрения как от химического состава и механических свойств. Некоторые системы используют каркасы , как хорошо пластинчатые вкладыши , состоящие из высоко пористой матрицы , образованной из высокой внутренней фазы эмульсии шаблонам (см 7) или electrospun волокна (см 8) , требующие минимальной адаптации от традиционных методов 2D культуры. Клетки могут быть посеяны на микроносителями различного состава и выращивали в перемешиваемых резервуарах , которые поставляют питательные вещества и сигнальные молекулы, и уносят продукты отходов (перенос массы) с помощью динамической хорошо смешанной среде 9. Тем не менее, эти системы ограничены в их естественных условиях -like среды в и дальнейшие улучшения могут быть сделаны в отношении для расширения масштабов затрат. Полое волокно биореакторы (HFBs) представляют собой систему 3D культуры , которые состоят из волокон , закрепляются в виде модуля с клетками , как правило , посеянных на внешней стороне пористых волокон и средств массовой информации поступает через полость волокна (обзор в 10) (Рисунок 1). HFBs предлагают виво -подобных среду с использованием волокон , имитирующих капилляры и экранирующими клетки от сдвиговых напряжений , связанных с доставкой динамических средств массовой информации, позволяя при этом определенный сдвиг применяться к клеткам с помощью потока текучей среды через боковые порты , если это необходимо. Это создает универсальную систему культуры с превосходной массового транспорта , в которых высокая плотность клеток может быть достигнуто 11. Система HFB хорошо подходит для поддержания анкерными зависимых типов клеток и использовали для культуры различных клеток , включая клетки крысы панкреатических островках Лангерганса 12, мышиные β-ТС-3 инсулиноме клеточная линия 12, первичные гепатоциты человека 13, кости человека одноядерные клетки костного мозга 14, Madin Darby клетки собачьих почек (MDCK) 15 и Сасо-2 клетки 16 , чтобы назвать несколько.
В дополнение к системе Преимущества массопереноса и расширение масштабов, клетки, выращенные в 3D ТИССистемы культуры Sue имеют тенденцию быть более в естественных условиях -как в морфологии и более чутко реагировать на экспериментальных сигналов. Например крыс первичные гепатоциты показывают более шестигранника морфологию, повышенную жизнеспособность, большую индукцию активности фермента цитохром-Р450 и повышенную чувствительность к токсичности парацетамола при выращивании в коммерчески доступного полистирола помост по сравнению с клетками , выращенных в 2D культуре 17. Используя ту же леску гепатокарцинома линия клеток HepG2 также было показано увеличение производства 18 альбумина и показывают более в естественных условиях -как ответ на метотрексат по сравнению с 2D культивируемых клеток 19. Первичные гепатоциты человека продемонстрировали замедленное дедифференцировку, более высокую цитохром-Р450 активность и увеличение клиренса на 4/5 тестируемых соединений в системе 20 культуры перфузионной. Человек нейронные стволовые клетки, полученные нейроны и глия, культивируемые в коммерчески доступного полистирола эшафот выставлены как высокую (потенциал действия) и низким frequeNCY (локальный потенциал поля) спонтанной активности , тогда как не нейронную активность была обнаружена в 2D культивируемых клетках 21. Сасо-2 клетки продемонстрировали повышенную дифференциацию в HFB по сравнению с 2D – культуры , измеренной повышенной щелочной фосфатазы, гамма-глутамилтрансферазы и P-гликопротеина активности и более высокой экспрессии F-актина и Zona occludens-1 белка 16. Несмотря на преимущества, процедура культивирования клеток в других, чем 2D тканевой культуры колбы поверхности системы до сих пор не практикуется во многих лабораториях, хотя количество публикаций со ссылкой на 3D культуры клеток растет (8-кратное увеличение за последние 10 лет. Источник : PubMed 'Результаты по года' инструмент зондировали '3D культуры').
Эта рукопись описывает настройку и условия эксплуатации системы HFB для культуры клеток млекопитающих и демонстрирует его полезность в культивировании гепатокарцинома клеточной линии HepG2 / C3À. Цель этого метода состоит в культуре клеток вболее естественных условиях -как система культуры в том , что сохраняет достаточную простоту , чтобы сделать его доступным для тех , кто являются новыми для систем 3D – культуры. Обоснованием использованием HFBs в приложении описаны здесь, что улучшить предсказуемость моделей печени является то , что теоретически это возможно , чтобы имитировать печеночной синусоиду в среде HFB 22. Это в настоящее время не представляется возможным с другими системами культуры.
Эта рукопись описывает настройку и работу системы полых волокон биореактор (ОРБ) для культуры клеток млекопитающих и его полезность проявляется в пролиферирующих гепатоцитов клеточной линии HepG2 / C3À. Система предназначена для размещения на полке стандартного инкубатора и его настройки достаточно, чтобы быть выполнена любым компетентным клеточный биолог, знакомый с асептики простой.
Волокна, используемые в системе исследований, описанных здесь производятся в доме с помощью фазовой инверсии спина литья (вращение), используя небиоразлагаемое запатентованную полимер. Можно сделать волокна пр дением из различных материалов, пригодных для культивирования клеток, как биоразлагаемые и не биоразлагаемые, например; поликапролактон (ПКЛ) 27, поли-L-лактида кислота (ПЛМК) 28, поли (молочной-гликолевой кислоты) (PLGA) 29, полисульфон (PSU) 12 и полиэфирэфиркетона (PEEK) 13. Каждый из них имеет разные свойства аго следует выбирать исходя из потребностей системы. Проверьте совместимость используемого волокна с этанолом, используемого на стадии стерилизации. ПЛГА известно пластификации с этанолом что требует альтернативного лечения , таких как антибиотик / противогрибковым раствором 25.
Были выбраны размеры стеклянных модулей, используемых здесь, исходя из потребностей текущего исследования. Различные размеры могут быть сделаны любым авторитетными стеклодувные компании. Рассмотрение размера модуля является количество ячеек, которая связана с количеством волокон в модуле и вероятных скоростей потока. Чем больше клеток существуют в модуле тем выше скорость потока будет необходимо для того, чтобы поддерживать благоприятные условия культивирования на выходном конце биореактора. Это позволит достичь предела в какой-то момент и некоторые проб и ошибок может потребоваться с мониторингом условий СМИ в модуле пермеата. Математическое моделирование может обеспечить некоторое представление необходимых модулей Дименаsions и скорости 22 потока.
Размеры устройства, используемого здесь предназначен для установки на полке инкубатора. Длина трубки продиктована длины, необходимой для достижения между разъемами в то же время позволяя достаточное перемещение компонентов для обеспечения установки и эксплуатации. Если требуется время отбора проб, конечно, например, в мониторинге условий медиа в модуле пронизывают затем инжекционные отверстия могут быть добавлены к ретентата и пермеата линии, чтобы облегчить это.
Предпосылкой для любой системы клеточной культуры, чтобы сохранить клетки живыми и в большинстве случаев растет. В свете исследований , демонстрирующих более в естественных условиях -like фенотипа в клетках , выращенных в системах 3D культуры также представляется важным , чтобы обеспечить среду , которая точно имитирует окружающую среду в естественных условиях , с которыми сталкиваются клетки. Этот последний пункт часто пренебрегают в клеточной культуре 2D в пользу удобства эта система предлагает культура. Tон HFB мимику в естественных условиях капиллярных сетях, предоставляя питательные вещества к клеткам через просвет волокон. Эти отходы также удаляются из системы динамического потока. Это создает естественных условиях -like системы в культуре клеток для и тот , который точно имитирует среду в естественных условиях , увиденные гепатоцитов, что делает эту систему более широкий выбор по сравнению с 2D тканевой культуры пластика для культивирования этих клеток. Это подтверждается тем фактом, что клетки секретируют 15-кратное количество альбумина, важную функцию печени, в системе культуры HFB по сравнению с теми, выращенных на 2D тканевой культуры пластика.
В то время как система HFB подходит для большинства , если не всех якорных зависимых типов клеток, пример здесь для гепатоцитов , потому что есть реальная потребность , чтобы быть в состоянии функциональной культуры, более в естественных условиях -like гепатоцитов для использования в разработке лекарственных средств в фармацевтической промышленности и в биоискусственных устройствах печени для экстракорпоральной поддержкибольных печеночной недостаточности. Потребность в более функциональных клеток выходит за пределы этих примеров, в частности в области регенеративной медицины входит в фазу поступательной работы. Преимущества более естественных условиях -like культурной среды в не следует упускать из виду.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |