Den funktionella beteende av celler i odling kan förbättras genom odling i mer in vivo -liknande 3-dimensionella odlingsmiljöer 16-21. Detta manuskript beskriver installation och drift av en ihålig fiber bioreaktor system för in vivo-liknande däggdjursvävnadskultur.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
Vävnadskultur är en etablerad teknik för tillväxt och / eller underhåll av celler som har använts i över 100 år 1,2. Bekvämligheten med att studera celler och svar ex vivo har långtgående fördelar tillåter experiment som annars skulle vara extremt utmanande om inte omöjligt, till exempel generering av genetiskt modifierade cellinjer och användningen av reporterceller i hög genomströmning screeningsanalyser 3. Mer nyligen vävnadskultur har gett upphov till området för vävnadsteknik, för genereringen av in vitro-modeller och för regenerativ medicin. Med dessa program, har intresset för dynamiska tre-dimensionell (3D) odlingssystem ökat avsevärt.
3D odlingsmetoder (som definieras här som en 3D-kultur substrat och / eller införandet av rikt dynamiska flöde) bättre rekapitulera arkitektur den cellulära miljön in vivo, viktigt för att uppnå enmer fysiologisk liknande funktion. Möjligheten att utvinna, växa, differentiera och transplantationsceller i syfte att reparera sjuka och skadade vävnaden är ett ämnesområde som har en enorm potential för patientnytta och kommersiell möjlighet. Till exempel användning av autologa keratinocyter för behandling av brännskador (se 4) och användningen av cellbaserade terapier för behandling av stroke (se 5). Likaså har marknaden för in vitro-modeller spänner läkemedelsutveckling till stratifierade medicin applikationer. Konventionen i vävnadskultur är tillväxten av fastsittande eller förankringstyper beroende cell på två-dimensionella (2D) ytan av en vävnadsodlingskolv. Även för närvarande accepteras som guldmyntfoten i en miljö forskning har nyligen intresse i vävnadstekniska tillämpningar betonade att nuvarande 2D vävnadsodlingsmiljö är otillräcklig för den önskade skala upp i cellproduktionen 6.
För vidhäftande celltyper en scaffold krävs, vilket kommer att variera beroende på slutanvändningen, när det gäller både den kemiska sammansättningen och mekaniska egenskaper. Vissa system använder ställningar samt plåtinsatser består av mycket porös matris bildad av hög inre fas emulsion mall (se 7) eller elektrospunna fibrer (se 8) kräver minimal anpassning av konventionella 2D odlingstekniker. Celler kan ympas på mikrobärare av olika kompositioner och odlas i omrörda tankar som levererar näringsämnen och signalmolekyler, och transportera bort slaggprodukter (masstransport) genom en dynamisk väl blandad miljö 9. Men dessa system begränsade i sin in vivo-liknande miljö och ytterligare förbättringar kan göras när det gäller att skala upp kostnaderna. Ihåliga fibrer bioreaktorer (HFBs) är en 3D-kultursystem som består av fibrer fixerade i en modul med celler typiskt ympats på utsidan av de porösa fibrerna och media som levereras genom fiberlumen (översikt i en0) (Figur 1). HFBs erbjuder en in vivo-liknande miljö med fibrerna härma blod kapillärer och skärm cellerna från skjuvspänningar i samband med dynamisk media leverans, samtidigt som definieras skjuvning som skall tillämpas på celler de via vätskeflöde genom sidoportar, om så önskas. Detta skapar ett mångsidigt odlingssystem med överlägsen masstransport där hög celltätheter kan nås 11. HFB systemet lämpar sig väl för underhåll av förankringsberoende celltyper och har använts för att odla en mängd olika celler inklusive råtta pankreatiska Langerhanska öar 12, mus β-TC-3 insulinom cellinje 12, primära mänskliga hepatocyter 13, humant ben märg mononukleära celler 14, Madin Darby njurceller från hund (MDCK) 15 och Caco-2-celler 16 för att nämna några.
Förutom system fördelarna med massöverföring och skala upp celler odlas i 3D tissue kultursystem tenderar att vara mer in vivo -liknande i morfologi och mer mottaglig för experimentella signaler. Till exempel råtta primära hepatocyter visar en mer kubiskt morfologi, ökad lönsamhet, ökad induktion av cytokrom-P450-enzymaktivitet och ökad känslighet för paracetamol toxicitet när den odlas i en kommersiellt tillgänglig polystyren byggnadsställning i förhållande till celler som odlas i 2D kultur 17. Med användning av samma scaffold den hepatokarcinom cellinjen HepG2 har också visat sig öka albuminproduktion 18 och visa en mer in vivo -liknande svar på metotrexat jämfört med 2D odlade celler 19. Primära humana hepatocyter visade fördröjd dedifferentiering högre cytokrom-P450-aktivitet och ökad clearance för 4/5 testade föreningar i en perfusion kultursystem 20. Human neurala stamceller som härrör neuroner och glia odlade i en kommersiellt tillgänglig polystyren schavotten uppvisade både hög (aktionspotential) och låg frequeNCY (lokal fältpotential) spontan aktivitet medan ingen neuronal aktivitet detekterades i 2D odlade celler 21. Caco-2-celler visade ökad differentiering i en HFB jämfört med 2D kultur mäts genom ökad alkalinfosfatas, γ-glutamyltransferas och P-glykoprotein aktivitet och högre uttryck av F-aktin och zona occludens-1 protein 16. Trots fördelarna rutinen odling av celler i andra fall än ett 2D-vävnadsodlingskolv yta system fortfarande inte praktiseras i många laboratorier, även om antalet publikationer citerar 3D cellodling växer (8-faldig ökning av de senaste 10 åren. Källa : PubMed 'Resultat Year "verktygs undersöktes med 3D-kultur").
Detta manuskript beskriver installation och driftsförhållanden av en HFB system för däggdjurscellkultur och visar dess användbarhet i odling av hepatokarcinom HepG2 / C3A. Syftet med denna metod är att odla cellerna ien mer in vivo -liknande kultursystem som bibehåller tillräckligt enkelhet att göra det mottagligt för dem som är nya till 3D-odlingssystem. Tanken bakom att använda HFBs i ansökan beskriver här, som är att förbättra förutsägbarheten i lever modeller är att det är teoretiskt möjligt att efterlikna en leversinuskurva i HFB miljön 22. Detta är för närvarande inte möjligt med andra odlingssystem.
Detta manuskript beskriver installation och drift av en fiber bioreaktor ihålig (HFB) system för däggdjurscellkultur och dess användbarhet demonstreras i prolifererande den hepatocyt HepG2 / C3A. Systemet är utformat för att passa på hyllan i en standardinkubator och dess set-up är tillräckligt enkel för att utföras av en behörig cellbiolog bekant med aseptisk teknik.
De fibrer som används i forskningssystemet som beskrivs här framställs i huset genom fasinversion spinngjutning (spinning) med hjälp av ett icke-nedbrytbart egen polymer. Det är möjligt att göra fibrer genom spinning från en mängd olika material som är lämpliga för cellodling, både bionedbrytbara och icke-bionedbrytbara, t ex; polykaprolakton (PCL) 27, poly-L-laktid-syra (PLLA) 28, poly (mjölk-sam-glykolsyra) (PLGA) 29, polysulfon (PSU) 12 och polyetereterketon (PEEK) 13. Var och en har olika egenskaper ennd bör väljas utifrån de behov av systemet. Kontrollera kompatibiliteten för sysselsatta fiber med etanol som används i steriliseringssteget. PLGA är känd för att mjuk med etanol kräver en alternativ behandling såsom antibiotika / antimykotika lösning 25.
Dimensionerna på glas moduler som används här valdes baserat på behoven hos den aktuella forskningen. Olika storlekar kan göras av varje ansedda glasblåsning företag. En övervägande i modulstorlek är antalet celler, som är kopplad till antalet fibrer i modulen och sannolika flödeshastigheter. Ju fler celler som finns i modulen den högre flödeshastigheterna kommer att behöva vara för att upprätthålla gynnsamma odlingsbetingelser vid utflödesänden av bioreaktorn. Detta kommer att nå en gräns som någon gång och några försök och misstag kan krävas med övervakning av medie villkor i modulen permeatet. Matematisk modellering kan ge några insikter de erforderliga modul dimensioner och flödeshastigheter 22.
Dimensionerna för den apparat som används här är utformat för att passa på en inkubator hylla. Längden på slangen dikteras av den längd som behövs för att nå mellan kontakterna samtidigt tillåter tillräckligt förflyttning av komponenter för att möjliggöra installation och drift. Om tidsförloppet Provtagning krävs, till exempel i övervakningen av medieförhållanden i modulen permeat sedan injektionsöppningar kan sättas till retentatet och permeatet linjer för att underlätta detta.
En förutsättning för ett cellodlingssystem är att hålla celler levande och i de flesta fall växer. Mot bakgrund av studier som visar en mer in vivo -liknande fenotyp i celler odlade i 3D odlingssystem verkar också viktigt att skapa en miljö som nära efterliknar in vivo miljö stött av cellerna. Denna sista punkt är ofta försummas i 2D cellodling till förmån för bekvämlighet denna kultur system erbjuder. Than HFB härmar in vivo kapillära nätverk genom att leverera näringsämnen till cellerna genom lumen av fibrer. De avfallsprodukter är också bort från systemet av den dynamiska flödet. Detta skapar en in vivo-liknande system för cellodling och en som nära efterliknar in vivo miljön ses av hepatocyter, vilket gör detta system ett bättre val jämfört med 2D vävnadsodlingsplast för odling dessa celler. Detta bekräftas av det faktum att cellerna utsöndrar 15 gånger mängden albumin, en viktig leverfunktion, i HFB odlingssystemet jämfört med de som odlas på 2D vävnadsodlingsplast.
Medan HFB systemet lämpar sig för de flesta om inte alla förankringsberoende celltyper, här är ett exempel för hepatocyter eftersom det finns ett verkligt behov av att kunna kultur funktionell, mer in vivo-liknande hepatocyter för användning inom läkemedelsutveckling av läkemedelsindustrin och i bioartificiella lever anordningar för extrakorpo stödlever felpatienter. Behovet av mer funktionella celler sträcker sig utanför dessa exempel, i synnerhet som området regenerativ medicin kommer in i en fas av translations arbete. Fördelarna med en mer in vivo -liknande odlingsmiljö bör inte förbises.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |