Kültürdeki hücrelerin işlevsel davranışı, 3 boyutlu bir kültür ortamında 16-21 benzeri in vivo olarak daha fazla kültür iyileştirilebilir. Bu el yazması, in vivo benzeri memeli doku kültürü için bir içi boş fiber biyoreaktör sisteminin kurulum ve çalışması açıklanmaktadır.
Tissue culture has been used for over 100 years to study cells and responses ex vivo. The convention of this technique is the growth of anchorage dependent cells on the 2-dimensional surface of tissue culture plastic. More recently, there is a growing body of data demonstrating more in vivo-like behaviors of cells grown in 3-dimensional culture systems. This manuscript describes in detail the set-up and operation of a hollow fiber bioreactor system for the in vivo-like culture of mammalian cells. The hollow fiber bioreactor system delivers media to the cells in a manner akin to the delivery of blood through the capillary networks in vivo. The system is designed to fit onto the shelf of a standard CO2 incubator and is simple enough to be set-up by any competent cell biologist with a good understanding of aseptic technique. The systems utility is demonstrated by culturing the hepatocarcinoma cell line HepG2/C3A for 7 days. Further to this and in line with other published reports on the functionality of cells grown in 3-dimensional culture systems the cells are shown to possess increased albumin production (an important hepatic function) when compared to standard 2-dimensional tissue culture.
Doku kültürü, 100 yıldan 1,2 kullanılmıştır hücrelerinin büyümesi ve / veya bakımı için kurulmuş bir tekniktir. Okuyan hücreler ve yanıtların ex vivo kolaylık kadar aksi imkansız değilse son derece zorlu olur deneyler izin avantajları ulaşan olan, örneğin, genetik olarak işlenmiş hücre çizgileri üretimi ve yüksek verimli tarama deneylerinde 3 raportör hücrelerinin kullanımı. Daha yakın bir zamanda, doku kültürü, in vitro modellerin üretimi için ve rejeneratif tıpta için doku mühendisliği alanı ile yol açmıştır. Bu uygulamalar sayesinde, dinamik 3 boyutlu (3D) kültür sistemlerinde ilgi önemli ölçüde büyüdü.
(3B, kültür alt-tabaka ve / veya yön dinamik akış giriş olarak tanımlanmıştır) 3B kültür yöntemleri daha iyi elde edilmesi için önemli bir in vivo hücre ortamında mimarisini, özetlemekdaha fizyolojik gibi işlev. hastalıklı ve hasarlı dokuyu tamir amacıyla nakli hücreleri, özü büyümek, farklılaştırmak ve yeteneği hasta yararına ve ticari bir fırsat için büyük bir potansiyele sahip bir çalışma alanıdır. Örneğin, otolog yanıkların tedavisi için keratinositler (4) ve inme tedavisi için hücre bazlı terapiler için kullanım kullanımı (5). Aynı şekilde, in vitro modeller için pazar tabakalı ilaç uygulamaları, ilaç keşfi kapsar. doku kültüründe Kongre bir doku kültür şişesine 2 boyutlu (2D) yüzeyinde yapışık veya ankoraj-bağımlı hücre tiplerinin büyümesi. Şu anda bir araştırma ortamında altın standart olarak kabul ederken, doku mühendisliği uygulamaları son faiz mevcut 2B doku kültürü ortamında hücresi üretimi 6 gerekli ölçek kadar yetersiz olduğu gerçeğini vurgulamıştır.
yapışık hücre tipleri, bir scaffol içinD, kimyasal bileşimi ve mekanik özellikleri açısından daha, son kullanıma bağlı olarak farklılık gösterecek gereklidir. Bazı sistemler olarak, yüksek iç fazlı emülsiyon çiftleşmiş oluşan oldukça gözenekli bir matris içeren, iyi levha eklemeler (7) ya da bilinen 2D kültürü teknikleri minimum uyum gerektiren electrospun elyaf (8) iskeleleri kullanır. Hücreler değişen kompozisyonlar mikrotaşıyıcıları üzerine ekilmiş ve besin ve sinyal molekülleri teslim karıştırılan tanklarda yetiştirilen ve dinamik de karma bir ortamda 9 ile atık ürünleri (toplu taşıma) uzağa taşımak olabilir. Bununla birlikte, bu sistemler, in vivo benzeri çevre sınırlıdır ve daha fazla iyileştirmeler ölçek büyütme maliyetleri açısından yapılabilir. Içi boş fiber biyoreaktörler (HFBs), genellikle lif lümen yoluyla teslim gözenekli elyaf ve medyanın dışında seribaşı hücreleri ile bir modül içerisine sabit liflerden oluşan bir 3D kültür sistemi olan (1 gözden0) (Şekil 1). HFBs liflerin istenirse tanımlanan kesme yan bağlantı noktaları üzerinden sıvı akışı yoluyla hücrelere uygulanacak izin verirken, kan damarları taklit ve dinamik medya teslimat ile ilgili kayma stresleri hücreleri koruyucu bir in vivo benzeri ortam sunuyoruz. Bu yüksek hücre yoğunlukları 11 ulaşılabilen üstün kitle taşıma ile çok yönlü bir kültür sistemi oluşturur. HFB sistemi ankoraj-bağımlı hücre tiplerinin bakımı için uygundur ve kültür Langerhans 12, fare β-TC-3 insülinom hücre çizgisi 12, primer insan hepatositleri 13, insan kemik sıçan pankreatik adacıkların dahil olmak üzere hücrelerin çeşitli kullanılmıştır kemik iliği tek çekirdekli hücreleri 14, Madin Darby köpek böbrek hücreleri (MDCK), 15 ve Caco-2 hücreleri 16 birkaç isim.
Kütle transferi ve ölçek-up sistem avantajlarının yanı sıra, hücreler 3D tis yetiştirilensue kültür sistemleri deneysel ipuçlarına morfolojisi ve in vivo benzeri daha daha duyarlı olma eğilimindedir. Örneğin 2B kültür 17 yetiştirilen hücreler ile karşılaştırıldığında ticari olarak temin edilebilir polistiren iskele yetiştirilen birincil hepatositler parasetamol toksisiteye daha kübik morfoloji, artan canlılığı, sitokrom P450 enzim aktivitesinin daha fazla indüksiyon ve artan bir hassasiyet göstermektedir sıçan. Hepatokarsinoma hücre çizgisi HepG2 serum albumin üretimi 18 artırmak ve 2D kültürlenmiş hücrelerde 19 ile karşılaştırıldığında metotreksat tepki benzeri in vivo olarak daha göstermek için gösterilmiştir, aynı iskele kullanılması. Primer insan hepatositler gecikmiş dediferansiyonunu yüksek sitokrom P450 aktivitesini gösterdi ve bir perfüzyon kültür sistemi 20 test 4/5 bileşiklerin açıklık arttı. İnsan sinir kök hücre, bir ticari olarak temin edilebilir polistiren iskele kültürlenmiş türetilen nöron ve glial yüksek (aksiyon potansiyeli) ve düşük frekanslı hem sergilediNCY (yerel alan potansiyeli) hiçbir nöronal aktivitenin ise spontan aktivite 2D kültürlü hücrelerde 21 tespit edildi. Caco-2 hücreleri, artan alkalin fosfataz, γ-glutamiltransferaz ve p-glikoprotein aktivitesinin ve protein 16 F-aktin ve zona-1 okludinler daha yüksek ifadesi ile ölçülen 2B kültür kıyasla HFB olarak geliştirilmiş farklılaşma gösterdi. 3D hücre kültürü gerekçe yayın sayısı son 10 yıl içinde (8 kat artış büyüyor olmasına rağmen avantajlara rağmen, 2B doku kültürü şişesi yüzeyinden dışındaki sistemlerde hücrelerin rutin kültür hala birçok laboratuvarda uygulanan değildir. Kaynak : '3D kültür') ile probed aracı Pubmed 'Yılın tarafından Sonuçlar'.
Bu el yazması memeli hücre kültürü için bir HFB sisteminin kurulum ve çalışma koşullarını açıklar ve hepatokarsinom hücre çizgisi HepG2 / C3A kültüre onun faydasını ortaya koyar. Bu yöntemin amacı, kültür içinde hücreleriYeterince basitlik koruyan bir daha in vivo benzeri kültür sistemi 3D kültür sistemlerine yeni olanlar için uygun hale getirilmesi. Uygulamada HFBs kullanılarak arkasındaki mantık, karaciğer modelini tahmin edilebilirliği HFB ortamında 22 içinde bir hepatik sinüzoid taklit etmek için teorik olarak mümkün olmasıdır geliştirmek amacına sahip olan, burada tarif eder. Bu, diğer kültür sistemleri ile, şu anda mümkün değildir.
Bu el yazması memeli hücre kültürü için bir delikli fiber biyoreaktör (HFB) sistem set-up ve çalışmasını açıklar ve onun yarar hepatosit hücre hattı HepG2 / C3A çoğalan gösterilmiştir. Sistem standart inkübatör ve set-up rafa sığacak şekilde tasarlanmıştır aseptik teknik aşina herhangi bir yetkili hücre biyolog tarafından yürütülecek kadar kolaydır.
Burada anlatılan araştırma sistemi kullanılan lifler, bir biyo-dejenere olmayan özel polimer kullanılarak (dönme) döküm faz geçiş Spin evde üretilmektedir. Örneğin, hücre kültürü için müsait, hem biyolojik olarak parçalanabilen ve biyolojik olarak ayrışabilir olmayan malzemelerin çeşitli iplik lifleri yapmak mümkündür; polikaprolakton (PCL) 27, poli-L-laktit asit (PLLA) 28, poli (laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) 29, polisülfon (PSU) 12 ve polietereterketon (PEEK) 13. Her biri farklı özelliklere sahip birnd sistemin ihtiyaçlarına göre seçilmelidir. sterilizasyon aşamasında kullanılan etanol ile çalışan fiber uyumluluğunu kontrol edin. PLGA etanol, antibiyotik / antimikotik solüsyon 25 gibi alternatif bir tedavi gerektiren ile plastikleştirmek bilinmektedir.
Burada kullanılan cam modüllerinin boyutları güncel araştırma ihtiyaçlarına göre seçildi. Farklı boyutlarda herhangi bir saygın bir cam üfleme şirket tarafından yapılabilir. Modül boyutunda bir göz modülünde elyaf ve olası akış hızı sayısına bağlı hücre sayısını ifade eder. daha fazla hücre yüksek akış oranları biyoreaktör çıkış ucunda olumlu kültür koşullarını korumak için olması gerekir modülünde bulunmaktadır. Bu modül permeate medya koşulların izlenmesi gerekebilir noktada ve bazı deneme yanılma olarak bir sınırı ulaşacaktır. Matematiksel modelleme gerekli modül DIMEN içine bazı anlayışlar sağlayabilirtiplerde ve akış oranları 22.
Burada kullanılan düzeneğin boyutu bir inkübatör raf üzerine uyacak şekilde tasarlanmıştır. boru uzunluğu da kurulum ve kullanım için izin vermek için parçaların kadar hareket etmeye olanak sağlar konektörler arasındaki ulaşmak için gerekli uzunluğu ile belirlenir. zamana bağlı örnekleme gerekirse, modülünde ortam koşullarının izlenmesi, örneğin daha sonra enjeksiyon noktaları retentatına eklenebilir geçirir ve bu kolaylaştırmak için hatları nüfuz.
bir hücre kültür sistemi için bir ön koşul canlı ve büyüyen bir çok durumda hücreler tutmaktır. 3D kültür sistemlerinde yetiştirilen hücrelerde fenotip benzeri vivo bir daha gösteren çalışmalar ışığında da yakından hücreler tarafından karşılaşılan in vivo ortamda taklit eden bir ortam sağlamak için önemli görünmektedir. Bu son nokta genellikle bu kültür sistemi sunan kolaylık lehine 2B hücre kültüründe ihmal edilmektedir. TO elyaf lümeni boyunca hücrelerine besin sağlayarak in vivo kılcal ağ şebekeleri olarak taklit HFB. atık ürünler, dinamik akış sistemi kaldırılır. Bu durum, bu hücrelerin kültürlenmesi için 2B doku kültürü plastik göre bu sistem, daha iyi bir seçim yapmak, hücre kültürü yakından hepatositler tarafından görülen in vivo ortamda taklit biri için bir in vivo benzeri sistemi oluşturur. Bu hücreler salgıladıkları gerçeği ile pekiştirilmiştir 15 kat 2B doku kültürü plastik yetiştirilen kıyasla HFB kültür sistemi içinde albumin miktarını önemli karaciğer fonksiyon.
HFB sistemi tümü olmasa bile çoğu ankoraj-bağımlı hücre tipleri için uygun olmakla birlikte, ilaç endüstrisi işlevsel kültür, daha fazla in vivo benzeri ilaç geliştirilmesinde kullanım için hepatositler edebilmek için gerçek bir ihtiyaç vardır, çünkü, örneğin, burada hepatositler için ve vücut dışı destek biyoyapay karaciğer cihazlardaKaraciğer yetmezliği hastalarının. daha işlevsel hücreler için ihtiyaç rejeneratif tıp alanında öteleme çalışma safhasına girer özellikle de bu örneklerden ötesine uzanır. Daha in vivo benzeri kültür ortamının avantajları göz ardı edilmemelidir.
The authors have nothing to disclose.
This work was funded by the National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of Animals in Research (NC3Rs) CRACK IT funding.
Glass HFB Module | Soham Scientific | — | Custom Item. (Section 2) |
Sigmacote® | Sigma-Aldrich | SL2 | (Section 2.1) |
Silicoset 151 | Intertronics | ACCSS151 | Silicone Glue. (Section 2.3) |
PTFE tape | Sigma-Aldrich | Z104388 | (Section 2.5) |
Reservoir bottle | Fisher | 11972619 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Q-series cap | Kinesis | 00932Q-3V | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 3.0mm ID | Kinesis | 008NB30-KD5L | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Fitting Nut | Kinesis | U-350 | PTFE the screw threads of the adapters and fitting nut. Attach to the Q-series cap. Attach an 8.5cm section of the supplied PTFE tubing under the 1mm adapter and a 4cm section under the 3mm adapter. (Section 3.2.1) |
Neoprene tubing | Fisher | 10366344 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
HEPA-vent | Fisher | 11374634 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
Y-connector, barbed | Cole Parmer | OU-06295-10 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S14 Silicone tubing | Cole Parmer | WZ-96410-14 | Attach the Hepa filter to 6cm of neoprene tubing and attach this to the 'fitting nut'. Attach a 2x 30mm sections of L/S14 tubing to the top two barbs of the Y-connector and a 3cm section of L/S16 tubing to the bottom. Attach this to the barb of the 3mm ID adapter. (Section 3.2.1) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 80cm to connect the 1.0mm barbed adapter on the Q-series cap to the pump tubing = Feed tube. (Section 3.2.1) |
WM 205U/CA pump | Fisher | 1248-6300 | (Section 3.2.1) |
WM pump tubing, PVC, blue-orange, 0.25mm bore | Fisher | 12416310 | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Male, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD5L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Adatpter, Female, 1.0mm ID | Kinesis | 008NB10-KD2L | PTFE the screw thred of the male adapter and connect the female adapter. Work the pump tubing over one of the barbs. Repeat this set-up at the other end of the tubing. (Section 3.2.1) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Side port end caps. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 40mm section to connect the pump tubing to a module connector. (Section 3.2.2) |
L/S16 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-16 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
Barbed reducer 1/8"x1/16" | Cole Parmer | 30616-43 | 3x 30mm of L/S16 fitted to 3x reducers = module connectors. (Section 3.2.2) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 55cm section to connect the retentate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
L/S13 Silicone tubing | Cole Parmer | OU-96410-13 | 45cm section to connect the permeate to the L/S14 of the Y-connector on the Q-series cap. (Section 3.2.4) |
Straight barbed union | Cole Parmer | WZ-30612-43 | Attach to the end of the L/S13 that will connect with the L/S14 of the Y-connector. (Section 3.2.4) |
Clamp | VWR | 229-0609 | (Section 3.4.2) |
4mm Silicone tubing | Fisher | FB68858 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
Cable tie | Fisher | 12326377 | Fold over a 40mm section of tubing and secure with a cable tie = Module end cap. (Section 4.3) |
MACSmix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | An adaptation may be required to attach the modules. (Section 4.4) |
Leur Injection port | Thistle Scientific | IB-10820 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
Female luer cap | Cole Parmer | WZ-45508-64 | Attach the end cap to the injection port. (Section 4.5) |
L-lactic acid kit | Megazyme | K-LATE | (Section 5) |
D-glucose kit | Megazyme | K-GLUC | (Section 5) |
Scalpel / micro knife | InterFocus | 10315-12 | (Section 6.2) |
Albumin ELISA | Bethyl Labs | E80-129 | (Section 7.4.3) |