Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Licht-katalysierte Erzeugung von Wasserstoffperoxid - einen Cofaktor für oxidative Umwandlungen.
Abstract
Oxidoreduktasen gehören zu den am häufigsten angewandten industriellen Enzymen. Dennoch müssen sie externe Elektronen, deren Versorgung ist oft teuer und schwierig. Recycling der Elektronendonoren NADH oder NADPH erfordert die Verwendung von zusätzlichen Enzymen und Opfersubstraten. Interessanterweise akzeptieren mehrere Oxidoreduktasen Wasserstoffperoxid als Elektronendonor. Während kostengünstig sind, reduziert dieses Reagenz oft die Stabilität von Enzymen. Eine Lösung dieses Problems ist die in situ Erzeugung des Cofaktors. Die kontinuierliche Zufuhr des Cofaktors bei niedriger Konzentration treibt die Reaktion ohne die Enzymstabilität zu beeinträchtigen. Dieses Papier zeigt ein Verfahren für die Licht-katalysierten in situ - Erzeugung von Wasserstoffperoxid mit dem Beispiel des Häm-abhängigen Fettsäure Decarboxylase OLET JE. Die Fettsäure-Decarboxylase OLET JE wurde aufgrund seiner einzigartigen Fähigkeit , entdeckt zu langkettigen 1-Alkene aus Fettsäuren produzieren, eine bisher unbekannte enzymatischeReaktion. 1-Alkene sind weit Additive für Weichmacher und Gleitmittel verwendet. OLET JE hat sich gezeigt , Elektronen von Wasserstoffperoxid zum oxidativen Decarboxylierung zu akzeptieren. Während die Zugabe von Wasserstoffperoxid schädigt das Enzym und führt zu geringen Ausbeuten, umgeht in situ - Erzeugung des Cofaktors dieses Problem. Das photobiocatalytic System zeigt deutliche Vorteile in Bezug auf die Enzymaktivität und Ausbeute, was zu einer einfachen und effizienten System für die Fettsäure Decarboxylierung.
Introduction
Der Klimawandel und die absehbare Erschöpfung der erneuerbaren Ressourcen stellt eine ernsthafte Bedrohung für unsere Gesellschaft. In diesem Zusammenhang stellt der Enzymkatalyse eine noch nicht voll ausgeschöpft Potenzial für die Entwicklung nachhaltiger und "grüner" Chemie 1. Oxidoreduktasen haben die Fähigkeit , die Einführung und Modifizierung von funktionellen Gruppen unter milden Reaktionsbedingungen zu katalysieren und 2 zu den wichtigsten Biokatalysatoren gehören. Die meisten redox Transformationen erfordern die Zufuhr von externer von Cofaktoren wie NAD (P) H. Verfahren zur Cofaktor-Regenerierung wurden in der industriellen Maßstab angewendet. Allerdings führen sie immer noch in hohen Prozesskosten, die ihre Anwendung vor allem auf hochwertige Produkte begrenzt. Interessanterweise akzeptieren mehrere Peroxidasen 3,4 und P450 Monooxygenasen 5 Elektronen von Wasserstoffperoxid über den so genannten Peroxid - Shunt. Während H 2 O 2 eine günstige Co-Reagenz ist, ist es angeblich harmful für viele Enzyme. Eine stetige in - situ - Bildung von niedrigen Konzentrationen von Wasserstoffperoxid ist eine praktikable Vorgehensweise, die Reaktion anzutreiben, ohne die Betriebsstabilität des Enzyms zu beeinträchtigen.
Abbildung 1. Versuchsaufbau der photobiocatalytic Decarboxylierung von Fettsäuren durch OLET JE. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Die Verwendung von Licht als Energiequelle für die chemische und biologische Prozesse erhalten hat zunehmende Aufmerksamkeit in den letzten Jahren 6. Lichtgetriebene Erzeugung von Wasserstoffperoxid wurde als einfache und robuste Methode entstanden zu Wasserstoffperoxid für Redox - Transformationen (Abbildung 1) liefern. Ein photokatalytischer wie Flavin-Adenin-mononucleotide (FMN) ermöglicht die Reduktion von molekularem Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid, das dann als Cofaktor für die enzymatische Oxyfunktionalisierung Reaktion verwendet wird. Mögliche Elektronendonoren sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), Ascorbat oder die preiswerte Formiat. Das Verfahren ist allgemein anwendbar für die H 2 O 2 -abhängige Enzyme, einschließlich Peroxidasen 3,4 und P450 Monooxygenasen 5.
Wir haben untersucht , kürzlich die Anwendung einer neuen bakteriellen Decarboxylase 7 für die Transformation von natürlichen Fetten in Olefine 8. Dies wäre eine nachhaltige Weg zur Synthese von weit verbreiteten Plattform Chemikalien aus einem bio-basierte Quelle sein. Die Decarboxylase OLET JE aus dem gram-positiven Bakterium Jeotgalicoccus sp. katalysiert die oxidative Decarboxylierung von Fettsäuren und bildet 1-Alkenen als Produkte. OLET JE ist eng mit bakteriellen P450 Monooxygenasen bezogen und muss Elektronen from Wasserstoffperoxid für die Reaktion.
Leider führte die Zugabe von H 2 O 2 zu einer Lösung von Substrat und Enzym in geringen Umsätze und eine schlechte Reproduzierbarkeit der Ergebnisse, vermutlich aufgrund einer schädlichen Wirkung von Wasserstoffperoxid auf die Stabilität von OLET JE. Die Erzeugung eines Fusionsproteins mit der NADPH-Reduktase RhFred machte eine NADPH-abhängige Decarboxylierung möglich. 9 Dennoch ist der hohe Preis von NADPH und der derzeit begrenzten Möglichkeiten für eine kosteneffiziente Regeneration veranlasste uns , billiger Elektronendonoren zu untersuchen. Inspiriert durch die Ähnlichkeit der OLET JE mit P450 Monooxygenasen, haben wir das Licht katalysierte Erzeugung von H 2 O 2. Wir waren sehr zufrieden hohe Umsätze zu erhalten (bis zu> 95%) unter Verwendung von zellfreien Extrakten oder gereinigten Enzymlösungen.
Am Beispiel der Fettsäure Decarboxylierung präsentieren wir ein allgemeines Protokoll für die lichtgetriebene enzymTransformationen atic redox Verwendung FMN als Photokatalysator und Wasserstoffperoxid als Cofaktor. Die vorgestellten Verfahren umfassen die Herstellung des Enzyms in einer rekombinanten Zelle von E. coli, Reinigung des Enzyms, die Anwendung für die Synthese von 1-Alkenen und die Analyse der Reaktionsprodukte.
Protocol
Achtung: Bitte konsultieren Sie alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Einige der Chemikalien in diesen Synthesen verwendet werden, sind akut toxisch und krebserregend. Alle Schritte schädlichen organischen Lösungsmitteln beteiligt, insbesondere die Extraktion der Reaktionsprodukte und die Derivatisierung von Fettsäuren müssen mit persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe unter einem Abzug durchgeführt werden ). Alle Transaktionen im Zusammenhang mit gentechnisch veränderten Organismen in dieser Arbeit erfordern Anlagen, die für den Umgang mit gentechnisch veränderten Organismen der Sicherheitsstufe S1 zugelassen sind.
1. Expression des rekombinanten Decarboxylase OLET JE in E. coli
- Vorbereitung des Produktionsstammes
- Vorbereiten eines synthetischen Gens von OLET JE aus Jeotgalicoccus und kloniert in den Expressionsvektor pASK-IBA37plus wie beschrieben. 8 ANMERKUNG: Um den Abbau von Fettsäuren durch Enzyme , die aus den bakteriellen Stoffwechsel vermeiden, E. coli - Stamm JW5020 von der Keio - Sammlung mit einer dysfunktionalen Weg für den Abbau Fettsäure verwendet wurde.
- Der Anbau und die Induktion der Enzymexpression
- Bereiten Sie eine Vorkultur von der E. Impfen coli JW5020 OLET Mutante von einer LB-Platte (mit 100 ug ml -1 Ampicillin) in zwei 3 ml LB-Medium in Reagenzgläser. Pipette Ampicillin (100 ug ml - 1) aus einer Stammlösung in das Medium für die Selektion und inkubieren bei 37 ° C für 15 Stunden in einem Schüttelinkubator bei 180 UpM.
- 2 ml der Vorkulturen auf zwei 200 ml LB-Medium, enthaltend Ampicillin (100 ug ml - 1), in 1 l Schüttelkolben. Inkubation schreitet bei 37 ° C und 180 rpm.
- Überwachen Sie die Änderung in der OD 600nm nach der Inokulation. Wenn die OD 600 erreicht einen Wert zwischen 0,6 eind 0,8 induzieren die Expression von Tetracyclin Zugabe (0,2 ug ml -1). Inkubieren der Kulturen 15 Stunden lang bei 20 ° C und 180 rpm.
HINWEIS: Da OLET JE einen Häm - Cofaktor enthält, Zugabe von δ-Aminolävulinsäure (0,5 mM) vor der Induktion benötigt wird, die Kultur mit einem Vorläufer für die Cofaktor - Synthese bereitzustellen.
- Zelllyse
- Führen Sie die folgenden Schritte auf dem Eis. Übertragen Sie die Kulturen durch Abgießen oder Pipettieren in Zentrifugenröhrchen und verwenden Sie eine Skala gleichmäßige Verteilung zu gewährleisten. Zentrifugation der Kulturen für 20 min bei 12.000 × g bei 4 ° C.
- Sorgfältig den Überstand verworfen und die Pellets in 50 ml Puffer (Tris 50 mM, NaCl 200 mM, pH 7,5) durch Pipettieren resuspendieren und die Suspension in einem konischen Zentrifugenröhrchen übertragen.
- Nach Zentrifugation für 15 min bei 4.000 × g bei 4 ° C Überstand verwerfen, jedes Pellet in 3 ml Puffer durch Pipettieren resuspendieren.
- Führen Sie die Zelllyse durch sokation, die Lösungen auf Eis (drei Zyklen x 30 sec) eine 1 Minute Pause zwischen den Zyklen zu verlassen. Zentrifuge die Lösungen für 20 min bei 15.000 × g bei 4 ° C die Zelltrümmer zu entfernen, und der Überstand in ein konisches Zentrifugenröhrchen übertragen, ohne das Pellet durch Pipettieren zu stören. Entsorgen Sie das Pellet.
HINWEIS: Ein Lösungsmittelanteil wird direkt für die Biokatalyse verwendet werden, nachdem kleine Moleküle entfernt werden. Die zweite Fraktion wird zur Reinigung des His-tagged OLET JE verwendet werden.
- Entfernung von kleinen Molekülen von Zellextrakten
- Vor der Verwendung der Rohextrakt in Biokatalyse kleine Moleküle zu entfernen, die mit Wasserstoffperoxid-Bildung oder Elektronenübertragung stören könnten durch Pipettieren von 3 ml zellfreien Extrakts in ein Zentrifugenfiltereinheit mit einer 10 kDa Membran und Zentrifuge bei 4000 × g bei 4 ° C. Resuspendieren verbleibende Protein in 3 ml Tris-HCl-Puffer.
- Reinigung von OLET
- Anwenden 3 ml der zweiten Zellextrakt His Pur Ni-NTA Spin-Säulen, die vorher mit Äquilibrierungspuffer (20 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) equilibriert wurden.
- Verschließen Sie die Spalten mit den unteren Stopfen und oberen Schraubverschlüsse und schütteln Sie sie leicht, bis das Harz verteilt ist ebenso mit dem zellfreien Extrakt. Inkubiere die geladenen Spalten für 30 min in einem Überkopfschüttler bei 4 ° C.
- Waschen der Säulen mit 1 ml Waschpuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, 20 mM Imidazol, pH 7,4) von bei 700 × g für 2 min zentrifugiert. Zweimal wiederholen Sie diesen Schritt.
- Legen Sie die Spalten in eine frische konische Zentrifugenröhrchen und 1 ml Elutionspuffer (Tris 20 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, pH 7,4) OLET JE. Zentrifuge bei 700 xg für 2 Minuten und wiederholen Sie diesen Schritt zweimal.
HINWEIS: Imidazole an Nickel binden und somit OLET JE aus der Säule zu entfernen. - Übertragen Sie die Elution in ein Zentrifugenfiltereinheit (10 kDa membran) und Zentrifuge bei 4000 × g bei 4 ° C Imidazol zu entfernen.
- Überprüfen Sie die Reinheit des Enzyms durch eine SDS-PAGE (15%). 9 Mix 3 ul der Elution mit einem SDS-Puffer (Endkonzentration 1x) und Inkubieren der Lösung bei 95 ° C für 5 Minuten zur Denaturierung. Anschließend gelten die Gesamtmenge auf einem SDS-PAGE. Führen Sie das Gel bei 35 mA Kommerzielle Protein-Standard. Erkennt das Protein bei 50 kDa.
- die Proteinkonzentration verwenden, um einen kommerziell erhältlichen BSA-Kit zu bestimmen. Pipettieren von 50 & mgr; l des verdünnten Proteinproben (1: 100, 1: 200, 1: 500) und BSA - Standard (0, 20, 30, 40,50, 60, 80, 100 mg ml -1) in einer 96-Well - Platte . In 200 ul Bradford-Reagenz, messen die Absorption bei 595 nm nach 15 Minuten mit einem Fluorimeter und berechnen die Konzentrationen der Standardkurve.
2. Licht-katalysierte Biotransformation
- Biokatalytischen Reaktionen ohne Wasserstoffperoxid zusätzlich
- Bereiten Sie eine 10 ml Stammlösung von 10 mM Stearinsäure (M r 284,5 g mol -1) durch Zugabe von 10% (v / v) Tergitol und 0,0284 g Stearinsäure zu destilliertem Wasser. Die Lösung wird in einer Heizkammer auf 60 ° C bis die Fettsäure vollständig gelöst ist.
- Biokatalyse und Probenahme
- Bereiten zwei 2 ml Reaktionsmischungen enthaltend 50 mM EDTA, 0,01 mM FMN, 0,5 mM Stearinsäure in Tris-HCl-Puffer. Fügen Sie einen magnetischen Rührstab für eine ausreichende Sauerstoffversorgung und legen Sie die Glasrohre in einem Wasserbad erhitzt auf 25 ° C.
- In 200 ug ml -1 von gereinigtem Enzym oder 10% (v / v) zellfreien Extrakt zu jedem der Reaktionsgemische und beleuchten sie mit einem klaren Glas Glühbirne (120 W) in 15 cm Abstand der Reaktionsrohre.
- Nehmen Sie 200 ul-Proben zu bestimmten Zeitpunkten (0, 10, 30, 60 und 120 min und über Nacht) Stoppen der Reaktion mit 20 & mgr; l 37% HCl. In 5 ul Myristinsäure (10 mM Lager, solution) als interner Standard.
- Analyse der Reaktionsprodukte
- Für die Extraktion 500 ul Ethylacetat zu den Proben zweimal hinzufügen, kehren die Rohre und Zentrifuge für 1 min bei 13.000 x g.
- Nehmen Sie 400 ul des Überstandes und lassen Sie das Lösungsmittel vollständig verdampfen.
- Derivatisierung der Carbonsäuren in trimethylsilylcarboxylic Säure durch Zugabe von 200 & mgr; l N - Methyl - N - (trimethylsilyl) acetamid Trifluor (MSTFA). Inkubieren der Lösung bei 60 ° C für 30 min, um Hydroxylgruppen zu konvertieren Ethern Trimethylsilyl.
- Bestimmung der Umwandlung durch GC / FID
HINWEIS: Bestimmen der Bildung von 1-Heptadecen (RT: 8,34 min), α- und β-Hydroxystearinsäure (RT: 12,05 und 12,1 min) und die Abnahme des Substrats (RT: 11,15 min) unter Verwendung von GC / FID.- Stellen Sie das Temperaturprofil unter Set die Einspritztemperatur auf 340 ° C beschrieben. Haltendie anfängliche Ofentemperatur bei 90 ° C für 3,5 min und anschließend mit 45 ° C min -1 erhöhen. Bei 220 ° C, halten Sie die Temperatur für 2 min. Nach einer wiederholten Anstieg von 45 ° C min -1, für 2 min die Temperatur auf 280 ° C zu halten und dann mit 60 ° C min -1 erhöht.
HINWEIS: Die maximale Temperatur von 330 ° C für 1,44 min gehalten. - Injizieren 4 & mgr; l der Probe, mit einem Teilungsverhältnis von 5 schnelle Verflüchtigung und homogene Vermischung mit dem Trägergas Helium zu erhalten.
HINWEIS: In Abhängigkeit von der das Substrat und Produkte geben Sie die Gasphase steigender Temperatur. Die Substanzen werden durch das GC / FID-Detektor detektiert, nachdem die Säule an bestimmten Retentionszeiten vorbei und werden als Spitzen auf dem Bildschirm angezeigt. Beachten Sie die Spitzenbildung auf dem Monitor. - Berechnen der Konzentration des gebildeten Produkts mit der folgenden Formel:
HINWEIS: Der Kalibrierungsfaktor durch Berechnung der Standardkurve, die speziell für diese Spalte für jedes Substrat und Produkt aus bekannten Mengen der derivatisierten Substanzen und ihrer entsprechenden Peakfläche bestimmt wurde.
- Stellen Sie das Temperaturprofil unter Set die Einspritztemperatur auf 340 ° C beschrieben. Haltendie anfängliche Ofentemperatur bei 90 ° C für 3,5 min und anschließend mit 45 ° C min -1 erhöhen. Bei 220 ° C, halten Sie die Temperatur für 2 min. Nach einer wiederholten Anstieg von 45 ° C min -1, für 2 min die Temperatur auf 280 ° C zu halten und dann mit 60 ° C min -1 erhöht.
- Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS.
- Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS. Stellen Sie das Temperaturprofil. Stellen Sie die Einspritztemperatur auf 250 ° C. Halten Sie die Ofentemperatur auf 100 ° C für 5 min und anschließend mit 20 ° C min -1 erhöhen.
HINWEIS: Die maximale Temperatur wird für 7,5 min gehalten. - Stellen Sie das Massenspektrometer Detektortemperatur auf 250 ° C und Scan bei 50 bis 500 m / z in Elektronenstoßmodus.
HINWEIS: Elektronenstoß-Ionisation entfernt ein einzelnes Elektron, was zur Bildung eines Radikalkations, die für die Massenanalyse weitergeleitet Vorwärts wird. Aufgrund der hohen intramolar Energie kovalente Bindungen innerhalb derMolekül Bruchfragmente niedriger m / z zu schaffen. Diese Fragmente bilden einen Fingerabdruck spezifisch für eine Substanz ist. - Injizieren 1 & mgr; l der Probe. Erfassen 1-Heptadecen nach 11,4 min Retentionszeit durch den entsprechenden Fingerabdruck (Abbildung 2).
- Identifizieren Olefin und β-Hydroxysäure Spitzen durch GC / MS. Stellen Sie das Temperaturprofil. Stellen Sie die Einspritztemperatur auf 250 ° C. Halten Sie die Ofentemperatur auf 100 ° C für 5 min und anschließend mit 20 ° C min -1 erhöhen.
HINWEIS: Der Kalibrierungsfaktor durch Berechnung der Standardkurve, die speziell für diese Spalte für jedes Substrat und Produkt aus bekannten Mengen der derivatisierten Substanzen und ihrer entsprechenden Peakfläche bestimmt wurde. Representative Results
Während die Zugabe von Wasserstoffperoxid zu dem Reaktionsgemisch in niedrigen Umwandlungen führte zu moderieren (<10%), erhöht in situ Erzeugung von Wasserstoffperoxid die Umwandlung bis zu 80% Umsatz. Die Analyse durch GC / MS zeigt die Bildung von Olefinen aus Fettsäuren (Abbildung 2).
Abbildung 2 (A) Temperaturprofil für die GC / MS - Messungen. (B) Fingerabdruck des 1-Heptadecen eluierenden nach 11,4 min. (C) Charakteristische sekundären C n H 2n-1 Fragment - Ionen von Terminal exemplarischen Olefinen für 1-Heptadecen gezeigt. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
E. coli. Eine gereinigte Enzymlösung zeigte eine klare Korrelation zwischen Enzymkonzentration und Umwandlung. Eine Erhöhung der Konzentration des lichtsammelnden Molekül FMN führen zu höheren Umsätzen. Jedoch die Erhöhung der Konzentration von mehr als 10 mM nicht weiter um die Reaktionen zu beschleunigen, was darauf hinweist, dass die Menge an Wasserstoffperoxid ausreichend vorhanden ist und nicht mehr der begrenzende Faktor.
Zusätzlich zu der Decarboxylierung von Fettsäuren, OLET JE katalysiert auch eine Hydroxylierung in β-Position. Bei der Umwandlung von Stearinsäure, ist die Decarboxylierung etwa dreimal schneller als die Hydroxylierung. In einem typischen Experiment wurde eine Lösung von 0,5 mM Stearinsäure und 10 & mgr; M FMN, 99% des Substrats unter Verwendung wurden zu einer Mischung aus 1-Heptadecen umgewandelt und 2-Hydroxystearinsäure mit einem Verhältnis von8 1 (3): 3.3. Eine Untersuchung des Substratspektrums der Biokatalyse lichtgetriebenen zeigte , dass Fettsäuren mit längeren Acylketten, OLET JE bevorzugt die Decarboxylierung katalysiert, während die relative Menge an Hydroxyl-Fettsäuren in der Produktmischung mit kürzerer Kettenlänge erhöht. Fettsäuren kürzer als Myristinsäure (C14) hat unterzogen werden nicht Decarboxylierung.
Abbildung 3. Die gaschromatographische Analyse OLET JE -vermittelten Decarboxylierung von Stearinsäure (11.15 min) in 1-Heptadecen (8,4 min), α-Hydroxystearinsäure (12,04 min) β-Hydroxystearinsäure (12,1 min). Die Veränderung der Peakflächen von Proben über einen zeitlichen Verlauf von 2 h genommen wird angezeigt. Bitte klicken Sie hier , um die viewa größere Version dieser Figur.
Überraschenderweise zeigen die erfindungsgemäßen ungesättigten Säuren Ölsäure (C18: 1D9 cis) und Linolsäure (C18: 2d9d12) wurden nicht als Substrate akzeptiert, was darauf hinweist , dass die verdrillten Konfiguration cis - Doppelbindungen nicht in einem produktiven Bindungsmodus in dem Enzym untergebracht werden. Zugabe von Ölsäure (10%) verhindert auch die Umwandlung von Stearinsäure. Interessanterweise Stearinsäure: wurde (C18 1D9 trans) durch OLET JE umgewandelt, doch mit etwas geringeren Aktivität dann Stearinsäure.
Discussion
Die lichtgetriebene Erzeugung von Wasserstoffperoxid kann für eine Reihe Redox - Transformationen angewendet werden, einschließlich peroxygenases 3, chloroperoxidases 10 und P450 Monooxygenasen 5. Es ist eine einfache und praktikable Ansatz. Auf lange Sicht, öffnet sich die Verwendung von sichtbarem Licht, die Perspektive auf Sonnenlicht für chemische Umwandlungen zu verwenden, die eine nachhaltige Alternative für energiereiche Reaktionen ist.
Das Verfahren ist anwendbar mit gereinigtem Enzym oder mit zellfreien Extrakt. Während letztere weniger Kosten und Arbeit erfordert, sollte es, dass kleine Moleküle in dem Rohextrakt zu beachten, mit dem Licht katalysierte Umsetzung stören können. Eine praktikable Ansatz ist es, diese kleine Bauteile mit einem Mikro (dh durch Zentrifugation in einer Filterzentrifuge Einheit oder durch Dialyse) zu entfernen. Die Konzentration des lichtsammelnden Molekül FMN bestimmt die Konzentration des Wasserstoffperoxids. Je nach affinity der Oxidoreduktase ist diese Konzentration entscheidend für die Enzymaktivität. Ein weiterer wichtiger Faktor ist die Konzentration des Elektronendonors EDTA. Der wichtigste Parameter ist jedoch die Betriebsstabilität und Aktivität des Enzyms.
Die Olefinierung von Fettsäuren ist eine elegante Reaktion zur Umwandlung von biobasiertem Fettsäuren in Olefine, die für die chemische Industrie zu den wichtigsten Rohstoffe gehören. Die lichtgetriebene biokatalytische Decarboxylierung kann bei Raumtemperatur durchgeführt werden und bei neutralem pH-Wert, die klare Vorteile in Bezug auf Nachhaltigkeit bietet.
Unsere Ergebnisse zeigen , dass die in situ Erzeugung von Wasserstoffperoxid eine Strategie ist es, den Cofaktor ohne Beeinträchtigung der Enzymstabilität, was zu einer hohen Umwandlung zu liefern. Gegenwärtige Verfahren für Cofactorregenerierung landwirtschaftliche Erzeugnisse oder Benzin-basierten Chemikalien. Lichtgetriebene Reaktionen sind, sich als erneuerbare Alternative. ZukunftForschung wird für die Substitution des Opferreagenz EDTA durch billigere Moleküle und zur Verringerung der Menge der lichtsammelnden Molekül FMN Methoden gewidmet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chemicals | |||
| Ampicillin | Sigma Aldrich | 69-52-3 | |
| Bradford reagent | Roth | K015.1 | |
| BSA | Sigma Aldrich | 90604-29-8 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 67-68-5 | |
| Ethyl acetate | Fisher Chemical | 141-78-6 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Roth | 8043.1 | |
| Riboflavin 5-monophosphate sodium salt hydrate | Sigma Aldrich | 130-40-5 | |
| Hydrochlorid acid 37% | Sigma Aldrich | 7647-01-0 | |
| Hydrogen peroxide 30% | Sigma Aldrich | 7722-84-1 | |
| δ-Amino levulinic acid | Sigma Aldrich | 5451-09-2 | |
| N-Methyl-N-(Trimethylsilyl)trifluoro acetamide (MSTFA) | Sigma Aldrich | 24589-78-4 | |
| Myristic acid >99% | Sigma Aldrich | 208-875-2 | |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 288-32-4 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | 7647-14-5 | |
| Stearic acid >99% | Sigma Aldrich | 57-11-4 | |
| Tetracycline | Sigma Aldrich | 60-54-8 | |
| Tergitol | Sigma Aldrich | MFCD01779855 | |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethan | Sigma Aldrich | 77-86-1 | |
| Device | |||
| Incubator shaker | G-25CK | New Brunswick Scientific | |
| Ecotron | Infors HT | ||
| Centrifugation | Labofuge 400R | Heraeus | |
| RC 5B Plus | Sorvall | ||
| Fresco 17 | Thermo Scientific | ||
| Centrifugation rotors | SS34 | Sorvall | |
| SLA | Sorvall | ||
| Clean bench | Envirco | Ceag Schirp Reinraum technik | |
| Column GC-FID | CP-Sil 5CB (30 m x 0.25 mm x 0.25 µm) | Agilent Technologies | |
| Column GC-MS | FactorFour Capillary Coloumn (VF-5 ms + 5 m EZ Guard) | Varian | |
| GC-FID | GC-2010 plus | Shimadzu | |
| GC-MS | IST-40 | Varian | |
| Magnetic stirrer | RCT classic | IKA | |
| pH meter | SevenEasy | Mettler toledo | |
| Sonicator | Branson Sonifier 250 | Branson | |
| Spectral photometer | FLUOstar Omega | BMG Labtech | |
| Equipment | |||
| Affinity chromatography column | His Pur Ni-NTA spin column | Thermo Scientific | |
| Centricon | Vivaspin turbo 15 | VWR International | |
| Microtiter plates | 96 Well Multiply®PCR Plates | Sarstedt |
References
- Kourist, R., Domìnguez de Marìa, P., Miyamoto, K. Biocatalytic strategies for the asymmetric synthesis of profens - recent trends and developments. Green Chem. , 2607-2618 (2011).
- Holtmann, D., Fraaije, M. W., Arends, I. W., Opperman, D. J., Hollmann, F. The taming of oxygen: biocatalytic oxyfunctionalisations. Chemical Comm. 50, 13180-13200 (2014).
- Churakova, E., et al. Specific photobiocatalytic oxyfunctionalization reactions. Ang. Chem. In. Ed. 123, 10904-10907 (2011).
- Hollmann, F., Arends, I., Buehler, K. Biocatalytic Redox Reactions for Organic Synthesis: Nonconventional Regeneration Methods. ChemCatChem. 2, 762-782 (2010).
- Girhard, M., Kunigk, E., Tihovsky, S., Shumyantseva, V. V., Urlacher, V. B. Light-driven biocatalysis with cytochrome P450 peroxygenases. Biotechnol. Appl. Biochem. 60, 111-118 (2013).
- Bartsch, M., et al. Photosynthetic production of enantioselective biocatalysts. Microb. Cell. Fact. 14, 53 (2015).
- Rude, M. A., et al. Terminal olefin (1-alkene) biosynthesis by a novel P450 fatty acid decarboxylase from Jeotgalicoccus species. Appl. Environ. Microbiol. 77, 1718-1727 (2011).
- Zachos, I., et al. Photobiocatalytic decarboxylation for olefin synthesis. Chem. Comm. 51, 1918-1921 (2015).
- Liu, Y., et al. Hydrogen peroxide-independent production of α-alkenes by OleTJE P450 fatty acid decarboxylase. Biotechnol. Biofuels. 7, 28 (2014).
- Perez, D. I., Grau, M. M., Arends, I. W., Hollmann, F. Visible light-driven and chloroperoxidase-catalyzed oxygenation reactions. Chem. Comm. 40 (44), 6848-6850 (2009).
